转染肝癌总RNA的树突状细胞疫苗对肝癌的抑制作用及其机制

目的探讨转染肝癌细胞总RNA转染的树突状细胞(DC)疫苗抑制肝癌作用及其机制。方法采用粒/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素(IL)-4联合培养6 d成小鼠骨髓来源不成熟DC(iDC),质脂体转染肝癌细胞系Hepa1-6 RNA入iDC,用LPS刺激后成为Hepal-6 RNA/DC疫苗,对照组为iDC组、LPS/DC组Saline组,以每只2×10~6个细胞腹腔注射免疫小鼠每周1次共3次,然后接种5×10~5 Hepal-6细胞,观察肿瘤生长情况、特异性CTL活性的测定以及抗体阻断实验。结果实验组Hepal-6 RNA/DC组肿瘤在第8周为(8．5±3．6)mm,而iDC组、LPS/ DC组、Saline对照组分别为(36．6±3．6)、(31．3±4．7)、(32．2±4．0)mm,与实验组比较差异均有统计学意义(P＜0．05)。实验组脾细胞对Hepal-6细胞有特异性杀伤效应,而对肺癌LLC细胞无杀伤活性。所诱导的抗肿瘤效应细胞包括CD~(8+)、CD~(4+)T淋巴细胞。结论肝癌细胞的总RNA转染的DC肿瘤疫苗能诱导CD~(8+)、CD~(4+)T细胞免疫,是较有临床应用前景的肝癌免疫治疗方法。     

磁转染MUC1/Y基因入树突状细胞抗膀胱肿瘤的免疫效应研究

目的：研究体外磁转染人MUC1/Y基因至人树突状细胞（DC）的可行性,以及在体外诱导特异忡抗MUC1／Y膀胱癌的免疫效应。方法：以葡聚糖磁性纳米颗粒（DMN）作为载体,在多聚赖氨酸（PLL）的辅助下,通过静电作用结合MUC1／Y基因的真核表达载体pEGFP-C1—MUC1／Y．在铜-硼-锡磁块的固定磁场作用下转染至人DC中,荧光显做镜下以及流式细胞仪观察其转染效率;再将这种转基因DC与自体T细胞共培养,观察其致敏的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对MUC1／Y特异性抗膀胱癌（膀胱肿瘤BIU87细胞系）的杀伤活性,即分别用LDH释放法检测CTL杀伤活性和透射电镜观察CTL诱导靶细胞凋亡情况：ELISA法测定基冈修饰后的DC刺激自体T细胞分泌IFN-γ了的能力。结果：pEGFP-C1／-MUC1／Y转染效率为15％左右,荧光显微镜下可观察到明显绿色荧光蛋白的表达;与自体T细胞混合培养后能诱导出湿著的MUC1/Y特异性的CTL对BIU87细胞的杀伤实验表明T-DC-MUC1的杀伤活性约为52％,显著高于埘照组T-DC诱导的CTL;住透射电镜下也可以清楚的观察到部分BIU87膀胱肿瘤细胞出现了细胞核核仁消失,染色质浓集于核膜周围等早期凋亡表现;基因修饰后的DC能刺激自体T细胞分泌高水平的IFN-γ,与未转染的DC相比差异有统计学意义（P〈0．05）。结论：葡聚糖磁性纳米颗粒（DMN）在固定磁场的作用下成功将MUC1/Y基因转入DC,并可有效诱导出特异性的抗MUC1/Y膀胱癌的免疫效应。     

IL-12基因修饰树突状细胞体外诱导免疫杀伤肝癌细胞

目的探讨IL-12基因修饰树突状细胞(DC)体外诱导免疫杀伤肝癌细胞的效能及其机制。方法IL-12基因修饰肝癌病人外周血DC(DC-IL-12),ELISA法检测DC-IL-12培养上清中IL-12和IFN-γ水平,以冻融HepG2所获得的肿瘤相关抗原(TAA)刺激DC-IL-12,MTT法检测TAA负载的DC-IL-12刺激同源T淋巴细胞增殖分化能力,细胞毒试验检测DC-IL-12诱导的细胞毒T淋巴细胞(CTL)及其上清液对HepG2肝癌细胞株的杀伤作用,ELISA法检测CTL上清液IFN-γ水平。结果DC经IL-12基因修饰后48h分泌高水平IL-12(24·35±5·4)pg/ml及IFN-γ(725±30)pg/ml,均显著高于未转染DC组(P<0·01)。DC-IL-12诱导的CTL及其上清液对HepG2均有显著杀伤作用,杀伤率显著高于未转染DC组,分别为(82·43±8·7)%vs(57·4±4·3)%和(76·45±8·5)%vs(18·23±5·3)%(P<0·01),DC-IL-12诱导的CTL上清液IFN-γ水平显著高于未转染DC组,分别为(1125·0±32·7)pg/ml、(281·3±14·7)pg/ml(P<0·01)。结论IL-12基因修饰增强DC体外诱导自体T淋巴细胞产生特异性抗肝癌免疫,其机制与IL-12基因修饰促进DC分泌IL-12、增强T淋巴细胞活化及分泌IFN-γ密切相关。     

肿瘤细胞RNA转染活化的B细胞诱导的CTL抗肿瘤效应

目的探讨小鼠B淋巴细胞诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的抗肿瘤免疫作用。方法分离、纯化B淋巴细胞,并在CD40配体(CD40L)和重组小鼠白介素4(rmIL-4)联合作用下活化;将活化B细胞与T细胞共同培养,检测T细胞增殖情况。提取肝癌细胞Hepa1-6总RNA转染B淋巴细胞作为实验组,并以小鼠肝细胞RNA,脂质体,1640培养基转染作为对照组。检测转染后各组B细胞表面抗原呈递细胞标记(CD40,CD80,CD86)及主要组织相容性抗原(MHC)的表达情况。转染的B淋巴细胞与T淋巴细胞混合培养,诱导、扩增CTL;以CTL作为效应细胞,Hepa1-6为靶细胞,检测CTL杀伤活性。检测转染后刺激T细胞分泌IFN-γ的水平。结果转染Hepa1-6总RNA的B淋巴细胞刺激T细胞增殖能力高于RNA对照组(P0.05)、脂质体对照组及空白对照组(P0.01)。经肝癌细胞Hepa1-6总RNA转染的B淋巴细胞,其组织相容性分子及共刺激分子表达明显高于其他对照组。将肝癌细胞Hepa1-6总RNA转染的B淋巴细胞与对照组B细胞诱导的特异性杀伤率进行比较,两者差异具有统计学意义(P0.05)。CD40L活化的B淋巴细胞刺激的T细胞,分泌INF-γ的水平显著高于对照组(P0.05)。结论以肝癌细胞Hepa1-6总RNA转染的B淋巴细胞,可有效诱导CTL杀伤肝癌细胞,为肝癌的免疫治疗提供了一种可能的新思路。     

反义IDO-AFP基因融合修饰树突状细胞抗肝癌免疫作用

目的探讨反义IDO-AFP基因融合修饰树突状细胞(DC)后,DC通过调控色氨酸代谢达到高效、特异性抗肝癌作用。方法采用细胞培养方法,从小鼠骨髓中获得DC,用反义IDO核酸和AFP基因融合的载体,转染入DC内,检测转染入融合基因DC的对T细胞增殖的影响和体外对肝细胞癌的免疫应答的改变。以~(51)Cr释放法测定细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性。制作小鼠肝癌模型,分别予以反义IDO-AFP修饰的DC、单纯DC、空白对照组进行治疗,检测血清中自细胞介素(IL)-10、干扰素(IFN)-7水平；CD4、CD8和IFN-7和IL-10双阳性细胞比例,观察其抑制肿瘤的效果。结果反义IDO-AFP修饰的DC可激活小鼠脾淋巴细胞；能对肝癌细胞株H22细胞进行特异性杀伤,杀伤率为89．3%,显著高于单纯DC、生理盐水(空白对照组)组的34．7%和8．9% (P均＜0．01)而对艾氏腹水瘤细胞无效；反义IDO-AFP修饰DC组色氨酸含量为(17．8±1．2)μm,而单纯DC组和空白对照组的色氨酸为(6．2±0．6),um和(5．2±1．2)μm,表明反义IDO-AFP修饰DC可明显增加培养液中的色氨酸。使Thl细胞比例上升,抑制体内肿瘤的生长。结论反义IDO-AFP基因融合修饰树突状细胞后,DC通过调控色氨酸代谢达到高效、特异性抗肝癌的目的,可成为一种有效的瘤苗。     

DC疫苗对荷人前列腺癌免疫重建NOD/SCID小鼠的抑瘤作用

目的 探讨PC-3细胞冻融抗原致敏的树突状细胞(dendritic cells,DC)疫苗(PC-3-DC)对荷人前列腺癌免疫重建NOD/SCID小鼠(hu-PBL-NOD/SCID)的抑瘤作用.方法 采用人外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocytes,PBL)腹腔注射法建立hu-PBL-NOD/SCID小鼠模型,随机分为实验组(PC-3-DC组)和对照组(DC组、PBS组),腹腔分别注射PC-3-DC疫苗、未致敏的DC和PBS.每周1次,共2次,然后接种1×107 PC-3细胞,观察鼠成瘤率、成瘤潜伏期、肿瘤体积以及测定特异性CTL活性.结果 ELISA法可检测到小鼠血清中人IgG水平,hu-PBL-NOD/SCID嵌合模型重建成功,各组小鼠间成瘤率无明显差异,但PC-3-DC组成瘤潜伏期延长,肿瘤生长缓慢,2周后肿瘤体积明显小于DC组和PBS组,差异有统计学意义(P＜0.05),实验组脾淋巴细胞对PC-3细胞有特异性杀伤效应,而对K562细胞则无杀伤活性.结论 负载PC-3冻融抗原的DC疫苗可诱导人T淋巴细胞活化增殖,能有效抑制hu-PBL-NOD/SCID小鼠肿瘤的生长.     

腺病毒介导G250基因转染树突状细胞激活免疫效应细胞治疗肾癌的实验研究

目的 探讨以腺病毒(Ad)载体介导肾癌相关抗原G250基因转染制备树突状细胞(DC)瘤苗.体外诱导自体T淋巴细胞特异性抗肾癌免疫效应. 方法 自健康人外周血中提取单核细胞,将贴壁细胞分为3组(Ad-G250基因转染组、G250蛋白致敏组、未致敏组),用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和诱导活化;3组DC细胞中分别加入自体T淋巴细胞,获得细胞毒性T淋巴细胞(CTL).RT-PCR检测G250在DC细胞内的转录情况;流式细胞仪检测DC表面标志分子和G250抗原蛋白的表达情况;四甲基偶氮唑盐法检测3组CTL对肾癌细胞株786-0和肺癌细胞株A549的杀伤活性. 结果 Ad-G250高效转染DC,G250阳性细胞率为(52.2±1.5)%,G250蛋白在DC:内成功表达:基因转染组DC中成功扩增出G250产物;Ad-G250转染的DC表面标志CD_(80)、CD_(83)、CD_(86)、CD_(1a)、HLA-DR表达高于其他2组.差异均有统计学意义(P<0.05).Ad-G250基因转染组、G250蛋白致敏组、未致敏组诱导的3组CTL对786-0靶细胞杀伤活性分别为(83.4±2.8)%、(79.6±2.4)%、(77.3±2.1)%,组间比较差异有统计学意义(F=69.172,P=0.000);3组CTL对A549靶细胞杀伤活性差异无统计学意义(F=0.373,P=0.693). 结论 以Ad为载体介导抗原基因转染DC,并诱导特异的CTL,技术上可行,所诱导的CTL杀伤活性强,有望成为一种肿瘤免疫治疗方法.     

gp96多肽复合物对树突状细胞成熟的影响

目的研究热休克蛋白gp96多肽复合物与小鼠骨髓来源的树突状细胞（DC）成熟的关系。方法采用GM-CSF、IL-4刺激培养小鼠骨髓细胞，增殖产生大量DC；从小鼠肝癌细胞株H22细胞中提取gp96肽复合物，体外修饰DC；通过流式细胞仪检测上清液IL-12、TNF-α细胞因子含量和DC表面主要组织相容性Ⅱ类抗原、CD40、CD80等分子表达；DC与小鼠脾淋巴细胞共同培育后，检测CD4、CD8和IFN-γ、IL-10双阳性细胞比例；以^51Cr释放法测定细胞毒性T淋巴细胞（CTL）杀伤活性。结果gp96多肽复合物修饰的DC大量分泌IL-12、TNF-α等细胞因子，高表达MHCⅡ类抗原、CD40、CD80等分子；并且能激活小鼠脾淋巴细胞，CD8^＋-IFN-γ^＋和CD4^＋-IFN-γ^＋双阳性细胞比例显著升高；能够特异性的杀伤H22癌细胞。结论gp96多肽复合物能够诱导DC成熟，体外产生特异性CTL反应。     

MUC1-VNTR基因修饰树突细胞对胰腺癌细胞株体外杀伤效应的研究

目的:通过体外杀伤试验,研究转染黏液蛋白核心肽-连续重复序列(MUC1-VNTR)基因的树突细胞(DC)诱导的细胞毒T淋巴细胞(CTL)对人胰腺癌细胞株的特异杀伤效应.方法:选取入淋巴细胞A抗原(HLA-A2)阳性健康人外周血单个核细胞,体外诱导成熟DC,脂质体介导MUC1-VNTR基因转染入DC(DC-VNTR),以转染空质粒pcDNA3.1(DC-pcDNA3.1)及Lipofectamine处理之DC(DC-Lipo)作为对照,用Western印迹法检测MUC1-VNTR的表达,体外刺激同源T细胞,Elispot检测DC-VNTR诱导分泌IFN-γ和Gramzyme B之CTL能力,细胞毒试验检测DCVNTR诱导的CTL对Capan2和AsPC-1胰腺癌细胞株的杀伤作用.结果:Western印迹法检测到MUC1-VNTR的表达;DC-VNTR诱导的分泌IFN-γ、Gramzyme B的CTL数高于用DC-pcDNA3.1及DC-Lipo作对照者(P＜0.05);DCVNTR诱导的CTL对HIJA-A2、MUC1均阳性的Capan2细胞有显著杀伤效应.且显著高于DC-pcDNA3.1组及DC-Lipo组(P＜0.05).该CTL对HLA-A2阴性、MUC1阳性的AsPC-1细胞无明显杀伤效应.结论:以MUC1-VNTR基因转染的DC可以诱导具特性的CTL,并能特异地杀伤Capan2胰腺癌细胞株.     

肿瘤细胞RNA加载树突状细胞治疗前列腺癌的实验研究

目的 将小鼠前列腺癌细胞株(RM-1)的RNA加载树突状细胞(dendritic cell,DC),探讨其体内外诱导特异性CTL反应和抗肿瘤免疫的作用.方法 将RM-1细胞的RNA作为肿瘤抗原加载小鼠骨髓来源的DC,构建DC瘤苗(RNA-DC);混合淋巴细胞反应(MLR)检测DC瘤苗刺激T细胞的增殖能力,MTT法检测DC瘤苗诱导特异性CTL的杀伤活性;ELISA法测定DC瘤苗诱导细胞因子IL-2和IFN-γ的作用;体内实验检测DC瘤苗的抗前列腺癌免疫治疗作用和免疫保护作用.结果 DC瘤苗刺激T细胞增殖能力明显增强,能够诱导小鼠产生特异性CTL,对RM-1肿瘤细胞具有明显杀伤作用,细胞上清液中IL-2和IFN-γ的水平升高;经RNA-DC治疗的荷瘤小鼠瘤体生长减慢,存活期延长.DC瘤苗对小鼠具有免疫保护作用,能有效抵抗肿瘤细胞的攻击.结论 将前列腺癌细胞RNA加载DC,能够有效诱导抗肿瘤免疫反应和免疫保护功能,为前列腺癌的DC免疫治疗提供了良好的实验基础.     

白细胞介素-12干扰RNA转染树突状细胞对淋巴细胞增殖的影响

目的 观察白细胞介素(IL)-12两亚基(IL-12p35、IL-12p40)干扰RNA(IL-12p35siRNA、IL-12p40siRNA)重组腺病毒载体感染树突状细胞(DC)后对淋巴细胞增殖的影响.方法 用重组腺病毒载体(IL-12p35siRNA、IL-12p40siRNA、阴性对照HKsiRNA)感染DC,之后与同种小鼠T细胞行混合淋巴细胞培养,并测定上清液中IL-4和干扰素(IFN)-γ浓度以及淋巴细胞增殖反应.结果 IL-12p35siRNA、IL-12p40siRNA重组腺病毒载体分别感染树突状细胞后,只有IL-12p35siRNA重组腺病毒载体感染DC在混合淋巴细胞培养中引起的淋巴细胞增殖能力最低,并导致混合培养上清液中IL-4的上升和IFN-γ的下降.结论 IL-12p35亚基特异性siRNA抑制DC的共刺激活动,导致在体外TH2偏移.     

胰腺癌黏蛋白4基因修饰的树突状细胞疫苗构建及对胰腺癌细胞的免疫效应

目的 构建含有胰腺癌相关抗原黏蛋白(MUC)4(sv12)的腺病毒载体并转染树突状细胞(DC)构建DC疫苗,观察DC疫苗对胰腺癌细胞的免疫效应.方法 NCBI获得MUC4(sv12)mRNA序列,利用片段内酶切位点和重叠聚合酶链反应(PCR)技术获得MUCA(sv12)的编码序列,编码序列克隆到腺病毒载体,构建重组腺病毒(rAd-MUC4).病毒颗粒感染树突状细胞,产生活化的MUCA特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL),乳酸脱氢酶(LDH)释放法和Elispot法分别检测体外杀伤活性及干扰素(IFN)-γ的表达,同时设置空病毒(GFP)组和磷酸盐缓冲液(PBS)组作为阴性对照.结果 成功构建含有胰腺癌相关抗原MUCA(sv12)基因的重组腺病毒,LDH法检测结果:MUCA特异性CTL对HLA-A2+和MUC4+Capan-1细胞的毒性[E/T=10:1时为(13.7±6.0)%,20:1时为(21.4±4.7)%,40:时为(36.1±9.5)%],高于HLA-A2+Mcf-7细胞及MUCA+Bxpe-3细胞(P<0.05).Elispot法检测结果:E/T=20:时,Capan-1细胞的MUCA组斑点数为(139.1±23.3),高于GFP组(66.0±16.4)和PBS组(30.5±4.4),P<0.05;GFP组和PBS组差异无统计学意义.结论 腺病毒介导MUCA基因修饰的DC疫苗,可以体外诱导产生特异性CTL细胞,并获得有效的HLA限制性杀伤效应.     

IFNγ修饰的DC对T细胞增值及杀伤肿瘤细胞作用影响的研究

目的:探讨结肠癌细胞抗原致敏的IFNγ修饰的树突状细胞（DC）对T淋巴细胞增殖和分化的影响，以及活化T细胞对结肠癌LoVo细胞的杀伤作用。方法:构建携带人IFNγ基因的重组复制缺陷型腺病毒载体（Ad-IFNγ），用其感染人外周血单个核细胞来源的DC;以流式细胞仪检测DC表型的变化。用反复冻融裂解法提取的结肠癌LoVo细胞抗原致敏DC，将其与自身T淋巴细胞共同培养，观察T细胞增殖和分化的情况以及活化T细胞对LoVo细胞的杀伤作用。结果:Ad-IFNγ转染后24 h内几乎不影响DC的吞噬功能，DC自身表达的IFNγ在一定程度上能促进DC的成熟; IFNγ修饰的DC经LoVo细胞抗原致敏后能明显促进T淋巴细胞的增殖并使其向Th1细胞分化，Th1细胞对结肠癌LoVo有明显的特异性杀伤效应。结论:IFNγ修饰的DC能增强促进T淋巴细胞的增殖，诱导细胞免疫，增强T细胞的细胞毒作用，从而有效地杀伤肿瘤细胞。     

应用肝移植供体脾淋巴细胞预防受体鼠肝癌复发的研究

目的 探讨肝癌肝移植后应用活化供体脾脏来源的淋巴细胞,对受体实施过继性免疫治疗以预防肝癌复发的可行性.方法 以培养黏附法体外分离培养Wistar大鼠骨髓树突状细胞(DCs)前体细胞,经诱导后与Wistar大鼠肝癌细胞CBRH-7919裂解物抗原共同孵育,形成负载癌抗原的DCs.以此DCs分别诱导受体(Wistar大鼠)、供体(SD大鼠)来源的脾淋巴细胞作为两个实验组C(受体活化组)、D(供体活化组),以未经抗原诱导的受、供体脾淋巴细胞作为对照组A(受体对照组)、B(供体对照组).对比活化、非活化以及供体来源、受体来源的脾淋巴细胞在体外对受体肿瘤细胞的杀伤活性.以上述不同来源和处理的脾淋巴细胞对SD→Wistar大鼠肝移植后肿瘤复发模型行过继性免疫治疗,以盐水治疗作为对照组E,每组6只大鼠,观察各组免疫治疗对于肿瘤浸润淋巴细胞、受体肝脏成瘤率和供肝的排斥反应的影响.结果 DCs诱导脾细胞过程中,培养上清液γ干扰素(IFN-γ)分泌C、D组较A、B组有明显的升高.C、D组对肝癌细胞的杀伤活性较A、B组显著增强,D组较C组显著增强.D组脾细胞回输体内后,在移植后大鼠体内观察到了肿瘤浸润淋巴细胞增多,肿瘤组织坏死和成瘤率下降.免疫治疗前后供肝未见严重排斥反应发生.结论 活化的供体脾细胞较受体脾细胞有更强的肿瘤杀伤效果.应用供体脾淋巴细胞对肝移植受体进行过继性免疫治疗可以在不增加对移植肝排斥反应的同时,为预防肝癌肝移植术后复发、延长生存提供一种可能的方法.     

转染IKK2dn的受者树突状细胞回输延长同种异体肾移植大鼠的存活时间

目的 探讨IKK2dn基因转染并负载供者抗原的受者未成熟树突状细胞(imDC)延长同种异体肾移植大鼠的存活时间及其机制.方法 获取和培养Lewis大鼠骨髓源性DC,转染IKK2dn并负载BN大鼠可溶性抗原进行体外实验,检测CD86和主要组织相容性复合物(MHC)Ⅱ的表达及DC刺激T淋巴细胞增殖的能力.肾移植受者为Lewis大鼠,用随即数字表法分DC组、空转染组、转染组、对照组,术前7d分别输注1×10~7个D、Adv-0-DC、负载BN抗原的Adv-IKK2dn-DC和等量生理盐水,供者均为BN大鼠.另设第三方供者组,术前处理同转染组,供者为Wistar大鼠.移植后检测各组受者T淋巴细胞的增殖能力及血清白细胞介素2(IL-2)和γ干扰素(IFN-γ)的表达水平,观察各组大鼠的存活时间和发生排斥反应情况.结果 DC的体外实验结果显示:与转染IKK2dn前相比,转染后DC仍能低水平表达CD86和MHC Ⅱ,负载供者抗原后CD86和MHCⅡ表达均增加,而转染IKK2dn后再负载供者抗原,CD86和MHC Ⅱ的表达未发生明显变化;DC负载供者抗原后,刺激T淋巴细胞增殖的能力明显增强(P<0.05),而转染IKK2dn并负载供者抗原后不能有效刺激T淋巴细胞增殖.肾移植术后的检测结果显示:转染组T淋巴细胞的增殖能力明显低于其他4组(P<0.05或P相似文献   

瘤体内直接注射白细胞介素-7基因抗小鼠乳腺肿瘤免疫效应的研究

目的 观察瘤体内直接注射白细胞介素(IL)-7基因抗小鼠乳腺肿瘤免疫效应.方法 构建IL-7真核表达质粒(pcDNA3-IL-7);建立乳腺癌TM40D细胞BALB/C小鼠移植模型;瘤体内直接注射pcDNA3-IL-7,观察小鼠肿瘤体积变化;酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测外周血干扰素(IFN)-γ含量;流式细胞仪检测胞内IFN-γ的分泌量;局部肿瘤经治疗后行常规病理分析.结果 成功构建pcDNA3-IL-7;与对照磷酸盐缓冲液(PBS)组(115.2±11.8) ng/L、pcDNA3组(133.6±9.4) ng/L比较,pcDNA3 -IL-7注射组(242.3±10.1)ng/L外周血IFN-γ明显增高;pcDNA3-IL-7明显抑制肿瘤生长(P＜0.05);流式细胞仪检测显示pcDNA3-IL-7显著促进CD4+T细胞、CD8+T细胞内IFN-γ的分泌量;常规病理显示pcDNA3 -IL-7注射组肿瘤组织大量坏死,炎性细胞和大量淋巴细胞浸润.结论 瘤体内直接注射pcDNA3-IL-7明显抑制小鼠乳腺肿瘤生长,显著促进IFN-γ分泌,增强了小鼠机体抗乳腺肿瘤的免疫效应.     

Bacillus Calmette‐Guérin cell‐wall skeleton enhances the killing activity of cytotoxic lymphocyte‐activated human dendritic cells transduced with the prostate‐specific antigen gene

OBJECTIVE

To determine whether dendritic cells (DC) transduced with the prostate‐specific antigen (PSA) gene can induce PSA‐specific cytotoxic lymphocytes (CTL) against prostate cancer cells, and whether bacillus Calmette‐Guérin (BCG) cell‐wall skeleton (CWS) can enhance the maturation of DC‐PSA and the killing activity of subsequently induced PSA‐specific CTL.

MATERIALS AND METHODS

We generated an adenovirus encoding the PSA gene (AxCA‐PSA) using the cosmid‐terminal protein complex method. DC were infected with AxCA‐PSA using the centrifugal method. The ability of CTL to lyse target cells expressing PSA, i.e the PSA‐positive prostate cancer cell line, LNCap, and PSA‐transduced autologous phytohaemagglutinin (PHA) blasts expressing PSA, was assessed using the ⁵¹Cr‐release assay. The maturation of DC‐PSA stimulated by BCG‐CWS was assayed by flow cytometry. The cytotoxic activity enhanced by BCG‐CWS was assessed by the ⁵¹Cr‐release assay.

RESULTS

DC‐PSA induced PSA‐specific CTL with 85% cytotoxic activity against LNCaP (effector: target ratio, E:T, of 50:1). However, the cytotoxic activity against PSA‐negative cells was very low. Anti‐CD8 and anti‐major histocompatibility (MHC) class I antibodies blocked PSA‐specific cytotoxicity. The PSA‐specific killing was reproducible against autologous PHA blast cells expressing PSA, independently of human leukocyte antigen haplotype. Furthermore, the combination of DC‐PSA with BCG‐CWS remarkably enhanced the PSA‐specific cytotoxicity against PHA blasts expressing PSA (15–30% at an E:T ratio of 50:1).

CONCLUSION

These findings suggest that DC‐PSA can induce MHC class I‐restricted PSA‐specific CD8+ CTL responses and that DC‐PSA matured by BCG‐CWS enhance PSA‐specific cytotoxicity. The combination of DC‐PSA with BCG‐CWS might be a useful approach for treating advanced prostate cancer.     

Transplant long-surviving induced by CD40-CD40 ligand costimulation blockade is dependent on IFN-γ through its effect on CD4(+)CD25(+) regulatory T cells

BackgroundIFN-γ was documented to be commonly associated with acute rejection. In the present study, we investigated the role of IFN-γ in the transplant long-surviving induced by blocking CD40–CD40 ligand (CD40–CD40L) costimulation and its mechanisms.MethodsIFN-γ expression in cardiac allografts and spleens from syngeneic and allogeneic recipients with or without anti-CD40L monoclonal antibody (MR-1) treatment was examined by real-time RT-PCR. The grafts survival time in Wild type (IFN-γ^+/+) and IFN-γ deficient (IFN-γ^?/?) recipients was investigated. Mixed lymphocyte reaction (MLR) of CD4⁺ T cells and cytotoxic T lymphocyte (CTL) assay of CD8⁺ T cells were also studied. FoxP3 expression in allografts and spleens from IFN-γ^+/+ or IFN-γ^?/? recipients with MR-1 treatment was examined. Furthermore, FoxP3, IL-10 and CTLA-4 expressions and the suppressive capability of CD4⁺CD25⁺ regulatory T cells were examined.ResultsRejected allografts showed significantly higher IFN-γ expression than long-surviving allografts. Allograft survival was not prolonged in nonimmunosuppressed IFN-γ^?/? mice. Administration of MR-1 induced long-term survival in 90.1% of IFN-γ^+/+ recipients (98 ± 6.6 days) but failed to do so in IFN-γ^?/? group (16.2 ± 4.0 days). IFN-γ^?/? recipients facilitated the proliferation and CTL generation of T cells. The allografts and spleens from IFN-γ^+/+ recipients contained higher FoxP3 expression than IFN-γ^?/? recipients. Moreover, CD4⁺CD25⁺ T cells from IFN-γ^+/+ recipients displayed a higher FoxP3 and IL-10 expression and suppressive capability.ConclusionIFN-γ plays an important role in the long-surviving induced by blocking CD40–CD40L through inhibiting the function of activated T cells and increasing suppressive capability of CD4⁺CD25⁺ regulatory T cells.     

CpG寡聚脱氧核苷酸增强树突状细胞疫苗诱导的特异性抗前列腺癌作用

目的 观察CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG-ODN)对截短的人前列腺特异性膜抗原(tPSMA)基因修饰的树突状细胞(DCs)诱导的抗前列腺癌效应.方法 利用复制缺陷性腺病毒AdEasy-1系统,通过基因重组技术构建Ad-tPSMA及Ad-eGFP.将Ad-tPSMA和Ad-eGFP感染鼠源性DCs,用含10μg/L粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素(IL)-4和含10%胎牛血清(FCS)的RPMI 1640培养基诱导培养6 d后,然后再添加1 mg/L的CpG-ODN体外培养1 d,最后添加1 mg/L的脂多糖(LPS)继续培养1 d,使其成熟.流式细胞仪检测DCs细胞表型,CCK-8法检测混合淋巴细胞反应T细胞增殖能力,酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒检测T细胞分泌细胞因子[IL-2、干扰素(INF)-γ]的影响,CCK-8试剂检测T细胞特性杀伤靶细胞活性.结果 CpG-ODN促进Ad-tPSMA感染的DCs(CpG/DCs-Ad-tPSMA)高表达MHC Ⅱ(83.8±3.7)%、CD80(79.8±5.6)%和CD86(78.3 ±2.8)%,且刺激同种异体T细胞增殖能力明显高于DCs-Ad-tPSMA组、DCs-Ad-eGFP组和未转染的DCs组(P＜0.05);培养上清中细胞因子IL-2(179.64±2.72)ng/L和INF-γ(1581.75±28.61)ng/L,表达水平均明显高于DCs-Ad-tPSMA组、DCs-Ad-eGFP组和未转染的DCs组(P＜0.05);CpG/DCs-Ad-tPSMA组诱导RM-1-tPSMA细胞特异性杀伤率为(55.3±1.2)%,明显高于DCs-Ad-tPSMA组(40.7±1.4)%、DCs-Ad-eGFP组(12.7±1.2)%和未转染的DCs组(10.8±1.7)%(P＜0.05).结论 CpG-ODN能增强PSMA基因修饰的DCs疫苗诱导的特异性抗前列腺癌效应.

Abstract：

Objective To observe cytosine-phosphorothioate-guanine oligodeoxynucleotides (CpG-ODN) for the anti-prostate cancer effect induced by dendritic cells (DCs) transduced with recombinant adenovirus vector bearing truncated human prostate specific membrane antigen (tPSMA) gene. Methods Replication deficient adenovirus AdEasy-1 system was used to construct recombination adenovirus Ad-tPSMA and Ad-eGFP. Mouse derived DCs were transduced with Ad-tPSMA and Ad-eGFP, and cultured for 6 days in the presence of 10 μg/L GM-CSF and IL4 in RPMI 1640 containing 10% FCS. After culture with 1 mg/L CpG-ODN for 1 day, DCs were further matured with lipopolysaccharide (LPS) at a concentration of 1μg/L for 1 day. The phenotype of DCs was analyzed by using flow cytometry. T cells proliferation stimulated by DCs in allogeneic mixed lymphocyte reactions and the level of interleukin (IL)-2, interferon (IFN)-γ were detected by ELISA kit, and cytotoxic CTL activity induced by DCs was tested by CCK-8 assay. Results CpG-ODN up-regulated the expression of MHCⅡ (83. 8 ±3. 7)% , CD80 (79. 8 ±5. 6)% and CD86 (78. 3 ±2. 8)% in Ad-tPSMA-tranduced DCs (CpG/DCs-Ad-tPSMA). T cells proliferation stimulated by CpG/DCs-Ad-tPSMA was significantly higher than that in DCs control group, DCs-Ad-tPSMA group and DCs-Ad-eGFP group (P ＜0.05). CpG/DCs-Ad-tPSMA induced increased IL-2 (179. 64 ±2. 72) ng/L, and INF-7 (1581.75 ±28. 61) ng/L expression levels as compared to DCs control group, DCs-Ad-tPSMA group, and DCs-Ad-eGFP group (P＜0. 05), and induced more outstanding RM-1-tPSMA cell specific cytotoxic rate (40.7 ±1.4)%than DCs control group (10. 8 ± 1.7) % , DCs-Ad-tPSMA group (40.7 ± 1.4)% , and DCs-Ad-eGFP group (12.7 ± 1. 2)% (P＜0.05). Conclusion CpG-ODN can promote specific anti-prostate cancer induced by DCs modified with recombinant adenovirus vector bearing tPSMA gene.