结核分枝杆菌分泌蛋白MPB64表达纯化

目的表达并纯化结核分枝杆菌重组蛋白pET32a-MPB64。方法将构建好的表达载体pET32a-MPB64测序后,转化到大肠杆菌BL21（DE3）内。经IPTG诱导,在大肠杆菌BL-21中表达,用SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物并进行蛋白纯化。结果质粒pET32a-MPB64经测序,结果与Geneback中的结核分枝杆菌标准菌株H37RV核苷酸序列基本一致;SDS-PAGE分析表明,该融合蛋白以可溶性的形式表达,其分子质量约为24 kDa,蛋白表达量约占菌体总蛋白的20%;该蛋白经MagExtractor-His-tag-磁珠纯化试剂盒纯化后浓度达2.49mg·mL^-1;Western-blot结果显示融合蛋白可与抗His-Tag标签的单克隆抗体结合。结论成功得到高纯度的重组目的蛋白pET32a-MPB64,为进一步制备其单克隆抗体奠定了基础。     

免疫胶体金法检测MPB64抗原在结核病实验室诊断中的价值

目的通过与传统的结核病实验室诊断方法（直接涂片抗酸染色、改良罗氏培养、PCR）的比较,评价免疫胶体金法检测结核杆菌MPB64抗原在结核病快速诊断中的应用价值。方法收集158例确诊为结核病患者的临床标本,分别用直接涂片抗酸染色、改良罗氏培养基培养、PCR、免疫胶体金法检测米氏7H9培养产物中的MPB64抗原检测结核分支杆菌,并对结果进行比较分析。结果涂片阳性率为10.76%,改良罗氏培养阳性率为20.89%,PCR检测阳性率为56.33%,免疫胶体金法检测阳性率为41.14%。结论免疫胶体金法检测米氏7H9液体培养产物中的MPB64抗原可以作为一种较为敏感、快速简便的检测结核分支杆菌感染的方法,有助于结核病临床快速诊断。     

结核分枝杆菌MPT64抗原对巨噬细胞凋亡的抑制作用

目的探讨结核分枝杆菌MPT64抗原对RAW264.7巨噬细胞的影响及相关机制。方法将MPT64基因在大肠杆菌中表达、纯化,获得的纯化蛋白用于后续实验。将用佛波醇酯(PMA)分化的RAW264.7巨噬细胞分为对照组、卡介菌纯蛋白衍生物(BCGPPD)诱导组、BCG-PPD+MPT64共同作用组,分别给予相应的处理。孵育16 h后,采用流式细胞术检测细胞凋亡情况,用ELISA试剂盒检测培养细胞上清的细胞因子TNF-α及IL-10水平。结果 BCG-PPD可以诱导RAW264.7巨噬细胞凋亡,BCG-PPD+MPT64组的细胞凋亡水平低于BCG-PPD组(P<0.05)。细胞因子上清检测结果表明,与对照组相比,BCG-PPD作用组的TNF-α水平升高(P<0.01),而IL-10水平无明显变化;与BCG-PPD组相比,BCG-PPD+MPT64共同孵育组的IL-10水平升高(P<0.01),而TNF-α水平无明显变化。结论 MPT64抗原可能是一种毒力因子,能够抑制BCG-PPD诱导的巨噬细胞凋亡,该作用可能是通过提高IL-10水平来实现的。     

结核分枝杆菌胶体金法对分枝杆菌菌型快速鉴别价值探讨

目的探讨结核分枝杆菌胶体金法对分枝杆菌菌型快速鉴别的价值。方法采用结核分枝杆菌胶体金法诊断试剂和传统菌型鉴定实验方法,对131株分枝杆菌临床分离株进行鉴别并进行比较。结果采用胶体金法快速鉴定试剂,23株非结核分枝杆菌临床分离株检测结果全部阴性,108株结核分枝杆菌临床分离株有107株阳性,该试剂快速鉴定结核分枝杆菌敏感度为99.1%,特异度为100%。胶体金法检出结核分枝杆菌所需时间平均为9.9 d,传统方法所需时间平均为28.2 d,二者间差异有统计学意义(P<0.05)。结论结核分枝杆菌胶体金法快速诊断试剂盒鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌,方法简便、快速,是分枝杆菌菌型鉴别的有效方法。     

应用MPT64为靶标快速检测结核分枝杆菌生长的研究

目的探讨应用MPT64作为快速检测结核分枝杆菌生长指示的可能性,以期建立一种准确、快速、简便、易于普及开展的结核分枝杆菌生长检测方法。方法应用BACTEC MGIT960分枝杆菌快速培养仪器系统培养法对4株结核分枝杆菌1 mg/mL纯培养物菌液进行10倍稀释共7个稀释浓度的32例菌悬液、64例涂片抗酸染色阳性样本及98例非选择性临床送检样本进行培养。同时,对菌悬液,高浓度MPT64检测阳性时,即对下一浓度每天进行1次MPT64检测,对涂片阳性样本培养管每天进行1次MPT64检测,阴性者检测至培养阳性出现或至培养42 d;对非选择性临床送检样本每周定时进行1次MPT64检测,阴性者检测至培养6周。结果(1)4株结核分枝杆菌1 mg/mL纯培养物菌液稀释试验显示:应用MPT64作为快速检测结核分枝杆菌生长指示的最小菌量为10-7～10-6mg/mL,仪器系统培养法为10-6～10-5mg/mL。(2)64例涂片抗酸染色阳性样本63例培养阳性,其中菌种鉴定为结核分枝杆菌的58例样本中56例MPT64检测阳性,检出时间为3～16 d,平均7.8 d,其培养阳性检出时间为6～30 d,平均13.7 d。其余5例非结核分...     

结核分枝杆菌抗原及其研究进展

结核病是危害人类健康的最大传染病之一。结核分枝杆菌抗原遗传背景较复杂,且个体差异较大,应用单一抗原和单一的诊断方法无法对结核病进行及时、准确的诊断。近年来国内外学者发现了一些新的结核分枝杆菌菌属抗原和特异性抗原,并逐渐完善了结核病的诊断方法,对结核病的诊断具有重大意义。现就这些抗原的生物学特性及其在结核病诊断中的研究进展进行综述。     

检测痰样本中MPB64蛋白在结核病实验室诊断中的价值

目的讨论检测痰样本中MPB64蛋白的含量作为快速诊断结核病方法的可行性.方法 对59例肺结核病患者和67例非肺结核病患者进行实时荧光定量PCR检测结核杆菌DNA、痰涂片染色抗酸菌检查和免疫胶体金法检测MPB64蛋白,对比分析三种方法的检测结果,并根据诊断结果对MPB64蛋白检测方法进行评价,讨论其是否可作为一种结核病的快速诊断方法.结果 MPB64蛋白检测与荧光定量PCR检测、涂片染色结果符合率为62.3%;其敏感度、特异度、及准确度分别为57.45%、67.47%和62.17%,而涂片染色法与荧光定量PCR方法的敏感度均低于40%.此外,MPB染色法在特异度与准确度两个要素方面要要明显低于涂片染色法(100%、67.12%)和定量PCR方法(96.58%、69.45%).结论 虽然采用MPB蛋白法在诊断结核病中有较高的敏感度,但由于特异度和准确度都相对较低,因此MPB蛋白直测法仅可作为初步排查方法,能否作为快速诊断的方法还有待深入研究.     

结核分枝杆菌抗原MPT83和MPT64 二价基因疫苗的研究

目的探讨结核杆菌两种抗原MPT83 和MPT64基因疫苗的免疫原性和免疫保护性.方法用成对引物扩增MPT83 和MPT64两种抗原基因,构建到同一载体pJW4303中,测序正确和体外表达验证后免疫小鼠,间接酶联免疫吸附试验(ELISA)方法测定3次免疫后小鼠的抗体滴度.对3次免疫后的小鼠脾细胞进行培养,抗原刺激,用夹心 ELISA方法测定细胞因子IFN-γ和IL-4的含量.免疫小鼠攻毒,进行细菌培养,检测肺脏和脾脏的载菌量.结果每次免疫后抗原的滴度分别为 1∶ 200、1∶ 800、1∶ 6400,而卡介苗(BCG)组的抗体滴度为1∶ 800,空载体组未检测到抗体滴度.融合的二价基因疫苗免疫小鼠,主要诱发Th1 型细胞因子,IFN-γ占优势,二价组中的含量为7520 pg/ml, IL-4的含量仅为ng级.H37Rv攻毒后,二价组小鼠的肺脏载菌量为(2.21±0.03) ×105,比空载体免疫小鼠低103倍,比BCG免疫小鼠低10倍.结论抗原MPT83和MPT64二价基因疫苗有效提高了机体保护效力,对于结核病的防治具有一定的借鉴价值.     

结核分枝杆菌分泌性抗原在结核诊断中的研究进展

结核病是由结核分枝杆菌所引起的一种严重危害人民健康的慢性传染病,是目前所知传染病中最致命的传染病.结核病诊断主要依靠细菌学检测、分子生物学检测、免疫学检测和病理诊断,随着近年来全球结核病发病率的上升,目前已有的检测技术灵敏度和特异性较低,尚不能达到理想的诊断率,寻找高效、准确、简便的诊断方法是控制结核病疫情的关键.已经...     

免疫层析法检测MPT64蛋白在结核与非结核分枝杆菌鉴定中的临床应用价值

目的评价免疫层析法检测MPT64蛋白鉴别结核与非结核分枝杆菌的临床应用价值。方法采用免疫层析法检测201株分枝杆菌,其中包括4株结核分枝杆菌复合群(mycobacterium tuberculosis complex,MTC)标准株、135株结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)临床分离株、17株非结核分枝杆菌(nontuberculosis mycobacterium,NTM)标准株和45株NTM临床分离株的MPT64蛋白。结果 4株MTC标准菌株和135株MTB临床分离株中,138株MPT64蛋白检测阳性,1株检测为阴性,敏感性为99.3%(138/139),17株NTM标准株和45株NTM临床分离株MPT64蛋白检测均为阴性,特异性为100%(62/62),201株结核和非结核分枝杆菌MPT64蛋白检测的准确度为99.5%(200/201)。结论应用免疫层析法检测MPT64蛋白鉴别结核与非结核分枝杆菌敏感性高,特异性强,方法简便、快速、准确,具有良好的临床应用前景。     

非结核分枝杆菌淋巴结炎特征性组织病理学改变的初步研究

目的：探讨非结核分枝杆菌（NTM）性淋巴结炎的特征性组织病理学改变。方法：建立非结核分枝杆菌性淋巴结炎的实验动物模型，光镜下观察组织病理学改变。结果：NTM淋巴结炎的病理学改变与淋巴结结核的病理学改变不完全相同，其特征性病理学改变为：①淋巴结内可见肉芽肿形成，肉芽肿呈结节状，中央为凝固性坏死，非干酪样坏死，坏死区域中可见中性粒细胞，周围可见类上皮细胞、淋巴细胞、单核细胞，外围为纤维组织包裹；肉芽肿外可见朗汉斯巨细胞。②淋巴结内可见长条状匐形坏死，中央为凝固性坏死，并可见坏死组织脱落后遗留的条状空腔，坏死区域中可见中性粒细胞，周围可见类上皮细胞、淋巴细胞、单核细胞，外围可见纤维组织包绕。结论：匐形性坏死是NTM淋巴结炎的特征性组织病理学改变之一。     

母牛分支杆菌菌苗治疗非典型分支杆菌肺病的临床观察

目的评价母牛分支杆菌(微卡)菌苗对非典型分支杆菌(NTM)肺病的疗效。方法将31例经菌型鉴定为NTM肺病的患者随机分为A组(微卡组)和B组(对照组)，B组采用4~6种敏感药物，A组在B组的基础上加用微卡，观察痰菌转阴及肺部病灶吸收情况。结果A组痰菌转阴率高于B组。肺部病灶吸收有显著性差异。结论微卡能加速痰菌转阴，提高免疫功能，是一种较好的免疫调节剂。     

应用双重PCR技术快速鉴定结核与非结核分支杆菌

目的：建立双重ＰＣＲ技术快速鉴定的结核与非结核分支杆菌。方法：通过试验选择双重ＰＣＲ最佳反应条件,检测引物Ａ１,Ａ２和Ｂ１,Ｂ２扩增分支杆菌的特异性及扩增结核分支杆菌的敏感性,并对３４例结核分支杆菌和非结核分支杆菌临床分离株鉴定。结果：引物Ａ１,Ａ２能扩增所试２４种分支杆菌,Ｂ１,Ｂ２仅扩增结核分支杆菌复合体菌种,两对引物扩增１２种非分支杆菌均为阴性。     

非结核分枝杆菌肺病54例临床特点分析及诊治体会

目的 分析非结核分枝杆菌(NTM)肺病的临床特点,以提高对NTM肺病的诊疗水平.方法 回顾性分析54例NTM肺病患者的临床资料.结果 NTM肺病≥40岁的中老年人多见(87.0％),病程较长,平均8.3年,多发于原有慢性肺部基础疾病或免疫力低下人群;临床症状无特异性,结核菌素试验皮试多为弱阳性(79.6％);胸部CT示病灶多位于双侧肺(81.5％)和全部肺叶(70.4％),薄壁空洞(14/18,77.8％)较厚壁空洞(4/18,22.2％)常见,均靠近胸膜,支气管扩张多位于右中叶或左舌叶(12/17,70.6％),钙化影少见(9.3％);支气管灌洗液NTM培养阳性率高(18/20,90.0％);菌种以鸟-胞内分枝杆菌(64.8％)和龟或脓肿分枝杆菌(25.9％)多见;对一线抗结核药耐药率高,耐药率均超过90％.极易误诊为肺结核(96.3％),治愈率低(34.8％).结论 NTM肺病容易被误诊,治疗难度大,应分析其临床特点和诊疗上的难点,总结出提高NTM肺病诊疗成功率的策略.     

非结核分枝杆菌临床分离株的流行病学及临床特征分析

目的 分析台州市非结核分枝杆菌临床分离株的流行病学及临床特征，为非结核分枝杆菌病的疫情监测和诊断治疗提供参考依据。方法 回顾统计分析我院于2015 年1 月～2019 年12 月间检到的非结核分枝杆菌的分离率、菌种分布、混合感染情况、性别年龄构成和临床特征等。应用DNA 微阵列芯片法对分枝杆菌进行菌种鉴定。结果 5年间共检到非结核分枝杆菌331 株，分离率为19.0%，且逐年增加。检到的主要为胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌和龟/脓肿分枝杆菌，以胞内分枝杆菌最为常见，占57.7%。男性高于女性，50 岁以上高发。非结核分枝杆菌感染者常合并有肺结核、支气管扩张、肺部感染和慢性阻塞性肺疾病，临床表现多以咳嗽、咳痰首次就诊。结论 台州市非结核分枝杆菌的分离率和患病率逐年增加，以胞内分枝杆菌最为常见，DNA 微阵列芯片法可以用于分枝杆菌的快速鉴定。     

散发性皮肤非结核分枝杆菌感染37例回顾研究

目的：通过分析散发性皮肤非结核分枝杆菌（nontuberculous mycobacteria, NTM）感染的临床及病理特点,探讨皮肤NTM感染诊断方法的准确性及药物治疗原则。方法：回顾分析北京大学人民医院皮肤科门诊自2000年1月至2014年3月诊治的散发性皮肤NTM感染患者,病原学检查方法主要包括细菌培养鉴定及PCR扩增病损组织DNA分枝杆菌hsp65基因并鉴定。结果：共37例患者,30例为海分枝杆菌感染,6例为脓肿分枝杆菌感染,1例为龟分枝杆菌和偶发分枝杆菌感染,PCR法较细菌培养更为敏感;21例有外伤史,21例有养鱼史或海产相关工作史,1例有美容手术史。海分枝杆菌感染皮疹多表现为结节和浸润性斑块,沿淋巴管播散常见,脓肿分枝杆菌感染临床缺乏特异性,组织病理上常表现为感染性肉芽肿。海分枝杆菌感染患者多采用利福平、乙胺丁醇、克拉霉素二联或三联治疗,治愈率90.00%;6例脓肿分枝杆菌感染患者中4例治愈,1例死亡。结论：散发性皮肤NTM感染以海分枝杆菌感染最常见,外伤（包括美容或手术）及鱼类或海产接触为常见诱因;组织病理改变无致病菌特异性,确诊需有病原学诊断依据。海分枝杆菌感染的治疗可选用利福平、乙胺丁醇、克拉霉素中任两种联合治疗,脓肿分枝杆菌感染的治疗应依据药物敏感试验结果制定方案。     

Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) for rapid identification of Mycobacterium abscessus

Background

Nontuberculous mycobacteria are increasingly being implicated in infections and have become an important cause of health care associated infections. Mycobacterium abscessus, a rapidly growing mycobacteria, is of particular concern as it tends to be resistant to commonly used therapeutic options. Conventional phenotypic methods for speciation of mycobacteria are time consuming, labor intensive and not always reliable. Molecular methods require expertise and are expensive. The study was used to evaluate the use of matrix associated laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) as a means of rapid identification of M. abscessus.

免疫支持对非结核分枝杆菌肺病患者疗效影响

目的 了解非结核分枝杆菌(nontuberculous mycobacteria,NTM)肺病患者免疫功能低下发生率,以及免疫支持的应用状况、探讨免疫支持治疗对患者2月末痰菌阴转及病变吸收的影响,为临床实施免疫干预提供参考依据.方法 分析广州市胸科医院2014年1月-2015年12月确诊的资料完整的381例NTM肺病患者免疫功能情况以及免疫支持的应用状况,观察组(加用免疫调节剂母牛分枝杆菌菌苗)228例与同期对照组(未使用免疫调节剂)153例进行2月末痰菌阴转及病变吸收情况比较.结果 381例患者中,免疫功能低下的发生率为45.67% (174/381);免疫支持率为59.84% (228/381).细菌学改变:治疗前所有患者痰抗酸杆菌涂片和培养均为阳性.治疗2个月后两组的阴转率分别为67/228(29.38%)、17/153(11.11%),x2=17.79,P<0.05. 影像学改变:两组的病变吸收有效率分别为62/228(27.19%)、16/153(10.45%),x2=15.75,P<0.05;空洞吸收有效率分别为61/228(26.75%)、15/153(9.80%),x2 =20.42,P<0.05.结论 非结核分枝杆菌肺病患者存在较高比例的免疫功能低下风险,观察组的痰茵阴转、病灶吸收和空洞闭合的疗效高于对照组.     

皮肤非结核分枝杆菌病诊治进展

非结核分枝杆菌（nontuberculous mycobacteria, NTM）是一类广泛存在于各种环境中的微生物,可引起人体多种器官和组织的感染。由于人口老龄化,美容、移植手术的广泛开展以及HIV感染的增加,近年来皮肤NTM病的发生率一直呈逐渐升高的趋势,小范围内爆发的报道也不少。由于临床和病理表现多不典型以及医疗机构检测能力的限制,皮肤NTM病极易被漏诊和误诊。同时各种NTM对药物敏感性差异很大、部分菌种极易对抗生素产生耐药,需联合多种抗生素长疗程治疗,但药物之间的相互作用及副作用使治疗效果往往不尽如人意。随着近年来研究的深入,人们对于皮肤NTM病的诊断和治疗等方面有了新的认识,在治疗手段、新型药物、噬菌体疗法、疫苗等领域的研究都有了新的进展。本文对皮肤NTM病诊断和治疗等方面的进展进行了综述。