半套式PCR和DNA探针技术检测Q热立克次体

目的 建立半套式PCR和DNA探针技术由于检测Q热立克次体。方法 依据已知的Q热立克次体的16S和23S rRNA基因及其间区的序列。设计3条引物,建立了扩增16S－23S mRNA基因间区的半套式PCR方法,并将扩增片段制成探针,建立了斑点杂交技术。结果 10株Q热立克次体分离株均可扩增出572bp的PCR条带,而对照菌都为阴性,此半套式PCR方法的灵敏度高达1pg;用九里株扩增片段标记后制成的探针,与10个Q热立克次体分离株的全DNA呈阳性杂交,对照菌为阴性,此杂交方法的灵敏度为0．5ng。结论 基于Q热立克次体16S－23S rRNA基因间区的半套式PCR和DNA探针技术具有较好的特异性和灵敏度,可联合应用于Q热的病原学诊断。     

Q热、埃立克体病的研究进展

立克次体病是一类严重危害人类健康的自然疫源性疾病,在历史上曾经造成重大灾难,现已成为世界性关注的疾病,但我国立克次体方面的相关报道较少。近年来,发现了一系列新的立克次体所致疾病,成为公共卫生领域的新课题。立克次体疾病复杂多样,且临床表现无明显特异性。现对Q热及埃立克体病的相关研究进展进行综述。     

Real-time PCR检测脑缺血患者唾液中COX-2的变化

目的研究脑缺血患者唾液中COX-2的改变。方法收集2011年5月至2012年6月期间大庆龙南医院神经内科和临床检验中心科收治的脑缺血患者138例,以Real-time PCR法检测患者唾液中COX-2的含量变化。分析脑缺血患者的病因,为临床诊断和治疗提供依据。结果通过Real-time PCR检测发现,在脑缺血患者中,COX-2含量有所升高且与病情和病程具有一定关联性意义,病情重,病程长的患者表达升高明显。结论 COX-2的含量变化对脑缺血患者的诊断、疗效的判断、治疗结果的评价具有一定的意义,研究OCX-2的表达对临床治疗疾病具有一定的指导意义。     

用国产泛影葡胺线性密度梯度离心法纯化Q热立克次体

本文用国产泛影葡胺线性密度梯度离心法纯化Q热立克次体,所得制备物具有产量高、纯度高、抗原性完整及保持原有感染性等特点.     

NDM1基因常规PCR与荧光定量PCR检测方法的建立及其检测结果比较

目的：建立NDM1基因常规PCR和荧光定量PCR（FQ-PCR）检测方法,并对其检测结果进行比较。方法：设计3对NDM1基因常规PCR与FQ-PCR引物,建立常规PCR与FQ-PCR反应体系和条件,比较2种检测方法的特异性、灵敏度和对模拟临床样品的检测效果。结果：成功建立NDM1基因常规PCR和FQ-PCR检测方法;特异性检测,常规PCR与FQ-PCR检测7种常见病原菌均为阴性;灵敏度检测,常规PCR检测限为10⁶ mL^-1 ,FQ-PCR检测限为10⁴ mL^-1;模拟临床样品检测,常规PCR和FQ-PCR检测结果一致。结论：常规PCR与FQ-PCR均有很好的特异性,FQ-PCR灵敏度比常规PCR高100倍。     

Real-Time PCR及其在立克次体定量检测中的应用

立克次体病是由立克次体（Rickettsia）引起的严重威胁人类健康的人兽共患自然疫源性疾病。近年来,新的立克次体病原体不断被发现,立克次体病已成为世界关注的疾病,我国从病原学上已经证实了10种立克次体病的存在^[1]。立克次体病复杂多样,临床表现无特异性，易漏诊、误诊，通常实验室检测是诊断的主要依据。目前，Real—Time PCR（实时荧光定量PCR）技术已在病原学定量检测中得到良好的应用，本文将近年来该技术在立克次体中的定量检测研究进展进行综述。     

Real-time PCR检测人非小细胞肺癌中CYP2A6基因的表达

目的检测肺癌及相应癌旁正常组织中细胞色素P450 2A6(CYP2A6)mR NA的表达,探讨其可能的临床意义。方法采用Real-time PCR技术比较人肺癌与相应癌旁正常组织中CYP2A6mRNA的表达差异,并比较CYP2A6基因的表达与患者临床病理参数的关系。结果 CYP2A6 mR NA在肺癌组织中的表达低于对应的癌旁组织(P<0.05),CYP2A6 mRNA的表达程度与患者的性别、年龄、肺癌的病理分型及有无淋巴结转移无关(P>0.05)。结论 CYP2A6 mRNA在肺癌组织中的表达下调,提示CYP2A6基因表达下调可能在肺癌的发生发展中起作用。     

海南微小牛蜱(Boophilus micloplus)Q热立克次体的分离

1986-1987两年来,我们从海南岛的洛南、西榕地区水牛身上捕捉的微小牛蜱(Boo-philus mieroplus),分为21组接种豚鼠,其中4组分离出立克次体,总阳性率为19.04％。该立克次体经鉴定是属于Q热立克次体。提示微小牛蜱是海南Q热宿主之一。     

用PCR技术及常规病毒学检测诊断呼吸道合胞病毒感染的方法学比较

分别采用病毒分离法、免疫荧光法及NestedPCR、RT－PCR十核酸探针杂交实验对78例呼吸性疾病患儿鼻腔抽吸物标本中呼吸道合胞病毒（RSV）的感染水平进行了检测。结果表明，在这4种检测方法中，以NestedPCR（巢式PCR）法最为敏感、稳定，RSV感染的阳性率为29·49％，且省时，准确。     

免疫组化中酶修复与常规热修复的比较

目的探讨抗原修复时酶消化修复法和常规微波修复法对检测结果的影响。方法取已确诊为乳腺癌患者的乳腺组织,10%甲醛溶液固定,石蜡包埋,连续切片。实验分组：随机抽取10张切片定为Ⅰ组,该组采用常规微波修复法;另取10张切片定为Ⅱ组,该组采用酶消化修复法。结果常规微波修复法,细胞染色在＋～＋＋之间,着色时间短,背景清晰。酶修复法,细胞染色介于＋＋～＋＋＋之间,着色时间长,时间上不易控制,背景颜色较微波修复浅。结论免疫组化中酶修复较常规热修复效果理想。     

实时荧光定量PCR检测贝氏柯克斯体方法的建立

目的建立检测贝氏柯克斯体的Real-Time PCR方法。方法根据贝氏柯克斯体特有的htpAB基因相关重复序列（IS1111a）进行PCR扩增片断485bp,以克隆的IS1111a基因片断作标准DNA模板,建立Real-Time PCR检测方法。结果建立的Real-Time PCR标准曲线的循环阈值（Ct）与模板拷贝数呈良好的线性关系（r=0.999）;重复性测试Ct变异系数CV≤6.1%;其灵敏性约为普通PCR的10倍;以其它相关立克次体和病原菌DNA为模板应用于该方法,结果均为阴性。结论所建立的Real-Time PCR方法具有很好的特异性、灵敏性和重复性,可代替普通PCR用于贝氏柯克斯体的感染早期的快速定性、定量检测。     

登革热病毒多重荧光PCR检测及基因分型方法的研究

目的 建立一种登革热病毒双靶基因多重荧光PCR检测方法,用于登革热病毒的实验室诊断和基因分型.方法 选取登革热病毒Ⅰ-Ⅳ型病毒保守区设计型特异性引物探针和通用型引物探针,评估多重荧光PCR检测方法的特异性、重复性和检测限;并对20份阳性样本进行检测.结果 20个登革热阳性核酸标本在通用型检测全部为阳性,特异性型别检测发现登革热病毒Ⅰ型10例、登革热病毒Ⅱ型3例、登革热病毒Ⅲ型3例、登革热病毒Ⅳ型4例;20名正常无症状人群标本提取的核酸和HIV、HCV和HEV通用型和特异性型别检测全部为阴性.梯度检测的变异系数均小于5％.对登革热Ⅰ-Ⅳ型病毒检测最低检测限达103 copies/ml.结论 本研究建立的登革热病毒双靶基因多重荧光PCR检测及分型方法具有特异性好、重复性好、快速易操作等优点,可用于登革热病毒的快速检测和基因分型鉴定.     

实时荧光定量PCR方法检测石蜡包埋组织microRNA表达的方法探讨

目的:探讨从石蜡包埋组织中运用实时荧光定量PCR(RQ-PCR)方法检测microRNA表达的可靠性和敏感性。方法:选取2005年至2010年从石河子大学医学院第一附属医院、新疆伊犁哈萨克族自治州友谊医院收集的97例福尔马林固定、石蜡包埋食管癌组织样本,提取组织总RNA,RT-PCR逆转录为cDNA,实时荧光定量PCR法检测microRNA表达。结果:97例食管癌组织样本中,RNA提取成功90例,7例失败,运用实时荧光定量PCR成功检测了83例microRNA表达,7例检测不准确。RNA提取成功率明显高于失败率,实时荧光定量PCR检出的定量准确例数高于定量不准确例数,P<0.05,差异具有统计学意义。结论:实时荧光定量PCR(RQ-PCR)方法是检测石蜡包埋组织中microRNA表达的一种有效方法。     

CHIKV Real-time PCR检测方法的建立及试剂盒研发

目的建立快速特异检测基孔肯雅病毒的Real-time PCR方法及试剂盒。方法根据发表在Genbank上15株基孔肯雅病毒基因序列全长,应用ClustalW2.0和DNAMAN8软件筛选出位于其E1基因上的种内保守种间特异的目的片段,并据此设计出最优引物。人工合成该基因片段并构建重组质粒,对重组质粒梯度稀释后,再利用SYBR Green I Real-time PCR的方法检测该特异基因的浓度,建立标准品曲线,用于临床上基孔肯雅病毒的早期诊断。结果琼脂糖凝胶电泳结果显示,标准品的PCR扩增产物的电泳条带长度与目标条带一致,测序结果显示与目标条带序列一致,说明引物与阳性质粒性能良好。经优化确定CHIKV荧光定量PCR反应体系中最佳的引物浓度为350 nmol/L,最佳的反应条件为：50 ℃ 2 min;95 ℃预变性2 min;以95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s,72 ℃ 1 min进行40个循环扩增,在72 ℃进行荧光采集。根据荧光定量PCR熔解曲线出现特异性单峰,并对黄病毒属成员登革病毒和寨卡病毒的检测为阴性,表明该检测方法特异性高;检测阈值达302 拷贝 ,显示敏感性好,重复试验的变异系数均小于0.1%,说明该实验设计稳定性良好。结论基于该方法的试剂盒具有特异性好、灵敏度高、重复性好、能够快速定量等优点,有利于临床上基孔肯雅病毒的早期诊断,具有良好的应用前景。     

EMA-qPCR检测活沙门菌方法研究

目的 为解决荧光定量PCR（qPCR）方法不能区分死菌和活菌的问题,探索一种快速定量检测“活的”沙门菌的技术路线。方法 将不同浓度叠氮溴化乙锭（EMA）作用于不同浓度的死/活沙门菌后,用qPCR检测沙门菌Ct值,确定EMA的最优使用浓度。在混合菌量为10⁶、10⁵、10⁴、10³ CFU/mL,活菌比例为0%、10%、30%、50%、70%、100%条件下,确定EMA处理过的活菌+死菌,未加EMA的活菌+死菌,未加EMA的活菌+生理盐水三组菌的Ct值,研究EMA-qPCR法对死/活沙门菌的区分能力。结果 EMA浓度低于50 μg/mL,EMA处理活菌组与EMA未处理活菌组的Ct值差异无统计学意义。综合考虑,EMA最优使用浓度为10 μg/mL。采用10 μg/mL EMA进行预处理,混合菌量为10⁶、10⁵、10⁴、10³ CFU/mL时得出的结果一致：活菌比例为0%,≤50%,>50%时,EMA处理过的活菌+死菌与未加EMA的活菌+死菌两组Ct值差异（ΔCt）分别为≥5,≥1,<1。同时,除活菌比例0%外,其他活菌浓度下,EMA处理过的活菌+死菌与未加EMA的活菌+生理盐水两组Ct值无明显差异。结论 菌量为10³~10⁶ CFU/mL时,通过10 μg/mLEMA作用,EMA处理过样品与未加EMA处理样品的ΔCt值≥1,可考虑样品中沙门菌活菌比例≤50%。     

3种HBV DNA荧光定量PCR试剂检测结果比较

目的 比较及评价3种HBV-DNA荧光定量PCR试剂检测结果的差异.方法 同时用3种HBV-DNA荧光定量PCR试剂对已知结果的质控血清、标准品及本院79份HBsAg阳性的临床标本进行检测,并对检测结果进行比较分析.结果 试剂A、B、C检测阳性率分别为41.77%(33例)、45.57%(36例)和41.77%(33例).3种方法结果一致者66例,总符合率83.54%.试剂A、B与试剂C检测结果相比差异有统计学意义(P<0.05),试剂A与B检测结果相比差异无统计学意义(P>0.05).试剂A与C的灵敏度、特异性均为77.78%、88.37%;试剂B灵敏度为89.66%、特异性80.00%.结论 试剂A与B总体性能优于试剂C,适于临床检测与筛查.实验室必须选择质量好且符合自己实验室要求、与本实验室仪器相匹配的试剂以保证检验质量.     

利用荧光定量RT-PCR和PCR方法检测结核分枝杆菌复合群

目的 建立一种新的检测结核分枝杆菌复合群的荧光定量试验方法 （R/P分析）,探讨R/P分析检测临床标本中结核分枝杆菌复合群的应用价值.方法 根据结核分枝杆菌复合群基因保守序列设计引物和探针构建质粒标准品.运用R/P分析检测54例确诊结核病人临床样本,检测的结果 同时与培养法、荧光定量PCR法进行比较.结果 不同临床标本用R/P分析诊断结核病,其敏感性高于荧光定量PCR法和培养法,阳性检出率分别为96.3%、83.3%和55.6%.结论 R/P方法 是一种快速、特异的直接检测方法,它可以区分结核分枝杆菌复合群的死菌与活菌,因此可以更好的指导医生进行治疗,更准确地做出公共卫生决策.     

实时荧光PCR检测蓝氏贾第鞭毛虫和隐孢子虫方法的建立

目的 建立贾第鞭毛虫和隐孢子虫的基因检测方法.方法 根据GenBank中贾第鞭毛虫和隐孢子虫相对保守序列,设计引物及其相应的Taqman探针.通过对引物和探针浓度、Taq酶以及反应条件等优化筛选后,建立检测贾第鞭毛虫和隐孢子虫的荧光PCR方法.结果 贾第鞭毛虫和隐孢子虫的检测结果为阳性,对其它DNA样本如日本血吸虫、刚地弓形虫、溶组织内阿米巴、旋毛虫和阴道毛滴虫的检测均为阴性.本法的敏感性高,可检测到10～102copies/μl的DNA浓度.结论 建立的基因检测方法,对贾第鞭毛虫和隐孢子虫的检测具有高度的特异性和敏感性,可用于饮用水和临床样本等的快速检测.