DNA微条形码技术在降解检材种属鉴定中的应用及法医学意义

【立题依据】 标准DNA条形码技术是基于COI基因序列分析而建立的一种物种鉴定方法,但由于目的基因扩增片段长达645bp,在法医物证降解检材中的应用受到限制。因此,本研究拟建立DNA微条形码技术,以解决法医物证特殊检材种属鉴定的难题。 【设计思路】 设计分别扩增不同近缘动物COI基因的通用引物,构建相应的复合扩增体系,并从种属特异性、林敏性、稳定性、案件适应性等方面进行验证。 【实验内容】 DNA提取及处理:有机溶剂法提取实验样本的基因组DNA;制备DNA<200bp的降解检材和两种动物DNA不同比例混合的混合检材。引物设计与合成:设计4对种属特异性引物和1对无种属特异性的ND3引物,并合成COI基因的标准引物。PCR扩增:①以10种动物基因组DNA为模板,分别用自行设计的4对引物进行扩增,以检验引物种属特异性;②以10种动物不同浓度基因组DNA为模板,分别用对应种属特异性的引物进行扩增,以检验引物扩增效能;③以降解检材基因组DNA为模板,分别用自行设计引物和标准引物进行扩增,以评估引物应用价值。PCR复合扩增:在确定自行设计引物特异性、扩增灵敏度的基础上,通过调整引物量和退火温度构建含有5对引物的复合扩增体系,并用于单一样本和混合样本基因组DNA的扩增。扩增产物检测:用聚丙烯凝胶电泳结合银染的方法检测各种动物模板DNA的扩增效果,以判定引物的扩增特异性和灵敏度,及降解检材和混合检材的扩增效果;用循环测序的方法获得各扩增产物的碱基序列,并通过BLAST软件与DNA数据库比对及遗传距离分析,判定检材的种属来源。 【实验材料】 常见家禽(鸡、鸭、鹅、鹌鹑、鸽子)和常见家畜(水牛、黄牛、山羊、绵羊、马、驴、犬)共7科18种动物及人类血液样本各5例。 【可行性】 (1)不同种属动物COI基因序列可从相应DNA数据库获得;(2)熟练掌握引物设计的操作方法和PCR技术;(3)具备本研究所需的各种仪器、设备和试剂。 【创新性】 为法医物证降解检材的种属鉴定提供一种有效的方法。     

细菌性眼内炎的病原分子诊断研究

目的 以16S rRNA部分基因直接测序为基础分析细菌性眼内炎中的病原菌,建立眼内标本病原菌非培养检测方法.方法 收集50例患者房水或玻璃体液标本,提取细菌DNA,16SrRNA基因通用引物PCR,扩增产物直接测序,通过核酸序列比对微生物种属鉴定,同时与传统方法进行比较.结果 50例标本中,直接涂片阳性22例(44%),细菌培养阳性13例(26%),PCR检测阳性28例(56%),成功测序22例,序列鉴定率为44%.16S rRNA基因序列鉴定与培养鉴定结果不完全吻合.结论 分子诊断对明确细菌性眼内炎感染有指导意义.     

DNA条形码技术在人体排出未知昆虫幼虫鉴定中的应用

目的 使用DNA条形码鉴定方法对两名儿童从尿道排出的不明昆虫幼虫进行鉴定,解决未知昆虫幼虫无法利用传统形态学鉴定方法进行鉴定的难题,为主诊医生后期制定针对性治疗方案提供科学依据。方法 以家长收集并送检的患儿从尿道排出的不明活体昆虫幼虫为材料,先进行图像采集和形态学描述,然后取部分昆虫幼虫组织提取基因组DNA,利用多细胞无脊椎动物线粒体细胞色素氧化酶I(COI)的通用引物进行DNA扩增,PCR产物直接从两端测序,DNA测序结果以MEGA6软件验证图谱确定为有效序列后,经拼接、去除通用引物序列,最终得到658 bp的COI基因片段碱基序列。上传数据与GenBank和BOLD数据库中的序列进行同源性比对,建立系统发育树。结果 序列测定结果与GenBank和BOLD中公布的白斑蛾蚋（Clogmia albipunctata）的COI序列相似性为100%。选取GenBank中与目的片段核苷酸序列比较所得相似性较高的7种物种序列,以红头丽蝇为外群,构建NJ树,发现昆虫幼虫的序列以及GenBank中的白斑蛾蚋聚为一类,毛蠓科的全部物种聚成一支,置信度高达100%。结论 根据实验结果可以判断这两名儿童...     

PCR直接测序法在脓肿分枝杆菌鉴定中的应用

目的探讨聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction,PCR）与DNA测序技术鉴定脓肿分枝杆菌的效果。方法利用细菌16S r RNA基因通用引物PCR扩增疑似分枝杆菌的16S r RNA基因的DNA片段并进行DNA测序分析。DNA测序获得序列经生物信息学比对分析获得相关分枝杆菌的信息;针对相关分枝杆菌分别设计非同源区域特异性引物对1 500 bp的克隆DNA片段扩增验证。结果细菌16S r RNA基因通用引物扩增获得约1 500 bp的DNA片段,但DNA测序仅获得其中部分DNA序列约296 bp;部分DNA序列经生物信息学比对分析后获得四种同源性高达98%的分枝杆菌信息,并且四种分枝杆菌的特异性引物对1 500 bp的克隆产物进行扩增后仅在脓肿分枝杆菌中获得特异性PCR产物。结论疑似结核患者体内的抗酸染色阳性菌为非结核分枝杆菌中的脓肿结核分枝杆菌,并且PCR直接测序法可快速鉴定细菌的种属。     

高分辨率熔解曲线在CRISPR基因编辑检测和基因型鉴定中的应用

目的 建立一种基于PCR和在线高分辨率熔解曲线（high-resolution melting curve, HRM）分析工具的检测方法,实现对DNA序列微小差异的快速检测。方法 在CRISPR基因编辑检测和基因型鉴定中,采用两步PCR,分别对目的片段进行扩增和富集,并通过免费在线软件对HRM进行分析。结果 HRM分析结果显示,本实验所设计的CRISPR慢病毒系统未能对COS7细胞中的RPE65基因进行有效的基因编辑;而在瘦素突变大鼠的子代基因型中,HRM可以明显区分杂合子和纯合子。结论 HRM能够快速鉴定CRISPR编辑和区分基因型。     

PCR-DGGE结合测序在检测混合细菌感染中的价值

目的探讨变性梯度凝胶电泳（Denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE）结合测序在检测混合细菌感染中的作用,为细菌多重感染的诊断提供新的思路。方法以3份临床培养鉴定为混合感染的胆囊穿刺引流液为对象,提取细菌总DNA并扩增16SrDNA-V3区,后进行DGGE分析,将所得条带切胶纯化再扩增,扩增产物进行测序及BLAST比对,比较比对结果与临床培养结果的一致性。结果DGGE可以很好地分离16SrDNA-V3区混合PCR产物,每一个扩增子的测序比对结果与临床培养结果一致。结论PCR-DGGE结合测序的方法可以很好地鉴定临床混合感染标本中的病原茵,可作为快速检测方法在临床应用。     

地高辛标记探针检测卫氏并殖吸虫的方法

目的 制备卫氏并殖吸虫线粒体细胞色素C氧化酶亚单位I(COI)基因和核糖体DNA第二间隔区(ITS2)地高辛标记探针,探讨其对并殖吸虫的种别鉴定和诊断的作用. 方法 利用引物分别体外扩增获得卫氏并殖吸虫目的基因后凝胶电泳鉴定并且胶回收纯化上述两个基因片段.将酶切后的COI基因和ITS2基因回收,地高辛标记成探针,尼龙膜上行斑点杂交观察. 结果 COI探针有较好的特异性和敏感性.ITS2探针缺乏特异性. 结论 尼龙膜斑点杂交结果显示卫氏并殖吸虫的COI基因片段可以作为种群鉴定的后备探针.     

15个STR基因座的种属特异性研究

目的研究15个STR基因座对常见9种动物的种属特异性，探讨其在法医学中的应用价值。方法对9种常见动物肌肉组织的DNA进行PCR扩增，ABI310遗传分析仪进行DNA分型，测定15个STR基因座的种属特异性。结果用15对SIR基因座引物分别对9种常见动物肌肉组织的DNA进行PCR扩增检测CSFIPO，B8S1179，D19S433基因座时，9种动物均有PCR扩增产物；检测1321S11，197S820，D13S317，D16S539，TPOX，D18S51，D5s818，FGA，D3S1358基因座时，部分动物有PCR扩增产物，其中TPOX，D21S11基因座扩增产物片段长度明显与人的不同。这9种动物在D2S1338、vWA、TH01基因座均没有扩增产物。结论在15个STR基因座中，3个基因座只对人DNA有扩增产物，有较好的种属特异性；9个基因座对人和部分动物均有扩增产物，但产物的片段大小与人不同，在进行个人识别时，可以用其分析DNA的种属来源；3个基因座对人和动物均有扩增产物，且片段长度相近，在进行个人识别时，应先作DNA种属来源检查。     

rDNA⁃ITS序列分析鉴定皮肤癣菌的应用评价

目的：探讨对核糖体RNA（ribosomal RNA,rDNA）内转录间隔区（internal transcribed space,ITS）的基因扩增测序技术在皮肤癣菌鉴定中的应用价值。方法：从39株临床收集的皮肤癣菌临床标本和经培养后的标本中分别提取DNA,应用通用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增和基因测序,测序结果在NCBI的基因库中查询,通过BLAST工具比对分析进行rDNA?ITS序列分析分子鉴定。同时根据形态特征、生长特性以及生理生化指标对经培养后的标本进行表型鉴定,并与分子鉴定结果相比较。结果：两组标本均成功扩增到ITS靶基因,经测序分析,临床标本和经培养后标本rDNA?ITS序列分析结果一致,与表型鉴定结果相吻合。结论：直接从临床标本中提取致病菌DNA并进行ITS基因序列扩增和测序分析可快速、有效鉴定皮肤癣菌。     

用PCR扩增16SrRNA基因鉴定甲型副伤寒沙门菌细胞壁缺陷突变株

目的: 探讨甲型副伤寒沙门菌细胞壁缺陷突变株的检测与鉴定方法.方法:提取甲型副伤寒沙门菌细胞壁缺陷突变株及其亲代细菌型的染色体DNA,根据甲型副伤寒沙门菌的16SrRNA基因保守序列设计引物,进行PCR扩增,对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳与分析.结果:甲型副伤寒沙门菌细胞壁缺陷突变株16SrRNA基因的PCR扩增产物16SrDNA,在230 bp处出现与其亲代细菌型一致的DNA条带和图谱.结论:甲型副伤寒沙门菌的细胞壁缺陷突变株虽然丧失了常规细菌学方法可检测的绝大多数表型特征,但采用聚合酶链反应方法检测该序列,有利于检测和鉴定不能自发返祖的细胞壁缺陷甲型副伤寒沙门菌.     

Identification of Streptococcus species and Haemophilus influenzae by direct sequencing of PCR products from 16S-23SrDNA intergenic spacer regions

目的：利用16S-23SrRNA间区的特征建立一种简单、快速的细菌分类方法。方法：以化脓性链球菌16SrRNA的3'端和23SrRNA的5'端的保守区中合成3对引物,PCR扩增16S-23SrDNAISRs,纯化后直接测序,在GenBank上查找对应细菌的ISRs序列。用DNAMAN软件进行系统进货分析。结果：链球菌属为单拷贝16S-23SrRNAISRs片段,编码1个tRNA^Ala基因。流感嗜血杆菌各生物型出现2个大小相似的ISRs片段。与GenBank上的资料比较,7株链球菌归属5个种,流感嗜血杆菌均为b型。结论：ISRs作为细菌分类新的目标基因具有属、种、型和株特异性与灵敏性。     

16SrDNA测序在细菌性重症肺炎痰液致病菌分析中的应用

目的 采用16S rDNA测序,分析重症肺炎痰液中致病菌构成,探索病原学诊断的新方法.方法 收集细菌性重症肺炎患者的痰液标本,运用聚合酶链反应（PCR）扩增及高通量测序技术,对标本中病原菌16SrDNA V3～V5区进行多样性分析.结果 测序显示痰液样本含有的物种种类相对较多,还存在较多未被测序检测到的物种,优势菌属主要为链球菌属、变性菌属、不动杆菌属、鞘氨醇单胞菌属、普氏菌属、克雷伯菌属、假单胞菌属、水杆菌属、棒状杆菌属等.结论 细菌性重症肺炎痰液致病菌种复杂多样,物种丰富,16S-rDNA测序是临床实践中一种新的尝试.     

用PCR扩增16Sr RNA基因鉴定幽门螺杆菌的细胞壁缺陷型

目的：探讨幽门螺杆菌及其稳定L型的检测与鉴定方法。方法：用抗生素诱导、滤菌器过滤、非高渗透压培养基培养获得幽门螺杆菌稳定L型纯培养物,对幽门螺杆菌及其稳定L型进行16SrRNA基因的PCR扩增及序列测定。结果：幽门螺杆菌及其稳定L型的16SrRNA基因PCR扩增产物经1%琼脂糖电泳,在紫外检测仪下可见550 bp的DNA条带,测序结果经NCB I B last分析比对,基因同源性可达100%。结论：16SrRNA基因PCR检测可用于幽门螺杆菌L型及其他形态变异的菌种鉴定。     

16S rDNA序列分析在临床不常见细菌鉴定中的初步应用

目的建立细菌16S rDNA序列分析技术并探讨其在临床不常见细菌鉴定中的应用价值。方法收集经全自动微生物分析系统鉴定其可靠率在99%及以上的常见细菌10株和常规方法难以鉴定或少见菌17株,通过PCR扩增16S rDNA v3-v4区基因片段并进行序列测定,序列与16SpathDB 2.0数据库上已知细菌的16S rDNA序列进行比对分析确定细菌种属。当v3-v4序列片段不能明确鉴定细菌时,结合16S rDNA长片段测序及管家基因dnaJ和rpoB的序列做进一步分析。结果经16S rDNA v3-v4区序列分析,10株(100%)临床常见菌都能鉴定到种水平,其可靠性大于98.0%。17株不常见菌株中,10株(58.8%)细菌只与1种菌相似性大于98.0%,成功鉴定到单个种水平;6株(35.3%)细菌与不止1种菌的相似比大于98.0%;1株菌与已知菌相似性在96.0%~98.0%之间只能鉴定到属(棒状杆菌)。进一步结合16S rDNA长片段及管家基因dnaJ和rpoB的序列分析,所有菌株均可鉴定到单个种水平。结论结合16S rDNA和管家基因序列分析,可用于临床常见及不常见细菌的分子鉴定。     

高分辨率熔解曲线法检测中国5种常见β-地中海贫血突变

目的探讨高分辨率熔解曲线法（HRM）检测中国5种常见B．地中海贫血突变的可行性。方法应用HRM法检测中国5种常见B．地中海贫血突变,检测结果为纯合子的标本进行基因测序验证。结果HRM法能准确区分-28（c．-78A〉G）、Codon17（c．52A〉T）、Codons41／42（c．126—129delCTTT）、Codons71／72（c．216—217insA）及IVS—II-654（c．316—197C〉T）的纯合、杂合突变以及野生型标本,测序结果与HRM法检测结果一致。结论HRM法检测中国5种常见何天文-地中海贫血突变具有简便、快速、灵敏度高等优点,有望成为临床尤其是产前诊断领域B．地中海贫血突变筛查的优选方法。     

应用HRM法检测肺癌患者循环DNA中表皮生长因子受体基因突变

目的 探讨高分辨熔解曲线(HRM)法检测肺癌患者血浆循环DNA中表皮生长因子受体(EGFR)基因突变的可行性.方法 采用HRM法对含不同比例EGFR基因突变型质粒的系列混合样本进行检测,以评价其灵敏度.应用HRM法检测2009年9月至2010年5月收治的96例肺癌患者血浆循环DNA中EGFR基因19、21外显子突变状况,并与基因测序法的结果比较分析.结果 HRM法可检出系列混合样本中突变型质粒比例为5%的突变,其检测灵敏度达5%.经HRM法,在96例肺癌患者中检测出17例发生了EGFR突变,突变率为17.7%,其中外显子19和21突变分别占88.2%(15/17)和11.8%(2/17);经基因测序法验证,结果完全一致.结论 HRM法检测EGFR简单易行,快速,敏感性较高,可作为临床EGFR突变筛查的优选方法.

Abstract：

Objective To discuss the practicability of detecting epidermal growth factor receptor (EGFR) mutations in plasma circulating DNA of lung cancer patients by high-resolution melting (HRM).Methods The sensitivity of HRM was analyzed by the detection of samples containing different proportions of EGFR-mutated plasmids.The mutations in exons 19 and 21 of EGFR were detected by HRM in 96 lung cancer patients from September 2009 to May 2010.And the results of HRM were compared with those of sequencing.Results The HRM detection could identify the EGFR mutations in a proportion of 5% of mutated plasmid DNA.And the EGFR mutations were detected in 17 (17.7%,17/96) cases.Among which,the number of exons 19 and 21 mutations was 15 (88.2%,15/17) and 2 (11.8%,2/17)respectively.The results of sequencing were consistent.Conclusion The HRM analysis may be an optimal method for clinical screening of EGFR mutation due to its simplicity and promptness with a high sensitivity.     

广西红树林土壤放线菌的分离和DNA的提取方法

目的 利用酶法提取红树林放线菌DNA.方法 利用溶菌酶破壁、蛋白酶K和SDS除蛋白,提取红树林放线菌DNA,所得DNA可直接进行16SrDNAPCR扩增检测,对放线菌进行鉴定.结果 成功地从红树林土壤中提取放线菌DNA.结论 本方法提取到的放线菌基因组DNA结构完整,可以直接进行PCR扩增等分子生物学操作,为高通量筛选和鉴定放线菌奠定基础.     

高分辨熔解曲线分析慢性骨髓增殖性疾病JAK2V617F基因突变

目的研究慢性骨髓增殖性疾病（CMPDs）获得性JAK2V617F突变检测方法。方法应用高分辨熔解曲线分析技术（HRM）,对前期经等位基因特异性PCR法（AS—PCR）分析过的36例CMPDs样本进行JAK2V617F基因突变检测,并与AS—PCR检测情况进行比较分析,结果经测序验证。结果36例CMPDs样本均得到可供分析的JAK2V617F基因突变HRM检测结果,与AS—PCR法相比较,二者的符合率为97％（35,36）;只有一份样本结果不相符,经测序验证,结果与HRM检测相一致;HRM检测的敏感性和特异性均达100％。结论应用HRIM技术检测JAK2V617F突变快速简便、而且敏感,是一项适合临床开展的新方法,可用于临床辅助CMPDs的诊断。     

rRNA基因(rDNA)序列分析在中药品种鉴定中的应用及研究进展

rRNA基因(rDNA)序列分析方法用于植物系统分类与进化研究有较高的可靠性。近年来中药品种的鉴定也越来越多地使用DNA指纹标记(如RAPD、RFLP、AFLP、SSR、ISSR、SSLP等)和DNA序列测定。通过详述DNA序列测定中核基因组的rRNA基因(rDNA)方法和2000年以来在中药鉴定中的应用，认为高等植物rRNA基因上的18SrDNA、ITS及5SrDNA片段常具有变异位点，用于中药品种鉴定和伪品鉴别及寻找新药源等领域有广阔前景。