体外筛选针对大鼠Toll样受体4 mRNA的小分子干扰RNA序列

目的:筛选能高效干扰大鼠Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)mRNA的最佳小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)序列.方法:克隆大鼠TLR4基因全长,将TLR4基因与含增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)的质粒pEGFP-C1重组,构建pEGFP-rTLR4,化学合成法合成3对干扰大鼠TLR4的siRNA后,将3对siRNA、阴性对照siRNA和干扰EGFP的siRNA分别与pEGFP-rTLR4经Lipofectamine2000共转染HEK-293细胞株,通过倒置相差显微镜和流式细胞仪观察EGFP的荧光强度.结果:与阴性对照组相比,3对针对TLR4的siRNA及针对EGFP的siRNA均明显抑制EGFP的荧光表达(P＜0.05).其中尤以siRNA2(核苷酸序列为5'-GTC TCA GAT ATC TAG ATC T-3',位于TLR4基因序列的1 352～1 370位)的抑制效果最强,干扰效率＞75%.结论:成功筛选出体外可高效干扰大鼠TLR4mRNA的siRNA片段.     

小分子干扰RNA分子化学修饰研究进展

RNA干扰是指转录后的基因沉默现象,可使基因沉默的小分子干扰RNA（siRNA）为基因治疗提供了又一个选择。为了实现其基因治疗价值,根据siRNA的作用机制和反义核酸修饰所取得的经验,为优化其药学性质和有效转运,进行了各种改进。其中,载体修饰和化学方法修饰siRNA是优化其性质的重要方法,本文对两种方法进行了简要的综述。     

结缔组织生长因子特异性小分子干扰RNA的筛选及其在抗肝纤维化中的作用

目的:设计和合成针对抗肝纤维化关键基因结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)的特异性小干扰RNA( siRNA),并筛选高效的CTGFsiRNA抗肝纤维化序列,探讨其通过尾静脉注射是否具有抗大鼠肝纤维化作用.方法:①筛选高效的CTGF siRNA序列.②干预肝纤维化模型大鼠.选取雄性SD大鼠30只,随机分成5组,分别为空白对照组尾静脉注射生理盐水8周;模型组腹腔注射40％ CCl4(3 ml/kg)及尾静脉注射生理盐水,1次/3d,连续8周;预防组腹腔注射40％ CCl4及尾静脉注射CTGF siRNA(0.1 mg/kg),1次/3d,连续8周;2周治疗组腹腔注射40％ CCl4 2周,后给予CTGF siRNA及CCl4 6周;4周治疗组腹腔注射40％ CCl4 4周,后给予CTGFsiRNA及CCl4 4周.于最后一次CC14注射3天后取血及组织标本,检测肝纤维化指标,应用Real-Time PCR及Western印迹法检测CTGF mRNA及蛋白质在大鼠肝组织表达,应用Masson染色检测肝组织纤维化.结果:与模型组(0.544±0.019)相比,预防组(0.105±0.003)及治疗组(0.190±0.006)大鼠肝组织CTGF mRNA和蛋白质表达显著下调(P＜0.05),肝组织炎症和坏死及纤维化明显减轻,肝纤维化指标显著降低(P＜0.05).4周治疗组与模型组相比各指标降低,与预防组及2周治疗组相比各指标相对升高(P＜0.05).结论:成功筛选出高效的CTGF siRNA,且经尾静脉注射CTGF siRNA能显著抑制大鼠体内肝脏CTGF基因表达,并能有效防治大鼠肝纤维化,对于病程较长的肝纤维化也有一定的治疗作用,提示CTGF siRNA在抗肝纤维化治疗中有重要作用.     

靶向心肌细胞TLR4基因小干扰RNA载体构建

目的:设计合成有效靶向Toll样受体4(TLR4)基因小干扰RNA(siRNA)表达载体,且挑选TLR4基因稳定沉默心肌细胞。方法:依据RNA干扰(RNAi)序列设计原则,以TLR4基因为靶基因,合成3对小发夹RNA(shRNA)寡核苷酸链,经退火、与线性化pSilence 2.1-U6neo质粒连接、酶切、测序并鉴定。脂质体法转染心肌细胞,新霉素(G418)加压筛选并收集稳定表达质粒的心肌细胞,并观察光镜下心肌细胞形态。RT-PCR及Western Blot法检测收集的心肌细胞TLR4mRNA和蛋白的表达,确定siRNA对TLR4的抑制效率。结果:测序鉴定插入发夹样序列正确,成功构建了TLR4基因siRNA表达载体;并获得了稳定沉默TLR4的心肌细胞。未见细胞毒性形态学改变。多种方法均证实siRNA作用于TLR4基因后,心肌细胞TLR4 mRNA和蛋白表达均被抑制,其中pSilence2.1-siTLR4-1抑制作用最强。结论:成功构建了靶向TLR4基因siRNA表达载体,并有效抑制心肌细胞TLR4表达。     

肺癌相关基因的RNA干扰实验研究

目的为研究点突变的PP2Aα基因对单克隆抗体N-35相关蛋白N35表达的影响，探讨其作为肺癌基因治疗侯选靶基因的可行性．方法将云南个旧肺腺癌细胞系GLC-82作为靶细胞，点突变的PP2Aα基因作为靶基因，设计并构建shRNA质粒表达载体，通过阳离子脂质体导入GLC-82细胞，经G418筛选阳性克隆，采用蛋白质印迹法检测N35表达量的变化．结果所有shRNA质粒表达载体均成功导入GLC-82细胞并能使它们在含G418培养基中长时间生长：[第一段]     

RNA介导染色质水平的基因沉默

近年来,一种 RNA 水平的基因沉默引起了研究者的高度关注,这便是由双链 RNA 表达引起的 RNA 干扰。双链RNA 在体内经过扩增和切割变成单链小分子 RNA,结合到相应序列的 mRNA 转录本并引起 mRNA 被核酸内切酶识别并切割,从而导致这些 mRNA 降解而无法翻译出产物,从 mRNA 水平关闭基因表达。这个过程大致可以分为双链 RNA 的形成、小 RNA的形成和信号放大以及异染色质的形成三个步骤。     

HDAC2基因RNA干扰载体的构建

目的:构建组蛋白去乙酰化酶2 (HDAC2)基因RNA慢病毒干扰质粒载体.方法:对比HDAC2基因序列,设计并合成短发夹RNA(shRNA)干扰靶点序列,克隆入经AgeI与EcoRI双酶切后的RNA干扰载体pLKO.1-puro,构建pLKO.1-HDAC2-shRNA重组质粒,采用酶切法和测序法验证重组质粒.结果:成功退火合成3对短发夹RNA序列并将其克隆入pLKO.1-puro载体中,构建重组质粒pLKO.1-HDAC2-shRNA1、pLKO.1-HDAC2-shRNA2及pLKO.1-HDAC2-shRNA3,经酶切鉴定和测序验证重组质粒载体与预期靶序列相同.结论:成功构建HDAC2-shRNA慢病毒干扰载体,为进一步研究HDAC2的功能及应用提供有效工具.     

基因沉默的维持——长效RNA干扰

自揭示了哺乳动物细胞中的RNA干扰（RNAi）现象以来，对其进行了大量的研究与资金投入，期望将其发展成一种切实可行的治疗手段。毫无疑问，RNAi是最具发展潜力的基因治疗策略。由于许多采用RNAi治疗的疾病需要长期用药，因此，有关RNAi类药物长期应用的安全性问题成为关注重点。     

CMV启动子调控的VEGF-shRNA表达载体的构建及有效干扰序列的筛选

目的:构建针对人VEGF基因的小干扰RNA(siRNA)的表达载体,实现CMV启动子调控,转染肿瘤细胞后观察其对VEGF基因的干扰作用,并筛选出有效的VEGF-shRNA.方法:设计三对VEGF靶向的发夹状shRNA,依据设计合成两条互补的寡核苷酸链,退火后连接入质粒pDC311-SV40-RC中,转化扩增后进行序列测定.用脂质体包裹转染人骨肉瘤细胞U-2 OS,分别培养3d和7d后收集细胞培养上清液,ELISA检测上清中VEGF蛋白的表达.结果:将针对VEGF基因的siRNA的双链寡核苷酸片段成功克隆到pDC311-SV40-RC载体,经过阳性菌落PCR鉴定与测序,结果正确;转染U-2 OS细胞后,ELISA方法检测蛋白表达水平证实干扰序列3能有效降低VEGF的表达.结论:成功构建了CMV启动子调控的针对VEGF基因的siRNA载体,转染肿瘤细胞后可抑制VEGF的表达,并筛选出有效的干扰序列.     

基因沉默与RNA干扰

生物体经过漫长的进化和自然选择后逐渐形成了对异常基因活动进行监控和防御的能力,这种天然免疫机制在最近几年的研究中得到了进一步认识。所谓异常基因活动是指病毒基因侵入和复制,转座子和转基因表达。正常基因活动几乎不产生双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA),而异常基     

RNA干涉对乙型肝炎病毒复制和表达的影响

目的：观察HBV S区和C区特异性的小发夹RNA（shRNA）表达载体对HepG2.2.15细胞中HBV复制和表达的影响。方法：采用含有pol Ⅲ启动子的真核表达载体pSilenceCircle-U6构建针对HBV S区和C区的特异性shRNA表达质粒SC-S和SC-C。实验设立SC-S组、SC-C组、无关对照SC-N组和空白对照组,采用不同浓度的重组载体转染HepG2.2.15细胞,并作用不同时间。应用ELISA方法检测细胞上清液中的HBeAg和HBsAg,用斑点杂交方法检测细胞上清中的HBV DNA。结果：成功构建了含目的序列的重组质粒SC-S和SC-C。SC-S对HBeAg和HBsAg表达的抑制率明显高于SC-C;随着给药浓度的增加,SC-S对HBeAg和HBsAg表达的抑制率逐渐增强;SC-S转染HepG2.2.15细胞后第3天产生明显抑制效应,对HBeAg及HBsAg表达的抑制率在第6天达高峰,第9天抑制率仍较高。斑点杂交结果显示,SC-S对HBV复制的抑制效应强于SC-C。结论：构建的HBV S区和C区特异性shRNA表达质粒有明显、高效抑制HBV复制和表达的作用。     

Nek2基因沉默对卵巢癌SKOV3细胞侵袭能力的影响

目的研究RNA干扰Nek2表达对卵巢癌SKOV3细胞侵袭能力的影响以及相关的分子机制。方法设计合成3条针对Nek2基因的siRNA,转染至SKOV3细胞中,采用Real-time RT-PCR和Western blot技术筛选出抑制效率最高的Nek2-siRNA序列,用Transwell方法检测转染该序列的SKOV3细胞侵袭能力的改变,并用Western blot方法检测Nek2-siRNA转染后SKOV3细胞中MMP-2、MMP-9和TIMP-1蛋白表达的变化。结果①RNA干扰序列2对SKOV3细胞中Nek2的抑制效果最明显;②与未转染组和阴性对照组相比,转染了Nek2-siRNA的SKOV3细胞侵袭能力明显下降(P<0.01);③Western blot检测表明,与未转染组和阴性对照组相比,Nek2-siRNA转染48 h后SKOV3细胞中MMP-2、MMP-9的表达明显下调,而TIMP-1的表达明显上调(P<0.01)。结论 Nek2-siRNA能有效得沉默SKOV3细胞中Nek2的表达,通过下调MMP-2、MMP-9的表达,上调TIMP-1的表达,从而抑制SKOV3细胞的侵袭转移。     

甲基化CpG 结合蛋白2（MeCP2）与神经精神疾病#br#

甲基化CpG结合蛋白2（methyl-CpG binding protein 2,MeCP2）是特异性识别甲基化CpG二核苷酸的转录抑制因子。MeCP2通过参与调节转录激活、调节染色体构象、RNA剪接等调控胚胎发育、神经发生、疾病发展等过程。研究表明,MeCP2在神经精神疾病扮演重要角色,可能成为神经精神疾病新的治疗靶点。因此,该文对MeCP2在Rett综合征、抑郁症、成瘾、孤独症和精神分裂症等疾病中的最新进展进行综述。     

衔接蛋白2基因siRNA表达载体的构建及鉴定

目的：构建针对衔接蛋白2的μ2亚单位(AP2-μ2)的短链干涉RNA(siRNA)及其表达载体,转染细胞后观察其对AP2-μ2基因的干涉作用。方法：设计AP2-μ2靶向的发夹状siRNA,据此设计合成3条互补的寡核苷酸链,退火后分别连接到pSilencer 3.1 neo H1载体,转化扩增后进行序列测定。待转染细胞分为对照组、Scramble plasmid、AP2 plasmid-1、AP2 plasmid-2和AP2 plasmid-3组。用脂质体转染法将3组siRNA重组质粒与阴性对照质粒(Scramble plasmid)转染大鼠心肌细胞株H9C2,通过RT-PCR法检测AP2-μ2基因表达水平的变化。结果：合成的6条寡核苷酸单链凝胶电泳显示多个电泳条带,分别退火后,产物经凝胶电泳显示形成单一条带。双链DNA模板与载体质粒连接后,用BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切,凝胶电泳可见4　300和66 bp的酶切片段。DNA测序连接的核酸序列与设计序列一致,表明AP2-μ2基因的3条siRNA载体构建成功。RT-PCR检测,在AP2 plasmid-1组,转染的H9C2细胞中AP2-μ2的基因表达水平较阴性对照组降低约96%。结论：成功地构建了针对AP2-μ2基因的3条siRNA载体,其中AP2 plasmid-1转染细胞后可显著抑制AP2-μ2基因表达。     

大鼠Nogo受体基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建大鼠Nogo受体(Nogo receptor,NgR)基因RNA干扰慢病毒表达载体,并观察其对293T细胞感染效率.方法: 应用基因工程技术,首先构建携带目的基因siNgR199的慢病毒穿梭质粒表达载体,然后使用慢病毒包装质粒混合物和构建好的慢病毒穿梭质粒共转染293T细胞,转染48 h后收集上清离心过滤后冰浴保存,最后进行病毒滴度测定,与标准病毒液分别感染293T细胞,按MOI值分为5个梯度:1、3、5、10、20,以确定病毒滴度及适合感染的MOI值.其中采用PCR方法对重组载体进行鉴定,利用绿色荧光蛋白作为报告基因,对病毒滴度和感染效率进行检测.结果: 酶切鉴定及PCR结果与病毒载体的预期结果一致,病毒滴度达1×108 ifu/m1,适合感染的MOI值为3.结论: 应用基因工程技术,成功构建了大鼠siNgR199慢病毒表达载体,为应用于治疗脊髓损伤后轴突再生创造了条件.     

RNA干扰技术抑制类风湿关节炎成纤维细胞COX-2合成

目的 体外合成针对人环氧化酶-2（hCOX-2）的小分子干扰RNA（siRNA）,并转染人人滑膜成纤维细胞,通过比较不同siRNA抑制COX-2 mRNA表达、COX-2蛋白合成以及下游产物PGE2水平,旨在确定特异性阻断人滑膜成纤维细胞COX-2的siRNA.方法 分离、培养和传代人类风湿关节炎（类风关）滑膜成纤维细胞.设计合成4条针对hCOX-2 mRNA siRNA（1#-4#siRNA）,1条随机序列siRNA.设立1#-4#siRNA和随机序列siRNA组（NC）及未转染对照组（CTL组）.应用Lipofect AMINE 2000将上述siRNA分别转染人滑膜成纤维细胞,4 h后各培养孔加入终浓度为100 nmol/L的佛波酯.转染36 h、48 h后,各组提取蛋白质和总RNA,应用RT-PCR检测hCOX-2 mRNA表达水平,通过Western Blot检测hCOX-2蛋白表达水平.采用ELISA方法检测各组上清液PGE2的水平.结果 转染36 h,PCR结果显示,CTL、NC、1#siRNA、2#RNA、3#RNA、4#siRNA、阳性对照HeLa细胞组hCOX-2 mRNA电泳条带密度值分别为1、0.72、0.3、0.25、0.4、0.04、2.1.Western Blot结果提示上述各组hCOX-2蛋白密度值分别为1、1.04、0.52、0.39、0.9、0和2.48.转染48 h后,各组hCOX-2蛋白条带密度值分别为0.05、0.52、0.51、0.9和0.15.转染24 h、48 h和72 h后,4#siRNA组培养上清液PGE2的水平较其他各组低.结论 4#siRNA能有效抑制人滑膜成纤维细胞COX-2 mRNA表达和COX-2蛋白的合成,且上清液中PGE2水平最低,证实4#siRNA能特异性阻断COX-2在滑膜成纤维细胞表达.     

小干扰RNA特异性抑制肺肿瘤细胞A549中绿色荧光蛋白基因表达

目的：探讨绿色荧光蛋白(green fluorescence protein，GFP)特异的小干扰RNA(small interference RNA，siRNA)对肺肿瘤细胞A549中的GFP基因表达的抑制作用，建立以真核表达载体释放生成特异基因siRNA的方法。方法：构建mU6启动子驱动的含有GFP特异siRNA的真核表达质粒，转染A549肺肿瘤细胞，观察共转染时不同剂量siRNA对GFP的抑制效应。结果：针对GFP核酸序列设计的特异性siRNA GFP-siRNA可有效抑制其表达，并当比例为1：1时效果最佳，而空质粒载体及无关RNAi无此效应。结论：以mU6为启动子的含特异RNAi的质粒可作为抑制特异基因表达的一种新的技术手段，并且为研究基因功能的一条有效途径。     

特异性小干扰RNA抑制诱骗受体3在结肠癌SW480细胞表达的研究

目的研究特异性小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对诱骗受体3(decoy receptor 3,DcR3)基因在人结肠癌SW480细胞系中的抑制作用。方法设计特异性的DcR3 siRNA序列;构建DcR3的pSUPER表达质粒并鉴定,鉴定成功后用于转染SW480细胞。以RT-PCR的方法检测细胞转染后DcR3 mRNA的表达;以Western blotting的方法检测DcR3蛋白的表达情况,并作统计学处理。结果与对照组相比,本实验设计两段siRNA对SW480细胞中DcR3 mRNA及蛋白表达的抑制作用明显,实验细胞DcR3 mRNA及蛋白表达显著下降(P<0.01)。结论针对DcR3的siRNA质粒转染真核细胞后可抑制其mRNA及蛋白表达,为进一步探讨DcR3的功能及封闭DcR3基因表达而治疗肿瘤奠定了实验基础。     

iRNA:一种新兴的肿瘤治疗方法

干扰RNA不仅是基因功能研究的一种工具,同时也成为一种通过特异调控基因达到减轻病理的手段。基于前期的体内外实验研究,干扰RNA将用于阐明肿瘤发病机制和开发治疗手段等方面。通过特异下调相关基因达到治疗的作用。然后一些重大问题,诸如体内导入,目的基因的不完全抑制,非特异免疫应答,旁观者效应等,仍将是干扰RNA成功应用于临床之前面对和必需克服的障碍。