流感疫苗促进髓系白血病骨髓细胞来源树突状细胞的功能

目的: 研究流感疫苗对髓系白血病骨髓源性树突状细胞（dendritic cells,DCs）功能的影响及其机制。方法：分离髓系白血病患者\[急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia, AML)19例, 慢性髓细胞白血病（chronic myeloid leukemia,CML) 8例\]骨髓单个核细胞（mononuclear cell,MNC）,用GMCSF和IL4诱导7 d,获得未成熟白血病DCs,然后加入全病毒灭活流感疫苗（whole inactivated influenza vaccine, WIV）、裂解病毒流感疫苗（split influenza vaccine,SIV）或TNFα继续培养24 h。R显带法分析DCs染色体核型,流式细胞仪检测DCs表型,ELISA法测定DCs培养上清IL12的水平,CCK8法检测DCs诱导的CTL对自体白血病细胞的细胞毒作用。结果：19例AML患者中的15例及8例CML患者的MNC全部成功诱导出DCs。与TNFα刺激的白血病DCs相比,流感疫苗刺激的白血病DCs表面分子（CD80、CD83、CD86、HLADR）表达明显上调（P<005）,培养上清中IL12的分泌水平明显增加（P<0.05）,其诱导的CTL可显著杀伤自体白血病细胞（P<0.05）;WIV刺激的DCs在表型、IL12分泌水平及细胞毒作用方面均较SIV刺激的DCs显著增高（P<0.05）。结论： 流感疫苗促进髓系白血病源DCs表型成熟及IL12的分泌,增强其诱导的CTL对自体白血病细胞的杀伤作用。     

肿瘤抗原负载的树突状细胞对肝癌肿瘤浸润淋巴细胞体外抗瘤作用的影响

目的： 研究肿瘤抗原负载的树突状细胞（DCs）对原发性肝癌肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)体外增殖和抗瘤作用的影响。 方法： 将自体肿瘤细胞匀浆粗提物(Tuly)与原发性肝癌患者外周血来源的DCs共培养以制备肿瘤抗原负载的DC(DCTuly)，将DCTuly与自体TILs在低浓度IL2(100 U/ml)中共培养，用FCM测定DCTuly 的表型以及与DCTuly混合培养前后的TILs表型，并计数TILs。用LDH法测定TILs的细胞毒作用。ELISA法检测TILs培养上清中IFNγ和TNFα的含量。 结果： DCTuly表面CD1a，CD83，CD80，CD86，CD40和HLA－DR分子表达水平增高（P<0.05）；DCTuly明显诱导TILs的增殖(P<0.01)及对自体肝癌细胞的细胞毒作用 (P<0.01), CD3+TILs增多（P<0.05）， CD4+TILs比例较混合前升高(P<001)，但仍以CD8+TILs为主。与DCTuly混合培养后第1,2天，TILs分泌IFNγ和TNFα的量明显提高(P<0.01)。 结论： 负载肿瘤抗原的DCs可促进TILs的增殖，增强TILs的特异性抗肿瘤活性。     

细胞因子诱导的杀伤细胞对宫颈癌细胞的体内外杀伤效应

目的：探讨细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokineinduced killer cells,CIKs）对宫颈癌CasKi和Hela细胞的体内外杀伤效应。方法：从宫颈癌患者的外周血分离单个核细胞,以改良方法（不加IFNγ,只加IL2 和antiCD3抗体）刺激扩增得到CIKs,用流式细胞仪分析CIKs表型。ELISA法检测CIKs培养上清中IFNγ、IL2 和TNFα的分泌水平。LDH释放法检测CIKs对CasKi和HeLa细胞的杀伤作用。建立荷CasKi或Hela细胞小鼠模型,以1×106或1×107个CIKs小鼠静脉注射治疗,每周1次,连续治疗3周,检测小鼠移植瘤的体积和重量。结果：在抗CD3抗体和IL2的刺激下,宫颈癌患者外周血单个核细胞被诱导培养成CIKs,其中CD3+CD56+细胞得到大量扩增。PHA激活后,CIKs产生大量的IFNγ和TNFα,而IL2的分泌量较少。被激活的CIKs可显著地杀伤宫颈癌CasKi细胞和HeLa细胞,最大杀伤率分别达（43.2±1.8）%和（46.2±15）%,且呈剂量依赖性。体内抗肿瘤实验结果显示,CIKs能显著抑制小鼠皮下宫颈癌移植瘤的生长（P<0.01）。结论：本实验的改良方法能有效制备CIKs,该CIKs在体内外对宫颈癌CasKi 和 Hela细胞有明显的杀伤效应。     

肺癌患者外周血树突状细胞的生物学特性研究

目的：探讨肺癌患者外周血来源的树突状细胞（dendritic cells, DC）生物学特性。方法：从肺癌患者外周血分离获得单个核细胞，用细胞因子GMCSF (100 μg/L)，IL4 (50 μg/L)体外培养诱导。凋亡肿瘤细胞负载24 h后加入TNFα（10 μg/L）或CD40激发型单抗于培养DC中，继续诱导3～4 d。分别测定DC的表型、DC摄取抗原能力；混合淋巴细胞反应（MLR）对T细胞增殖能力的测定；细胞计数和3HTdR掺入观察DC对T细胞的激发和扩增效应，并与健康志愿者外周血来源的DC进行比较。结果： 患者外周血单个核细胞和正常人外周血单个核细胞来源的DC均高表达CD1α，CD83，CD80，CD86和HLADR等DC的相关抗原和共刺激分子；患者的未成熟DC能有效摄取FITCDextran，经TNFα或CD40激发型单抗激发诱导后，成为成熟和有功能的DC,几乎完全失去对抗原的摄取能力，与健康人外周血来源DC组相比无明显差别(P>0.05)；患者单个核细胞来源的DC在体外具有激发自体和同种异体外周血T细胞增殖的能力。结论：肺癌患者的外周血来源单个核细胞可以诱导成为具有功能的成熟DC。     

抑制吲哚胺2，3-双加氧酶活性促进慢性粒细胞白血病源树突状细胞的功能

目的: 研究吲哚胺2,3双加氧酶（indoleamine 2,3dioxygenase,IDO）在慢性粒细胞性白血病源性树突状细胞（dendritic cells derived from chronic myeloid leukemia,CMLDCs）中的表达,及抑制IDO活性对CMLDCs免疫刺激功能的影响。方法: RTPCR检测17例患者CMLDCs的IDO mRNA的表达情况,流式细胞仪检测CMLDCs免疫表型。在有或无IDO抑制剂1甲基色氨酸（1methyltroptophan,1MT）作用下,分别以不成熟CMLDCs（imDCs）和成熟CMLDCs（mDCs）为刺激细胞,完全缓解期（complete remission,CR）CML患者外周T淋巴细胞为反应细胞建立混合淋巴细胞反应体系,ELISA法检测CMLDCs上清液IL12水平,MTT法检测CMLDCs刺激自体T淋巴细胞的增殖能力。结果: 随着CMLDCs的诱导分化和成熟,IDO mRNA表达逐渐上调;经TNFα诱导的DCs免疫表型除CD1a外,CD80、CD86、CD83、HLADR的表达均明显上调(P<005),且上述分子的表达不受1MT的影响。用1MT抑制IDO活性后的imDCs和mDCs,其IL12水平均明显增加(P<005,P<001),且激发自体T淋巴细胞增殖的能力也明显增强(P<0.05,P<0.01)。结论: 抑制IDO活性可提高CMLDCs的IL12分泌水平,增强其对自体T细胞增殖的刺激能力,IDO对DCs的负性调节为白血病生物治疗提供了新的思路。     

人外周血单核细胞来源的DC体外分化成熟影响因素的研究

目的： 探讨不同因素对人外周血单核细胞来源的树突状细胞(DC)体外分化成熟的影响。方法：通过流式细胞仪表型分析、混合淋巴细胞反应、抗原摄取能力检测、DC对T细胞的趋化能力及对IL10的拮抗效应的测定，研究了TNFα，FL，sCD40L，CD40mAb，gp130，IL10等不同因素对DC的体外分化成熟及功能的影响。结果：CD40信号和TNFα都可以有效地使DC上调表达共刺激分子CD80，CD86并进而促进DC激发T细胞的增殖和活化及对T淋巴细胞的趋化作用，但在体外培养体系中，sCD40L能有效地拮抗IL10的抑制效应，而TNFα则明显不如sCD40L有效；激发型gp130单克隆抗体和人重组FL可以显著地促进DC的体外扩增，但是无明显地促进DC分化成熟和促进DC激发T细胞的功能。结论：CD40和TNFα都具有促进DC分化、成熟的能力，但CD40的作用明显优于TNFα。     

IL-27通过上调MIG和IP-10的表达抑制肿瘤血管形成

目的:研究IL27对肿瘤血管生成的抑制作用及其机制。方法： IL27基因稳定转染的人食管癌细胞（Eca109/IL27）接种于裸鼠,建立荷瘤裸鼠模型,观察肿瘤生长情况和裸鼠生存期。用ELISA法检测脾细胞IFNγ的分泌水平;免疫组化法检测瘤组织中VEGF和CD34的表达,并通过CD34的水平计算微血管密度;用RTPCR法检测肿瘤组织趋化因子IP10、MIG mRNA的表达水平。结果：接种Eca109/IL27细胞荷瘤小鼠的生存期较接种野生型Eca109细胞（未转染质粒）和Eca109/LXSN细胞（空载体质粒转染）小鼠的生存期明显延长（P<0.05）。接种Eca109/IL27细胞的裸鼠瘤组织中VEGF和CD34的表达水平显著性低于接种Eca109细胞和Eca109/LXSN细胞,微血管密度显著降低（均P<0.01）。Eca109/IL27组小鼠脾细胞产生较高水平的IFNγ（P<0.05）,趋化因子IP10和MIG mRNA的表达水平也显著性高于接种Eca109细胞组和Eca109/LXSN细胞组（P<0.05）。结论： IL27在裸鼠体内通过上调IP10和MIG表达抑制肿瘤血管生成,从而发挥抗肿瘤作用。     

紫杉醇联合顺铂诱导的凋亡卵巢癌细胞的免疫原性

目的: 探讨紫杉醇联合顺铂诱导凋亡的卵巢癌细胞被DCs交叉提呈后能否促进免疫应答。方法：常规贴壁法刺激正常人外周血单核细胞分化诱导为DCs,6 d后将DCs和紫杉醇联合顺铂体外诱导的凋亡人卵巢癌细胞HO8910共同培养（凋亡组）,并以冻融细胞共培养DCs组(冻融组)或单独DCs组(空白组)作对照,以激光共聚焦扫描和流式细胞仪检测不同培养组DCs的分化和成熟程度。分别将各组成熟DCs与同一来源的磁珠分选的CD8+T细胞共培养, 3HTdR掺入法检测其增殖能力;LDH释放反应检测CTL对肿瘤细胞的杀伤能力;同时应用ELISPOT图像分析仪检测致敏后CD8+T细胞INFγ的分泌能力。结果：(1)紫杉醇联合顺铂诱导的凋亡卵巢癌细胞可被DCs有效吞噬,并促进DCs的成熟及其抗原提呈作用;(2) 3HTdR检测显示凋亡肿瘤细胞能诱导CD8+T细胞增殖（P<0.05）;(3)LDH释放实验与ELISPOT图像分析均证明凋亡肿瘤细胞诱导的CTL杀伤活性显著强于冻融组和空白组细胞（P<0.01）。结论：紫杉醇联合顺铂诱导的凋亡卵巢癌细胞具有较强的免疫原性,可促进DCs分化和成熟,进一步促进CD8+T细胞增殖、分泌与杀伤功能。     

造血干细胞移植后淋巴细胞增殖症患者单个核细胞来源DC负载EBV抗原肽制备DC-CIK

目的：以造血干细胞移植后并发淋巴细胞增殖症（posttransplant lympholiferative disorder, PTLD)患者外周血单核细胞培养诱导DC,负载抗原肽后制备DCCIK（cytokineinduced killer cell）,为探索新的PTLD治疗方法奠定基础。方法: 分离造血干细胞移植后EBV（EpsteinBarr virus)感染致PLTD患者外周血单个核细胞,贴壁细胞培养诱导DC,悬浮细胞诱导CIK;负载EBV抗原肽LMP2后建立DCCIK共培养体系。流式细胞仪分析共培养前后细胞的免疫表型,ELISA检测共培养前后细胞上清IFNγ的分泌水平,基因扫描仪分析T细胞受体(T cell receptor, TCR)β家族基因谱。结果: 成功制备负载EBV抗原肽的DCCIK,HLADR+CD86+DC细胞从诱导前的12.5%增加到91.17%;DCCIK共培养14 d后,两例患者的CIK数量分别增加了5.3和6.8倍;CD3+、CD8+、CD3+CD8+以及CD3+CD56+ 细胞比例在DCCIK共培养后均明显升高(均P<005)。抗原肽负载的DCCIK共培养体系中IFNγ的分泌水平明显高于未经抗原肽负载的DC组\[（1 332.6±92.38）pg/ml vs (693.42±62.41) pg/ml,P<0.01）\]。DCCIK培养后细胞的TCRβ家族基因在5.2家族出现单克隆表达峰。结论：EBV抗原肽负载后DC可诱导DCCIK共培养体系中CD3+CD8+以及CD3+CD56+ 细胞扩增,并分泌高水平IFNγ,为临床应用DCCIK对移植后EBV感染致PTLD患者进行过继性细胞免疫治疗提供实验基础。     

NY-ESO-1致敏树突状细胞诱导的CTL对肝癌细胞株的特异性杀伤作用

目的：探讨肿瘤睾丸抗原NYESO1（New Yorkesophageal1）致敏树突状细胞体外诱导特异性CTL对肝癌细胞株的杀伤作用。方法：重组质粒pGEXESO1经原核诱导表达并纯化GSTESO1融合蛋白肽。重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（rhGMCSF）和白细胞介素4（rhIL4）诱导培养人外周血来源的树突状细胞（dendritic cells, DCs）,经GSTESO1融合蛋白肽致敏后诱导特异性CTL增殖。以此CTL为效应细胞,分别以NYESO1阳性表达的肝癌细胞株HepG2和不表达NYESO1的肝癌细胞株H2P为靶细胞,MTT法检测CTL对肝癌细胞株的杀伤作用。结果：重组质粒pGEXESO1经IPTG诱导,在大肠杆菌中表达相对分子质量约36 000的GSTESO1融合蛋白肽,纯化后的质量浓度为50 μg/ml;经rhGMCSF和rhIL4联合诱导成功培养人外周血DCs,其表型分子HLADR为91.4%、CD86为70.5%、CD83为71.2%、CD80为55.3%。NYESO1致敏的DCs能明显诱导CTL增殖,此CTL对肝癌细胞株HepG2的杀伤率显著高于GST刺激组、未致敏DC组和无DC刺激组(均P<0.05),效靶比为50∶1时杀伤效应达到最高峰\[(53.23±3.78)%,P<0.01\];相同条件下CTL对H2P细胞无特异性杀伤作用。结论： NYESO1抗原致敏的DCs在体外可诱导同种CTL产生和增殖,后者对NYESO1阳性肝癌细胞株具有特异性杀伤效应,该方法为肝癌免疫治疗提供了一条新思路。