肠道病毒71型（EV71）ICR乳鼠动物模型的建立

目的建立ICR乳鼠动物模型,为抗EV71药物的筛选和活性评价提供一定的信息支撑。方法采用EV71国际标准株BrCr株,分别对1日龄、7日龄及21日龄ICR乳鼠经腹腔注射感染,并定期采集感染小鼠器官组织进行病原学诊断,确定EV71的感染情况。结果经腹腔途径感染1日龄和7日龄ICR小鼠出现精神萎靡、肢体麻痹瘫痪、消瘦、死亡等症状。腹腔注射分别在1日龄乳鼠肺、脑、肠及7日龄乳鼠肺、脑、肠、大腿肌肉检测到病毒RNA,而21日龄乳鼠出现轻微症状后自行恢复。本研究同时建立了一种分子生物学方法,为今后研究其他适合EV71的动物模型奠定了基础。结论成功建立EV71感染动物模型。发现不同日龄ICR乳鼠对EV71国际标准株感染的易感能力和感染后发病程度不同,低龄（1日龄和7日龄）乳鼠易感,而高龄（21日龄）乳鼠不易感染。ICR乳鼠可用于EV71病毒感染机制、病毒体内分布等基础研究,并可作为抗EV71病毒药物筛选和活性评价动物模型应用,但模型的稳定程度尚需继续研究。     

磁性颗粒标记单抗对肠道病毒EV71感染的体外MRI检测

目的探讨MRI通过磁性颗粒标记抗体可视化EV71病毒感染细胞分布的可行性。方法提取临床EV71分离株制备单克隆抗体,Fe磁性颗粒标记纯化的单克隆抗体11R12-IgG,磁化标记的单抗11R12-IgG运用与protein-A/G-beads共孵育及SDS-PAGE分析测量抗体吸附效率。然后用ELISA测试11R12-IgG-beads与纯化的VP1抗原的结合能力。最后MRI信号分析磁性颗粒标记的抗体在细胞水平上检测病毒感染分布的能力。结果抗体在磁珠的首次吸附效率约为75.5%,经过第二次洗涤后只有少量抗体洗脱;并SDS-PAGE分析显示首次吸附在磁珠上的抗体浓度仅略低于原始浓度,都证实抗体以较高的效率成功吸附到磁珠上。ELISA结果表明磁珠结合抗体后,抗体识别抗原的能力不受影响。MRI结果显示磁颗粒11R12-IgG组能检测到显著的MRI信号,而仅磁珠组或者仅IgG组则不能检测到相应的MRI信号。结论磁颗粒-IgG能在细胞水平特异,在体外水平有效地检测EV71病毒的感染,为确定病理损伤和病毒的共定位奠定了重要基础。     

手足口病病原体EV71的检测方法学比较

 目的 比较4种不同的方法对手足口病(hand-foot and mouth disease,HFMD)病原体肠病毒71型(enterovirus type 71,EV71)感染的检测效果。方法 非洲绿猴肾细胞(Vero)培养至对数生长期后,加入EV71病毒株感染。分别采用细胞病变效应法(cytopathic effect,CPE)、实时荧光定量聚合酶链式反应(real time polymerase chain reaction,Real-Time PCR)、Western blot和免疫荧光法检测病毒感染情况,并对4种检测结果进行比较。结果 4种方法均可检测到EV71的感染,其中CPE最经济实惠,但是检测周期长,需要至少96 h,并且对病毒活力要求高;Western blot和免疫荧光检测相近,72 h即可完成实验,但灵敏度低,对病毒量有一定要求;Real-Time PCR检测既快速灵敏性又高,48 h即可完成实验。结论 不同的方法各有其优缺点,需要根据不同的需要进行选择,达到快速准确诊断病原体的目的。     

肠道病毒71型感染手足口病合并脑炎的MRI表现及特征

目的探讨肠道病毒71型感染手足口病合并脑炎的MR表现及特征,为临床诊断及及时治疗提供帮助。方法回顾性分析2009年4月～2011年7月临床诊断为手足口病合并脑炎并行颅脑MR扫描的64例患儿的图像资料,所有病例均经病原学检查证实为肠道病毒71型感染。结果脑干病变共计32例,其中桥脑6例(主要位于桥脑背侧),延髓8例(6例表现为延髓背侧对称性小片状信号,2例为偏中心病灶),桥脑-延髓交界区8例,中脑10例(多位于双侧大脑脚,呈片状);小脑齿状核4例(双侧);丘脑4例(均为单侧丘脑,斑点状或小片状);右侧内囊后肢1例(呈条形);基底节区9例(多为斑点状信号);放射冠区、半卵圆中心及双侧额、顶叶皮质下区者共38例(病变多为多发斑点状信号);其中病灶位于单个部位者35例(35/64,54.69%),位于多个部位者29例(29/64,45.31%)。结论手足口病合并脑炎发病部位广泛,不只局限于脑干,基底节、内囊后肢、丘脑、小脑齿状核及双侧大脑白质区均可累及。总结其易发病部位,依次为脑干、脑白质、基底节、丘脑、小脑齿状核,MR颅脑扫描能真实、准确显示手足口病合并脑炎脑部受损情况,可为临床诊断及时治疗提供可靠的影像学依据。     

EV71感染小儿手足口病合并脑炎的3.0T MR表现特征

目的:探讨EV71感染小儿手足口病合并脑炎的3.0T MRI表现特征,提高诊断水平.方法:回顾性分析8例EV71感染小儿手足口病合并脑炎的3.0T MRI表现.结果:5例病灶局限住脑桥和延髓交界部,1例病灶以脑桥和延髓交界为卡向两侧延伸,1例病灶位丁脑桥偏背侧.1例位十中脑.8例病变均旱略长T1、长T2斑片状信号,边界欠清,DWI呈高信号.结论:EV71感染小儿手足门病介并脑炎3.0T MRI表现主要为位于脑桥和延髓交界区斑片状信号,3.0T MRI能真实地显示其脑炎脑部受损情况,对临床治疗提供可靠的影像学依据.     

肠道病毒71型血清学检测方法的建立及应用

目的 在原核表达系统中对肠道病毒71型(EV71)基因进行克隆、表达、纯化,建立血清IgM抗体的检测方法,用于EV71感染的早期诊断.方法 检索EV71 VP1基因序列,设计合成引物,并在引物两端插入酶切位点,采用RT-PCR分离EV71 VP1全基因序列.PCR产物回收、纯化,插入T载体进行序列同源性测定.再插入表达质粒载体pRSET,构建pRSFT-EV71重组质粒.利用纯化后的表达产物,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测EV71 IgM抗体.共收集31例临床诊断为手足口病患儿及36例健康儿童的血清标本进行检测.结果 PCR产物片段大小约890bp,与预期VP1全基因序列长度一致,并且克隆入T载体后序列测定与GenBank公布序列的同源性达100%;重组蛋白大小约为890bp,与预期蛋白片段一致.ELISA检测结果显示,在手足口病患儿中IgM抗体阳性7例,健康儿童中则未发现阳性,差异有统计学意义.结论 成功建立了针对EV71 IgM抗体的检测方法.     

黄病毒抗I型干扰素作用机制的研究进展

Ⅰ型干扰素(IFN)是病毒感染过程中刺激机体产生的一种抗病毒蛋白,是机体防御病毒感染的重要物质。近年来人们逐渐认识到病毒在感染过程中会对宿主细胞的Ⅰ型IFN系统产生抑制作用,从而拮抗Ⅰ型IFN系统的抗病毒能力,并且病毒自身的毒力在很大程度上取决于其对Ⅰ型IFN系统的拮抗特     

PI3K/AKT信号通路对骨骼肌再生的影响研究进展

磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信号通路作为细胞重要的转导通路,能够促进细胞增殖分化,促进蛋白合成。研究表明,PI3K/AKT信号通路通过活化PI3K,使AKT磷酸化,作用于下游相关因子,提高基因转录水平,可以促进肌卫星细胞增殖分化,抑制其凋亡,从而对骨骼肌再生修复有一定影响作用。     

JAK/STAT3信号通路与骨关节炎研究进展

体内研究发现,Janus激酶/信号转导与转录激活子3(JAK/STAT3)信号通路激活,可参与细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂P21(P21)缺乏和细胞分裂周期蛋白42(Cdc42)等因子对软骨的损害过程;增加I型胶原蛋白α1和间充质干细胞(MSC)数量从而造成软骨下骨硬化;参与P21缺陷引起的滑膜组织炎症。体外研究发现,JAK/STAT3信号通路激活,可通过增加基质金属蛋白酶、I型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶降解细胞外基质促进软骨细胞损伤;分别参与延伸蛋白2(ELP2)、核因子κB受体活化因子配体(RANKL)、表皮生长因子样结构域7(EGFL7)调控成骨细胞、破骨细胞分化以及血管形成过程;促进成纤维细胞样滑膜细胞产生S100A8/A9,调节骨关节炎(OA)滑膜细胞周期来促进滑膜炎和OA滑膜细胞的增殖。而在体内体外实验中应用JAK/STAT3信号通路抑制剂可缓解上述过程,发挥抗OA的作用。JAK/STAT3信号通路在软骨破坏、软骨下骨变化和滑膜炎等OA病理变化过程中发挥重要作用,对JAK/STAT3信号通路进行靶向调控可作为治疗OA的潜在研究方向及新靶点。     

A型肉毒毒素通过抑制SMAD3信号通路抑制兔耳瘢痕形成

目的 探讨A型肉毒毒素通过抑制SMAD3信号通路对增生性瘢痕形成的影响。方法 选取12只清洁级新西兰大白兔,将其随机分为对照组与观察组,每组各6只,制作瘢痕模型。建模成功后,观察组于创面9点每点注射2 U浓度为40 U/ml的A型肉毒毒素;对照组于造模后即刻于创面9点每点注射0.05 ml生理盐水。于术后30 d将动物处死取材。HE、Masson染色检测观察组织形态;实时荧光定量PCR检测Ⅰ型胶原(ColⅠ)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达;蛋白质免疫印迹实验检测ColⅠ、α-SMA、SMAD3和SMAD3磷酸化的表达情况;免疫组织化学染色检测SMAD3磷酸化表达水平。结果 HE和Masson染色结果显示,经A型肉毒毒素治疗后,组织纤维化程度明显减轻,胶原沉积减少。实时荧光定量PCR检测结果发现,观察组的COLⅠ和α-SMA的mRNA均低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。蛋白质免疫印迹实验结果发现,A型肉毒毒素能够显著抑制组织中COLⅠ、α-SMA蛋白的表达及SMAD3的磷酸化水平,但是不影响总的SMAD3表达情况。免疫组织化学染色结果显示,A型肉毒毒素能够明显...     

miR-19a-3p靶向调控CCND1基因介导FrA-1/IL-6/Stat3信号通路对乳腺癌侵袭转移的作用机制

 目的 探究miR-19a-3p靶向CCND1基因介导FrA-1/IL-6/Stat3通路对乳腺癌侵袭转移的作用机制。方法 癌细胞分组转染(空白组、阴性对照组、miR-19a-3p mimic组、siRNA-CCND1组、miR-19a-3p mimic + siRNA-CCND1组)。分别应用qRT-PCR、Western blot、MTT、划痕实验和Transwell侵袭实验检测相关基因mRNA和蛋白表达及细胞生物学行为变化趋势。结果 人乳腺癌组织和细胞中CCND1和Fra-1的表达明显上升,而miR-19a-3p明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。与空白组和阴性对照组相比,另外3组的miR-19a-3p、CCND1、FrA-1表达水平均上调(P<0.05),miR-19a-3p mimic+siRNA-CCND1组中上调更为明显(P<0.05)。各组细胞在24 h时无明显差异。48 h和96 h各组细胞增殖能力均提高。空白组与阴性对照组细胞增殖能力相比无明显差异。另外3组的细胞增殖能力均明显增强,差异有统计学意义(P<0.05),但miR-19a-3p mimic+siRNA-CCND1组中细胞增殖变化趋势较弱,差异有统计学意义(P<0.05)。与空白组和阴性对照组相比,另外3组细胞迁移、侵袭能力均减弱,差异有统计学意义(P<0.05),且miR-19a-3p mimic+siRNA-CCND1组迁移、侵袭能力最弱,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 miR-19a-3p在乳腺癌中呈下降趋势,上调miR-19a-3p可有效抑制CCND1基因表达和FrA-1/IL-6/Stat3通路激活,从而降低乳腺癌细胞侵袭转移。     

PI3K/Akt信号通路与肝星状细胞活化的关系及其在放射性肝纤维化中的作用

目的 探讨磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路与肝星状细胞(HSC)活化的关系及其在放射性肝纤维化中的作用。方法 6 MV X射线照射,联合PI3K/Akt信号通路特异性抑制剂处理HSC,分为空白对照组、抑制剂组、10 Gy照射组、10 Gy+抑制剂组、20 Gy照射组和20 Gy+抑制剂组。检测各组的细胞凋亡率、细胞上清液转化生长因子β1(TGF-β1)浓度、平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的mRNA表达量和磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)的表达量。结果 与空白对照组相比,10 和20 Gy照射组细胞的凋亡率随照射剂量的增加而增加(t=8.43、11.63,P<0.05);与10 和20 Gy照射组比较,分别加抑制剂后细胞的凋亡率降低(t=8.09、4.88,P<0.05)。与10 Gy照射组比较,20 Gy照射组TGF-β1、α-SMA、p-Akt的量增加(t=6.91、7.80、9.28,P<0.05),10 Gy+抑制剂组TGF-β1、α-SMA、p-Akt的量降低(t=6.17、15.11、10.34,P<0.05)。与20 Gy照射组比较,20 Gy+抑制剂组TGF-β1、α-SMA、p-Akt的量同样降低(t=10.04、6.85、23.84,P<0.05)。结论 X射线通过激活PI3K/Akt信号通路使HSC活化,导致放射性肝纤维化的发生。     

急性脊髓损伤后炎症反应、自噬和凋亡相关因子的变化以及JAK2/STAT3信号通路研究

目的 观察大鼠急性脊髓损伤(Acute Spinal Cord Injury,ASCI)后神经细胞炎症反应、自噬和凋亡相关因子的变化,探讨靶向干预JAK2/STAT3信号通路活化的治疗作用.方法 选择健康成年8～10周龄SD雄性大鼠共45只,随机分为假手术组、模型组和JAK2抑制剂AG-490干预组各15只,采用改良A...     

Hippo信号通路的调控机制及其在肿瘤细胞辐射效应中作用的研究进展

Hippo信号通路是以激酶级联反应为核心的进化保守的信号通路,在调控哺乳动物的器官大小、组织稳态、组织再生、伤口愈合和肿瘤发生中起着关键作用。Hippo信号通路受到细胞密度变化、外部机械压力和（或）其他内在和外在信号的刺激,使核心复合物控制转录共激活因子Yes相关蛋白（YAP）和转录共激活因子 PDZ 结合基序蛋白移位到细胞核内,从而调控各种生物学效应。另外,YAP作为Hippo信号通路的主要效应分子,在许多肿瘤中异常表达,与肿瘤的发生和发展密切相关,包括肿瘤细胞增殖及凋亡、肿瘤转移和耐药等。Hippo信号通路对肿瘤细胞辐射效应的影响主要体现在YAP对肿瘤细胞辐射敏感性和辐射抗性的影响上。笔者就调控Hippo信号通路的分子类型、Hippo信号通路对肿瘤的调控作用及其对肿瘤细胞辐射效应的影响进行了综述,旨在为肿瘤治疗及放射增敏剂的研发提供新的思路。     

阻断PI3K信号通路显著抑制成骨前体细胞MC3T3-E1的分化

目的：研究PI3K信号通路对成骨前体细胞MC3T3-E1分化的调控作用。方法：首先通过Western印迹试验检测到PI3K信号通路参与成骨细胞分化的调控。应用PI3K激酶的特异性抑制剂LY294002药物阻断PI3K信号通路的活化，通过碱性磷酸酶(ALP)和von Kossa染色观察成骨前体细胞MC3T3-E1分化的改变。结果：Western印迹试验显示，成骨细胞分化过程中PI3K信号通路明显活化。阻断该信号通路的活化显著抑制成骨细胞碱性磷酸酶的活性，同时降低成骨细胞体外形成骨结节结构的能力。结论：PI3K信号通路参与了成骨细胞分化的调控，而这种调控作用是成骨细胞分化所必需的。     

AR信号通路与自噬的相关性在前列腺癌治疗中的应用

雄激素受体（androgen receptor,AR）信号传导途径在前列腺癌的发生和进展中起重要作用,基于此,临床上多采取抑制AR信号通路的手段治疗前列腺癌。然而,几乎所有患者经过一段时间的治疗后均逃不过转变为去势抵抗性前列腺癌的结局。目前普遍认为是由于AR信号通路的再激活导致了去势抵抗的发生,部分学者近年来发现自噬在前列腺癌的发生、发展中同样扮演着重要角色,自噬的变化与去势抵抗性前列腺癌的发生呈明显的相关性。作者通过总结近年来有关去势抵抗性前列腺癌的发生机制及研究热点,从AR信号通路和自噬的角度综述二者在前列腺癌的发生、发展及治疗等方面的作用和关联性。     

Wnt信号通路在创伤微环境诱导的表皮细胞去分化过程中的作用

目的 研究创伤微环境对表皮细胞的去分化诱导作用,并探讨Wnt通路在这一过程中的作用. 方法 包皮皮片去除皮下脂肪后,中性蛋白酶消化过夜,分离表皮和真皮.分离的表皮片用Ⅳ型胶原反复粘贴并冲洗去除表皮干细胞.处理后的表皮片经免疫组化鉴定后移植到BALB/c裸鼠背部全层皮肤缺损创面,5 d后用免疫组化法检测皮片内细胞的表型特征,RT-PCR和Western blot检测表皮细胞表型转化过程中Wnts分子及下游分子的表达变化. 结果 未经处理的表皮片基底部细胞呈CK10染色阴性,CK19和β1整合素染色阳性;Ⅳ型胶原处理后的表皮片内细胞全呈CK10染色阳性.而去基底皮片移植后5 d,在皮片的基底侧重新出现CK10染色阴性、CK19和β1整合素染色阳性的细胞.同时在移植皮片内Wnt-10b、Wnt-4和Wnt-7a mRNA的表达分别增加了3.1倍、2.2倍和1.4倍,而Wnt通路下游β-catenin、cyclin D1和c-myc蛋白表达分别增加了3倍、1.5倍和2倍(P<0.01). 结论 创伤微环境可诱导表皮细胞去分化,Wnt/β-catenin信号通路可能在这一过程中起关键性的调控作用.     

直线加速器X线照射对人肺成纤维细胞经典Wnt通路中关键信号蛋白的影响

 目的 探讨直线加速器X线照射对人肺成纤维细胞经典Wnt通路中关键信号蛋白的影响。方法 人肺成纤维细胞分为照射组和正常对照组,照射组经直线加速器X线5 Gy照射24 h后,Western blot检测两组成纤维细胞胞核内β-catenin蛋白表达,Real time PCR检测成纤维细胞胞核内β-catenin mRNA表达,ELISA法检测细胞培养液中WISP-1蛋白表达。结果 照射组人肺成纤维细胞β-catenin蛋白表达和mRNA表达水平均高于对照组,WISP-1蛋白表达水平也显著升高,与对照组比较均有统计学意义[(637±88)vs(387±58),P<0.05]。结论 直线加速器X线照射可诱导人肺成纤维细胞经典Wnt通路活化,促进肺纤维化的形成,可能为放射性肺损伤的治疗提供新的靶点。     

沉默GRAMD1A及抑制STAT5信号通路对肝癌细胞Huh7放射敏感性的影响

目的 探讨沉默GRAMD1A及抑制STAT5信号对肝癌细胞Huh7放射敏感性的影响,旨在为肝癌临床联合治疗提供新思路。方法 慢病素感染构建沉默GRAMD1A的Huh7细胞株,采用qPCR和Western blot进行验证,qPCR和荧光素酶报告实验检测沉默GRAMD1A后对Huh7细胞中STAT5及其下游基因表达的影响;以克隆形成率和细胞凋亡为指标检测沉默GRA株。结果 构建后的Huh7细胞经2 Gy照射后,沉默GRAMD1A联合照射组细胞克隆形成能力较阴性对照联合照射组显著降低,差异有统计学意义（t=8.494,P<0.05）;沉默GRAMD1A联合照射组细胞凋亡较阴性对照联合照射组显著增加,差异有统计学意义（t=3.560,P<0.05）。沉默GRAMD1A后Huh7细胞放射敏感性明显增加,且细胞中STAT5及其下游基因表达显著降低。SH-4-54抑制剂联合照射组较二甲基亚砜联合照射组细胞克隆存活能力显著降低,差异有统计学意义（t=8.660,P<0.05）,SH-4-54抑制STAT5通路后,Huh7细胞放射敏感性显著增加。结论 沉默GRAMD1A可能通过STAT5信号通路增强肝癌细胞Huh7的放射敏感性,表明GRAMD1A在肝癌发生发展中起重要作用,将可能为肝癌靶向治疗及联合治疗提供新靶点。