常用脊髓损伤模型与骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤

脊髓损伤的病理生理机制非常复杂,建立适宜的脊髓损伤模型,对模型进行骨髓间充质干细胞移植治疗,并分析其治疗脊髓损伤的机制,是进行临床脊髓损伤治疗的前提。目前常用的脊髓损伤模型包括挫伤型模型、牵张损伤模型、压迫损伤模型、切割或吸除型模型、缺血损伤模型等。常用的骨髓间充质干细胞移植方法有细胞悬液立体定位注射法、腰穿细胞悬液注射法、静脉内细胞悬液输入法等。骨髓间充质干细胞治疗脊髓损伤的机制可能有以下几方面：①骨髓间充质干细胞能向损伤处迁移,并向神经细胞表型分化。②发挥桥梁介导作用。③骨髓间充质干细胞移植后能够抑制神经细胞的凋亡。大量动物实验结果证明,骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤的临床应用前景是广阔的。     

骨髓间充质干细胞立体定向移植治疗大鼠脊髓损伤*

摘要 背景：传统观念认为,神经组织损伤后几乎不能再生,以往对SCI的治疗缺乏有效手段,致使本病致残率高,疗效差。干细胞治疗关键在于移植具有再生能力的干细胞,通过多种作用机制,可以重建中枢神经系统的结构和功能,近年来引起了广泛的关注。 目的：探讨立体定向移植骨髓间充质干细胞（MSCs）对大鼠脊髓损伤修复的影响并探讨其机制 设计、时间及地点：随机对照动物实验,于2007-10/2008-6在天津市环湖医院完成。 材料：1月龄SD大鼠20只,用于制备骨髓间充质干细胞;健康成年Wistar大鼠45只,雌性、同系,体质量280±20 g。将动物随机分为对照组、假手术组与移植组,每组各15只。 方法：密度梯度离心法结合贴壁筛选法分离骨髓间充质干细胞,经流式细胞仪鉴定为MSCs。以动脉瘤夹夹闭法制备大鼠脊髓损伤（SCI）模型,在SCI大鼠致伤后第7天,通过立体定向途径移植MSCs到移植组大鼠脊髓损伤中心,移植等量生理盐水至假手术组大鼠脊髓损伤中心,对照组大鼠不做处理。 主要观察指标：SCI大鼠损伤前及损伤后第7天、14天、30天、60天、90天的BBB评分;损伤后第90天处死大鼠,观察其脊髓组织中有无BrdU阳性细胞、Brdu+NSE、Brdu+GFAP、Brdu+bFGF、Brdu+BDNF免疫组化双染阳性细胞并观察NSE、GFAP、bFGF、BDNF单染阳性细胞。 结果： ①BBB评分发现,MSCs移植组大鼠BBB后肢功能评分恢复优于对照组（p<0.05）;假手术组BBB评分在损伤后30天内恢复速度慢于对照组（p<0.05）,至第90天与对照组比较无显著差异（P>0.05）;②免疫组织化学染色发现,移植组大鼠脊髓内在损伤中心及头、尾端距离脊髓损伤中心1cm处均可见BrdU染色阳性细胞及Brdu+NSE、Brdu+GFAP、Brdu+bFGF、Brdu+BDNF免疫组化双染阳性细胞。移植组NSE、GFAP、bFGF、BDNF单染阳性细胞数明显高于对照组和假手术组（p<0.05）。 结论： MSCs移植可以促进SCI大鼠的神经功能的恢复,其机制可能与移植细胞分化为神经元样和神经胶质细胞样细胞,并分泌或促进宿主分泌神经营养因子有关。 关键词 脊髓损伤 骨髓间充质干细胞 立体定向 细胞移植     

大鼠骨髓间充质干细胞静脉移植对脊髓损伤的修复作用

目的初步探讨骨髓间充质干细胞（BMSCs）静脉移植对脊髓损伤后神经功能恢复和神经修复的影响。方法体外培养BMSCs，改良Allen法制备大鼠脊髓损伤模型，经尾静脉移植Brdu标记的BMSCs，损伤后24h、移植后1、3、5周评价实验动物的神经功能状况，并检测BMSCs在体内迁移、存活以及分化情况，电子显微镜观察组织形态学变化。结果移植的BMSCs在宿主损伤脊髓中聚集并存活，3～5周后有部分移植细胞表达神经元特异性烯醇化酶（NSE）、神经丝蛋白（NF）、微管相关蛋白（MAP2）；BMSCs静脉移植组大鼠运动功能改善，BBB评分高于对照组（P〈0．05）；5周后组织学观察，与对照组相比移植组损伤区脊髓结构较完整。结论BMSCs经静脉移植后可向脊髓损伤处聚集并存活分化，促进神经修复及神经功能的恢复。     

骨髓间充质干细胞移植联合吡拉西坦修复大鼠脊髓损伤

背景：单纯的干细胞移植对脊髓损伤的修复作用并不理想,主要是因为脊髓损伤后损伤区域神经组织的水肿、缺血、缺氧等引起继发性损伤造成的。 目的：在骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤的同时应用吡拉西坦,观察两者对大鼠脊髓损伤恢复的影响。 方法：雌性Wistar大鼠参照改良Allen打击法制备大鼠脊髓损伤模型。随机分成3组,即单纯损伤组、骨髓间充质干细胞移植组及骨髓间充质干细胞移植联合吡拉西坦组。于伤后1,2,4,6,8周进行BBB评分和斜板实验等运动功能检测。第4周取材行病理切片苏木精-伊红染色,通过SRY-PCR检测雄性大鼠Y染色体上特有的基因SRY,从而得知移植骨髓间充质干细胞是否存活。8周后取材,行辣根过氧化物酶示踪观察,并通过透射电镜观察轴突的再生情况。 结果与结论：伤后4周,骨髓间充质干细胞移植组、联合治疗组大鼠后肢运动功能均有较明显恢复,联合治疗组较骨髓间充质干细胞移植组恢复快(P < 0.05)。单纯损伤组亦有所恢复,但程度较轻。病理切片单纯损伤组未见神经轴索通过;骨髓间充质干细胞移植组可见少量神经轴索样结构;联合治疗组可见较多神经轴索样结构。骨髓间充质干细胞移植组、联合治疗组有SRY基因表达,单纯损伤组未检测到SRY基因。辣根过氧化物酶阳性神经纤维数联合治疗组﹥骨髓间充质干细胞移植组>单纯损伤组,差异具有显著性意义(P < 0.05)。透射电镜下,骨髓间充质干细胞移植组、联合治疗组正中横断面可见新生的无髓及有髓神经纤维。提示骨髓间充质干细胞移植联合吡拉西坦促进大鼠损伤脊髓结构和功能恢复的效果明显优于单纯细胞移植组,两者联用具有协同效应。     

不同途径移植骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复效果研究

目的观察不同途径移植骨髓间充质干细胞(BMSCs)对脊髓损伤修复效果。方法选取20g Wis-ter大鼠采用贴壁法分离、培养、纯化BMSCs,选取180gWister大鼠制备脊髓损伤模型动物,分别采用损伤部位和腰骶鞘内两条途径移植细胞,通过BBB评分和细胞形态学方法,观察不同途径移植BMSCs治疗脊髓损伤的效果。结果腰骶鞘内细胞移植后第2、3周进行BBB评分各时间段均较损伤部位细胞移植组评分高。另外形态学观察显示BMSCs经腰骶鞘内移植后组织结构规则,形成明显的网状结构,且组织内空泡数量明显少于BMSCs经损伤部位移植组。结论经腰骶鞘内移植BMSCs的疗效好于经损伤部位细胞移植。     

大鼠骨髓间充质干细胞静脉移植治疗大鼠脑损伤

目的了解大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）经鼠尾静脉移植后在脑内的表达情况及对大鼠脑创伤后神经运动功能的影响。方法将溴脱氧尿苷（BrdU）标记培养的BMSCs分别在大鼠脑创伤后第1天（实验组1，n=6）、第3天（实验组2，n=10）、第7天（实验组3，，F7）经大鼠尾静脉注射移植，另取6只脑创伤大鼠（实验组4）在伤后第3天经尾静脉移植BrdU标记的全骨髓，尾静脉注射仅．MEM脑创伤大鼠作为对照组（n=6）。应用免疫组化染色，了解移植细胞在脑内的表达情况。脑创伤后第1、3、7、14天评价移植对大鼠神经运动功能的影响。结果脑创伤后14d时神经运动功能评分分别为实验组1：31．83±1．60，实验组2：31．10±1．79，实验组3：28，43±1．72，实验组4：28．67±1．37，对照组：26．00±1．00．各组间差异有显著性（P=0．000）。在移植各组的创伤侧脑组织，可见BrdU染色阳性细胞，并以脉络丛、脑室周围、血管周围分布较多。对实验组2进行免疫组化双染色，未发现BrdU＋神经元特异性烯醇化酶（NSE1、BrdU＋胶质纤维酸蛋白（GFAP）双染色细胞。结论大鼠BMSCs经鼠尾静脉移植．在一定时期内能改善大鼠脑创伤后神经运动功能；脑内可以发现移植细胞存活．但移植细胞是否转化为神经元仍然需要进一步的实验证实。     

骨髓间充质干细胞与运动性脊髓损伤

背景：骨髓间充质干细胞移植对于运动性脊髓损伤是一种有效的治疗手段。但目前有关脊髓损伤的研究尚不充分,且缺乏对其机制及其良好治疗方法的探讨。 目的：通过分析运动性脊髓损伤的病理特征、骨髓间充质干细胞的生理特性,及其运用于脊髓损伤的应用,为制定运动性脊髓损伤的康复治疗方案提供理论依据和科学支撑。 方法：应用计算机检索Pubmed数据库(1991/2010),以“Mesenchymal stem cell,sports Knee injuries”为检索词;应用计算机检索维普数据库(1991/2010),以“骨髓间充质干细胞、运动性脊髓损伤”为检索词。 结果与结论：共收集到85篇文献,排除发表时间较早、实验设计科学性较差的文献,共25篇文献符合标准被纳入。骨髓间充质干细胞能分化为神经元样细胞,反应性分泌各种营养因子及生长因子,以增强神经的保护作用和促进局部微血管再生,从而起到治疗脊髓损伤的作用。但运动性脊髓损伤后损伤部位的缺血、缺氧、运动性自由基的产生及兴奋性氨基酸等影响骨髓间充质干细胞分化及其结果的相关问题仍需要大量的实验研究予以一一证实。     

骨髓间充质干细胞不同移植途径治疗大鼠脊髓损伤的比较

背景：在适当的生长环境下，中枢神经系统内的一些受损的神经元轴突有少许再生，并能与靶细胞形成功能性的突触联系。 目的：比较局部注射和尾静脉注射途径移植骨髓间充质干细胞对大鼠脊髓损伤神经功能恢复的作用。 设计、时间及地点：细胞组织学对照观察，于2007-03/2008-04在承德医学院完成。 材料：健康成年雄性SD大鼠40只，由解放军军事医学科学院动物中心（北京）提供。 方法：取4只大鼠，采用密度梯度离心法和贴壁法体外分离培养骨髓间充质干细胞，传至第2代于临用前24 h行BrdU标记。余36只大鼠均建立T12脊髓损伤模型，1周后随机分为3组，局部注射组于损伤部位上下位点注射1×106个骨髓间充质干细胞至损伤大鼠体内；尾静脉注射组通过尾静脉移植等量骨髓间充质干细胞至损伤大鼠体内；模型对照组不行细胞移植。 主要观察指标：神经功能缺损BBB评分，苏木精-伊红染色病理学检测，细胞分化免疫组化染色结果。 结果：细胞移植后2，4，6周，模型对照组神经功能缺损BBB评分均显著低于局部注射组、尾静脉注射组（F=721.373，F=1 114.450，F=1 004.099，P均 < 0.01）；局部注射组神经功能缺损BBB评分均显著高于尾静脉注射组（t=55.261，t=71.385，t=78.135，P均 < 0.01）。苏木精-伊红染色结果显示，模型对照组损伤脊髓组织有较多空腔，横断处形成大量空泡；局部注射组无明显空腔，空泡小而少，间质水肿较轻。移植后4，6周，部分植入的骨髓间充质干细胞呈微管相关蛋白2及胶质纤维酸性蛋白双阳性表达。 结论：局部注射和尾静脉注射两种途径移植的骨髓间充质干细胞均可在脊髓损伤处存活、分化并改善神经功能，且局部注射的效果优于尾静脉注射。     

间充质干细胞移植修复脊髓损伤的研究现状

骨髓间充质干细胞在体外没有外界因素作用下连续传50代仍可保持原来的特性,亦可在一些条件的诱导下分化成神经细胞。实验研究表明,间充质干细胞移植能促进脊髓损伤的神经结构修复及神经功能恢复,其机制可能与替代作用、营养作用、诱导作用、桥接作用等有关。携带外源功能基因的骨髓间充质干细胞移植到体内存活、迁徙、分化并基因表达脑源性生长因子、神经生长因子等细胞因子,明显促进脊髓损伤的恢复,成为了新的研究热点。随着对间充质干细胞的生物学特性进一步深入研究,一些未解决的问题将会逐步得到解决,为脊髓损伤和其他神经系统疾病的患者带来新的希望。     

移植人脐带间充质干细胞修复大鼠脊髓损伤

背景：已知人脐带间充质干细胞对脊髓损伤存在着潜在的治疗价值,然而,当前对移植人脐带间充质干细胞治疗脊髓损伤及机制方面研究很少。 目的：观察人脐带间充质干细胞对脊髓损伤大鼠的治疗效果。 方法：40只Wistar大鼠建立脊髓损伤模型,38只造模成功后随机摸球法分为3组：空白对照组：只接受单纯损伤,不做任何移植;DMEM移植组：损伤后1周予以5 μL DMEM局部移植;细胞移植组：损伤后1周予以5 μL准备好的人脐带间充质干细胞局部移植(细胞数1×106)。移植后对实验动物通过BBB评分、体感诱发电位与运动诱发电位观察后肢功能恢复情况。分别于损伤后2,4,6,8,10周随机于细胞移植组抽取大鼠2只,免疫组织化学染色观察人脐带间充质干细胞存活、迁移、分化,通过胶质纤维酸性蛋白阳性细胞染色比较各组损伤局部胶质瘢痕形成面积。 结果与结论：BBB评分损伤后4周细胞移植组高于其他两组(P < 0.05),损伤后12周细胞移植组与其他两组相比SEP、MEP潜伏期缩短、波幅值增高(P < 0.05)。免疫组织化学染色示人脐带间充质干细胞可向神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞分化,分化的少突胶质细胞并包绕轴突形成髓鞘。细胞移植组损伤局部胶质瘢痕面积均小于其他两组(P < 0.05),空白对照组、DMEM移植组间差异无显著性(P > 0.05)。提示未经体外诱导的人脐带间充质干细胞可于损伤大鼠脊髓体内向神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞分化,减小胶质瘢痕,并促进脊髓损伤大鼠神经功能的恢复。     

Propofol promotes spinal cord injury repair by bone marrow mesenchymal stem cell transplantation

Propofol is a neuroprotective anesthetic. Whether propofol can promote spinal cord injury repair by bone marrow mesenchymal stem cells remains poorly understood. We used rats to investigate spinal cord injury repair using bone marrow mesenchymal stem cell transplantation combined with propofol administration via the tail vein. Rat spinal cord injury was clearly alleviated; a large number of newborn non-myelinated and myelinated nerve fibers appeared in the spinal cord, the numbers of CM-Dil-labeled bone marrow mesenchymal stem cells and fluorogold-labeled nerve fibers were increased and hindlimb motor function of spinal cord-injured rats was markedly improved. These improvements were more prominent in rats subjected to bone marrow mesenchymal cell transplantation combined with propofol administration than in rats receiving monotherapy. These results indicate that propofol can enhance the therapeutic effects of bone marrow mesenchymal stem cell transplantation on spinal cord injury in rats.     

visual bone marrow mesenchymal stem cell transplantation in the repair of spinal cord injury

An important factor in improving functional recovery from spinal cord injury using stem cells is maximizing the number of transplanted cells at the lesion site. Here, we established a contusion model of spinal cord injury by dropping a weight onto the spinal cord at T7–8. Superparamagnetic iron oxide-labeled bone marrow mesenchymal stem cells were transplanted into the injured spinal cord via the subarachnoid space. An outer magnetic field was used to successfully guide the labeled cells to the lesion site. Prussian blue staining showed that more bone marrow mesenchymal stem cells reached the lesion site in these rats than in those without magnetic guidance or superparamagnetic iron oxide labeling, and immunofluorescence revealed a greater number of complete axons at the lesion site. Moreover, the Basso, Beattie and Bresnahan(BBB) locomotor rating scale scores were the highest in rats with superparamagnetic labeling and magnetic guidance. Our data confirm that superparamagnetic iron oxide nanoparticles effectively label bone marrow mesenchymal stem cells and impart sufficient magnetism to respond to the external magnetic field guides. More importantly, superparamagnetic iron oxide-labeled bone marrow mesenchymal stem cells can be dynamically and non-invasively tracked in vivo using magnetic resonance imaging. Superparamagnetic iron oxide labeling of bone marrow mesenchymal stem cells coupled with magnetic guidance offers a promising avenue for the clinical treatment of spinal cord injury.     

Effect of intravenous transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells on neurotransmitters and synapsins in rats with spinal cord injury

Bone marrow mesenchymal stem cells were isolated, purified and cultured in vitro by Percoll density gradient centrifugation combined with the cell adherence method. Passages 3-5 bone marrow mesenchymal stem cells were transplanted into rats with traumatic spinal cord injury via the caudal vein. Basso-Beattie-Bresnahan scores indicate that neurological function of experimental rats was significantly improved over transplantation time (1-5 weeks). Expressions of choline acetyltransferase, glutamic acid decarboxylase and synapsins in the damaged spinal cord of rats was significantly increased after transplantation, determined by immunofluorescence staining and laser confocal scanning microscopy. Bone marrow mesenchymal stem cells that had migrated into the damaged area of rats in the experimental group began to express choline acetyltransferase, glutamic acid decarboxylase and synapsins, 3 weeks after transplantation. The Basso-Beattie- Bresnahan scores positively correlated with expression of choline acetyltransferase and synapsins. Experimental findings indicate that intravenously transplanted bone marrow mesenchymal stem cells traverse into the damaged spinal cord of rats, promote expression of choline acetyltransferase, glutamic acid decarboxylase and synapsins, and improve nerve function in rats with spinal cord injury.     

Chondroitinase ABC plus bone marrow mesenchymal stem cells for repair of spinal cord injury

As chondroitinase ABC can improve the hostile microenvironment and cell transplantation is proven to be effective after spinal cord injury, we hypothesized that their combination would be a more effective treatment option. At 5 days after T8 spinal cord crush injury, rats were injected with bone marrow mesenchymal stem cell suspension or chondroitinase ABC 1 mm from the edge of spinal cord damage zone. Chondroitinase ABC was first injected, and bone marrow mesenchymal stem cell suspension was injected on the next day in the combination group. At 14 days, the mean Basso, Beattie and Bresnahan score of the rats in the combination group was higher than other groups. Hematoxylin-eosin staining showed that the necrotic area was significantly reduced in the combination group compared with other groups. Glial fibrillary acidic protein-chondroitin sulfate proteoglycan double staining showed that the damage zone of astrocytic scars was significantly reduced without the cavity in the combination group. Glial fibrillary acidic protein/growth associated protein-43 double immunostaining revealed that positive fibers traversed the damage zone in the combination group. These results suggest that the combination of chondroitinase ABC and bone marrow mesenchymal stem cell transplantation contributes to the repair of spinal cord injury.     

Adenovirus-mediated human brain-derived neurotrophic factor gene-modified bone marrow mesenchymal stem cell transplantation for spinal cord injury

Rat bone marrow mesenchymal stem cells expressing brain-derived neurotrophic factor were successfully obtained using a gene transfection method,then intravenously transplanted into rats with spinal cord injury.At 1,3,and 5 weeks after transplantation,the expression of brain-derived neurotrophic factor and neurofilament-200 was upregulated in the injured spinal cord,spinal cord injury was alleviated,and Basso-Beattie-Bresnahan scores of hindlimb motor function were significantly increased.This evidence suggested that intravenous transplantation of adenovirus-mediated brain-derived neurotrophic factor gene-modified rat bone marrow mesenchymal stem cells could play a dual role,simultaneously providing neural stem cells and neurotrophic factors.     

Bone marrow mesenchymal stem cells and spinal cord injury repair

Totally three articles focusing on bone marrow mesenchymal stem cell transplantation under hypothermia, gene-modified bonemarrow mesenchymal stem cell transplantation and simple bone marrow mesenchymal stem cell transplantation     

骨髓间充质干细胞移植对大鼠脊髓损伤后脑神经生长因子表达影响的研究

背景: 近年来关于骨髓间充质干细胞移植对脊髓损伤修复方面的研究较多,但目前相关机制尚不清楚。 目的：观察间充质干细胞移植对大鼠脊髓损伤后脑源性神经营养因子表达的影响。 设计、时间及地点：随机对照动物实验,于2003-04/07在中国医科大学神经解剖学实验室完成。 材料：选取鼠龄3个月的SD大鼠64只,雌雄不拘,体质量250~300 g,随机抽取4只大鼠用于骨髓间充质干细胞的分离与培养,其余60只用于制备脊髓横断损伤模型。 方法：60只大鼠随机抽签法分为3组,细胞移植组(n=24)：脊髓损伤后第7天,无菌条件下以微量注射缓慢注入含骨髓间充质干细胞(1×109 L-1)的培养液5 μL至脊髓损伤区;PBS组(n=24)：注入等量(5 μL)磷酸盐缓冲液体;空白对照组(n=12)：注入生理盐水5 μL。 主要观察指标：分别于造模后7,14,28 d取材,观察骨髓间充质干细胞的形态变化;免疫组织化学法检测间充质干细胞移植后大鼠脊髓损伤区脑源性神经营养因子的表达。 结果：60只SD大鼠均进入结果分析。10代以后细胞增殖能力有所减弱,胞体变得扁平,若加入碱性成纤维细胞生长因子,则可维持其增殖能力和形态。大鼠脑源性神经营养因子在正常大鼠脊髓组织中有一定表达,细胞移植后第7,14,28天,细胞移植组脑源性神经营养因子表达均高于PBS组和空白对照组(P < 0.05);空白对照组与PBS组脑源性神经营养因子表达无明显差异(P > 0.05)。 结论：骨髓间充质干细胞在移植后通过上调脑源性神经营养因子的表达从而促进轴突的再生,可能是治疗脊髓损伤的重要机制。