sCD14在内毒素诱导巨噬细胞活化中的调节机制

目的 观察不同浓度的sCD14和脂多糖（LPS）经过孵育和不孵育同时刺激佛波醇酯（PMA）诱导分化的THP-1细胞分泌肿瘤坏死因子-α（TNF-α）,以研究sCD14在LPS转运和活化过程中的重要调节作用.方法 通过细胞培养,实验细胞为PMA诱导分化的THP-1细胞;同时将实验分为sCD14组（终浓度分别为1、0.5、0.1、0.01μg/ml）、sCD14～LPS混合物预孵育组（LPS终浓度分别为10、1ng/ml;sCD14终浓度为分别1、0.5、0.1、0.01μg/m1）、sCD14-LPS不孵育组（LPS终浓度分别为10、1ng/ml;sCD14终浓度为1、0.5、0.1、0.01μg/ml）,并分别培养4h后,吸出上清液至1.5ml的离心管中,于-70℃内保存并采用化学发光法检测TNF-α.结果 sCD14本身不能刺激单核细胞分泌TNF-α;LPS浓度为1ng/ml、sCD14浓度为0.01μg/ml和0.1μg/ml时,与LPS单独刺激TNF-α分泌量的差异均无统计学意义（均P＞0.05）;sCD14浓度为0.5μg/ml和1μg/ml时,TNF-α分泌量的差异均有统计学意义（P＜0.05或0.01）.在LPS浓度为10ng/ml、sCD14浓度为0.5μg/ml和1μg/ml时,与LPS单独作用TNF-α分泌量均有显著性差异（均P＜0.01）.sCD14/LPS混合物预孵育组曲线低平,无明显分泌高峰.结论 适当浓度的sCD14可明显增强LPS对单核巨噬细胞的活化作用,且在LPS高浓度时尤为明显,而将sCD14和LPS混合孵育可使上述效应减少甚至消失.     

提高重组抗菌蛋白BPI23在E.coli中表达水平和复性率的研究

目的:提高重组抗菌蛋白BPI23在E.coli DH 5α中的表达水平及提纯后蛋白的复性率.方法:通过降低目的基因5′端序列中GC含量和构建双拷贝重组表达载体pBV220-(synBPI600)2,减少低频密码子数目和增加目的基因拷贝数,并采用不同复性方法对提纯后的蛋白进行复性.结果:降低目的基因5′端序列中GC含量后,目的蛋白表达量占菌体总蛋白的14.3%;单双拷贝重组表达载体转化E.coli DH 5α后,目的蛋白的表达水平无明显差异;在复性液中加入PEG4000后,目的蛋白产生聚集沉淀较少.结论:减少目的基因中GC含量可显著提高BPI23的表达水平,增加表达载体中目的基因的拷贝数对其表达水平无影响,在蛋白复性液中加入PEG4000可明显抑制蛋白聚集沉淀.     

脂多糖结合蛋白抑制肽对内毒素诱导的人单核巨噬细胞株表达CD14的影响

目的研究脂多糖结合蛋白(LBP)抑制肽对内毒素(LPS)诱导的人单核巨噬细胞株U937细胞表达CD14的影响。方法佛波脂(PMA)诱导U937成熟后分为5组:正常对照组、LPS组(100ng/mLLPS 100ng/mLrhLBP)、低剂量抑制肽组、中剂量抑制肽组及高剂量抑制肽组,后3组分别给予10、100和1000ng/mL抑制肽。用RTPCR和蛋白定量方法(Westernblot)测定CD14mRNA和蛋白的表达,ELISA测定培养上清液中肿瘤坏死因子α(TNFα)的含量。结果LBP抑制肽显著抑制LPS刺激后U937细胞CD14的mRNA与蛋白表达,同时也抑制了TNFα的分泌,较LPS组有显著差异。结论LBP抑制肽通过抑制由CD14介导的LPS信号跨膜转导和TNFα的分泌,对LPS所致疾病如脓毒血症、急性肺损伤可能有潜在的治疗作用。     

健脾活血方对酒精复合内毒素脂多糖诱导的肝损伤大鼠库普弗细胞活化信号通路的干预

目的:观察健脾活血方对酒精复合内毒素脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的肝损伤大鼠库普弗细胞活化信号通路的影响。方法:采用Lieber-Decarli酒精饮料饲养6周诱导的酒精性肝损伤模型,分设正常组,无酒精饮料组,酒精饮料组和酒精饮料加健脾活血方组,造模第3周起灌胃给药或蒸馏水至第6周末,各组再以LPS 10 mg/kg一次性灌胃,3.5 h后取材。检测血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)活性和肝组织甘油三酯(triglyceride,TG)含量;HE染色观察大鼠肝组织病理改变;CD68免疫组化观察库普弗细胞活化状态;ELISA法检测门脉血浆肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)含量;Western-blotting方法检测肝组织TNF-α、磷酸化的IκB(phosphorylation-IκB,P-IκB)、Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)、CD68蛋白表达。结果:经健脾活血方干预后,大鼠肝脏组织病理损伤减轻,肝组织TG含量以及血清ALT活性和门脉血浆TNF-α含量下降;同时,大鼠肝脏TNF-α、P-IκB、TLR4和CD68蛋白表达明显减轻。结论:健脾活血方对酒精复合LPS诱导的肝损伤大鼠CD68、TLR4、P-IκB和TNF-α具明显抑制作用。     

内毒素血症中脂多糖相关蛋白的混合调节机制

目的：研究内毒素血症发生时多种脂多糖（LPS）相关蛋白在LPS转运及活化中的调节作用。方法：培养佛波醇酯（PMA）诱导分化的THP-1细胞。选取LPS、脂多糖结合蛋白（LBP）、可溶性CD14（sCD14）、杀菌/渗透增强蛋白（BPI）、高密度脂蛋白（HDL）5因素2水平采用L16（215）正交设计。配制实验体系,培养4 h后,留取上清液,发光法检测TNF-α分泌量。结果：混合体系中,BPI和HDL存在负向效应,LBP、LPS和sCD14存在正向调节效应。TNF-α分泌量与sCD14、BPI的单独主效应有关（P〈0.05）,并与LBP和sCD14、LBP和HDL、LPS和LBP的交互作用有关（P〈0.05）。结论：在体内多种相关蛋白同时存在时,LPS对单核巨噬细胞的活化与sCD14、BPI的单独效应有关,并与LBP和sCD14、LBP和HDL、LPS和LBP交互作用有关。     

LBP抑制肽对内毒素诱导的脓毒血症小鼠的保护作用

目的 研究脂多糖结合蛋白抑制肽(P12)对内毒素脂多糖(LPS)诱导的脓毒血症小鼠TLR4、CD14及肿瘤坏死因子a(TNFa)表达和小鼠生存率的影响.方法 40只小鼠随机分为5组:对照组、内毒素血症组、低剂量P12组、中剂量P12组和高剂量P12组,每组8只.腹腔内注射LPS复制脓毒血症模型,尾静脉注射P12,蛋白定量方法 (Western blot)检测TLR4和CD14蛋白的表达,ELISA法检测小鼠血清中TNF-a的含量.结果 抑制肽组TLR4和CD14蛋白的OD值较LPS组低,较正常组高.脓毒血症组小鼠血清中TNF-a的含量显著高于对照组[(180.17±39.14)pg/mL比(24.88±5.82)pg/mL,P<0.01];低剂量P12组、中剂量P12组和高剂量P12组血清中TNF-a的含量分别为(112.69±19.78)、(86.34±9.25)和(70.48±8.48)pg/mL,均明显低于脓毒血症组(均P<0.05).结论 脂多糖结合蛋白抑制肽通过抑制由TLR4和CD14介导的LPS跨膜信号转导,降LSP诱导的TNFa的释放,提高了脓毒血症小鼠的生存率.表明脂多糖结合蛋白抑制肽对急性肺损伤或脓毒血症可能具有潜在的预防和早期治疗作用.     

LBP对LPS诱导大鼠肺巨噬细胞TNFα、IL-10 mRNA表达的调节作用

目的探讨脂多糖结合蛋白（Lipopolysaccharide binding protein,LBP）对脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导肺巨噬细胞中TNFα和IL-10表达的调节作用机制。方法经硫酸铵盐析、Bio-Rex70阳离子交换层析和MonoQ阴离子交换层析,从大鼠急性反应期血清中分离纯化LBP。分别用10 ng/ml和1 000 ng/ml的LPS刺激肺泡巨噬细胞,并加入不同浓度LBP,观察肺泡巨噬细胞中TNFα和IL-10 mRNA的表达。结果纯化的大鼠LBP在SDS-PAGE的60×103处呈现单一条带,并可增强LPS与单核细胞的结合。当LPS为10 ng/ml时,LBP可明显增强LPS诱导肺巨噬细胞中TNFα和IL-10 mRNA的表达,但LBP为10 μg/ml时,对LPS的增敏作用反而有所减弱。当LPS为1 000 ng/ml时,LBP对LPS无调节作用。结论 LBP对LPS的调节作用呈明显的剂量依赖性,而高浓度LPS不需要LBP的增敏作用,可能通过LBP非依赖途径直接激活靶细胞。     

兔源内毒素结合蛋白的提取纯化及体外生物学活性研究

目的　从烧伤合并内毒素血症损伤兔的血清中分离纯化出内毒素结合蛋白 (Lipopolysaccharide BindingProteinLBP) ,以研究LBP在烧伤复合内毒素血症中的作用。方法　兔血清中蛋白质通过二步离子交换层析 (Bio Rex 70Resin、Mono Q)及凝胶过滤来分离纯化 ,并经流式细胞分析实验、绵羊红细胞凝聚实验、氨基末端氨基酸残基测序等方法鉴定 ,再将LBP作用于体外培养的人单核细胞 (U93 7) ,观测其分泌TNFα等细胞因子的状况。结果　获得一种分子量为 60× 10 3蛋白质 ,其N端 10个氨基酸序列为TNPGLITRIT ,与NCBI蛋白质库中有关兔的氨基酸序列进行比较 ,发现其与LBP的序列相同 ,它能促进脂多糖 (LipopolysaccharideLPS)与外周血单核细胞 (PBMC)结合 ,并能促进U93 7在极低浓度的LPS用下分泌TNFα。结论　从血清中分离纯化带有生物活性、全长LBP是可行的 ,LBP能促进极低浓度的LPS与单核细胞结合 ,介导炎性因子的分泌 ,从而促进炎症反应的发生。     

不同来源茶树油抑制LPS诱导TNF-α释放的体外实验

目的 比较国产和进口茶树油(tea tree oil,TTO)对脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导炎症的抑制作用.方法 四唑盐(MTT)比色实验筛选无细胞毒性作用的TTO溶液浓度;各浓度TTO水溶液按量效和时效关系预处理细胞后,测定LPS激活RAW264.7细胞分泌肿瘤坏死因子-α(tumor necrotic factor-alpha, TNF-α)的浓度,以观察国产和进口TTO水溶液对LPS诱导炎症的抑制效果.结果 浓度低于0.001%的国产和进口TTO溶液对细胞无毒性作用;0.000 125%～0.001%进口TTO和0.000 25%～0.001%国产TTO各浓度组均能非常显著地抑制LPS诱导细胞释放TNF-α;0.000 25%进口和国产TTO分别在3 h和6 h内对细胞有显著的保护作用.结论 国产和进口TTO对LPS诱导的炎症均有显著抑制效果.     

内毒素诱导正常人单核细胞活化中CD69、TNF-α、IL-6的表达变化及意义

目的探讨内毒素诱导正常人单核细胞活化时抗原分子CD69、肿瘤坏死因子-α．（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）的变化及意义。方法采集10例健康人外周静脉血20ml,经乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝。通过Fi—coll—Hvpaque联合PercoU分离液分离纯化单核细胞后体外培养,设未干预组为对照,实验组予内毒素分别刺激30min、1、2、4h后收集细胞与上清液。通过流式细胞术检测单核细胞表面CD69的阳性细胞百分比,Luminex方法检测上清液中TNF-α、IL-6的浓度。结果分离的单核细胞纯度达95．5％。单核细胞表面CD69的表达率在内毒素刺激2、4h分别为（25．1±1．8）％、（41．7±1．4）％,明显高于对照组[（22．1±1．4）％,P均〈0．05]。上清液中TNF-α在内毒素刺激2、4h分别为（453．6546±163．6168）pg／ml、（1633．7878±528．8399）pg／ml,明显高于对照组[（O．1191±0．2135）pg／m],P均〈0．051。内毒素刺激4h时IL-6为（1464．4510±488．3783）pg／m],明显高于对照组[（0．0539±0．0955）pg/ml,P〈0．051。结论CD69、TNF-α、IL-6的表达上调与内毒素诱导单核细胞的活化密切相关。     

脂多糖激活p38在诱导肿瘤坏死因子α基因表达中的作用

目的探讨防治内毒素休克的新方法,研究脂多糖（ＬＰＳ）诱导肿瘤坏死因子α（ＴＮＦα）表达的分子机制。方法用蛋白激酶活性测定检测ＬＰＳ刺激引起的激酶活性变化;共聚焦激光扫描技术显示ｐ３８激活移位;用反转录聚合酶链反应和报告基因系统研究ＴＮＦα基因转录的分子机制。结果发现ＬＰＳ刺激ＲＡＷ细胞引起ｐ３８激活并由胞浆移位至胞核。ＬＰＳ刺激引起ＴＮＦαｍＲＮＡ表达增加,而且由ＬＰＳ引起的ＴＮＦα的转录活性可被ｐ３８特异性抑制剂所抑制。结论激活的ｐ３８通过磷酸化转录因子增加ＴＮＦα基因转录活性,这是中毒性休克时ＴＮＦα生成增加的一个重要机制。ｐ３８是ＬＰＳ诱导ＴＮＦα基因表达的重要调节物质。     

脂氧素A4通过p38 MAPK及Nrf2通路调控气道炎症反应

目的：研究脂氧素A4（LXA4）对脂多糖（LPS）诱导的人正常支气管上皮细胞炎症反应的抑制作用及其机制。方法：将对数生长期的BEAS-2B细胞分为3组。对照组：不做任何处理;LPS组：100 ng/mL LPS刺激24 h;LPS+LXA4组：100 nmol/L LXA4预处理30 min,加入100 ng/mL LPS刺激24 h。qPCR法检测IL-6、IL-1β、血红素加氧酶-1（HO-1）、醌氧化还原酶（NQO-1）mRNA表达水平;流式细胞术测定胞内活性氧（ROS）水平;谷胱甘肽（GSH）试剂盒检测GSH水平。为进一步了解LXA4的作用机制,Western blot法检测各处理组p38的磷酸化水平以及Nrf2的核转位及磷酸化水平。结果：与对照组相比,LPS组IL-6、IL-1β mRNA以及胞内ROS表达水平升高（P＜0.05）,HO-1 mRNA水平下降（P＜0.01）,p38磷酸化水平上升（P＜0.01）,胞核中Nrf2相对表达量下降（P＜0.01）,总Nrf2磷酸化水平下降（P＜0.05）。经LXA4干预后,与LPS组相比,除上述改变逆转外（P＜0.05）,NQO-1和GSH水平显著上升（P＜0.05）。结论：LXA4可减轻LPS引起的BEAS-2B细胞炎症反应并促进炎症消退,其机制可能一方面与抑制p38 MAPK通路,减少促炎因子的分泌有关;另一方面与增强Nrf2的核转位以及磷酸化,减轻氧化应激损伤有关。     

阿斯匹林抑制内毒素致猪肺泡巨噬细胞核因子-κB活化的作用

目的探讨阿斯匹林对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)致猪肺泡巨噬细胞(alveolarmacrophages,AM)核因子kappaB(nuclearfactorkappa-B,NF-κB)活化抑制作用的机制。方法AM经单独或联合应用阿斯匹林、CalphostinC及过氧钒酸盐预处理,分别予以LPS刺激,以Western方法测定其IκBα水平及EMSA方法检测NF-κB活化程度。结果LPS(10μg/mL)刺激后,AMNF-κB在15min即可检测到,并于1、2h达到峰值,AM胞浆IκBα水平在5min起开始下降,低谷出现在LPS刺激后45min。治疗剂量阿斯匹林可抑制LPS引起的AMNF-κB活化及IκBα降解,PTP抑制剂POV可增强LPS刺激后AMNF-κB活化水平,阿斯匹林能减低该效应;PKC抑制剂CalphostinC可降低LPS引起的AMIκBα降解程度,且阿斯匹林与之具协同效应。结论阿斯匹林可通过影响AM蛋白激酶-磷酸酶系统平衡,抑制LPS致AMIκBα磷酸化降解及NF-κB活化。     

球松素对脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用

目的观察球松素对人脐静脉内皮细胞的保护作用。方法采用灌注消化法分离培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC）,并对其进行形态学和免疫组织化学染色鉴定。用脂多糖（LPS）诱导建立人脐静脉血管内皮细胞的损伤模型,随后用球松素作用于受损伤细胞,观察其对HUVEC的保护作用。结果倒置显微镜下可见细胞呈梭形,单层铺路石状排列,Factor VIII相关抗原免疫组织化学染色鉴定阳性。100μg/L的LPS对脐静脉内皮细胞生长有明显的抑制作用,可作为人脐静脉内皮损伤模型的造模浓度。球松素能减轻LPS对细胞的损伤（P〈0.05）,并呈剂量依赖关系。结论球松素对LPS所诱导的人脐静脉内皮细胞损伤有保护作用。     

氯胺酮抑制内毒素诱导的核因子-κB及肿瘤坏死因子α的体内研究

目的：研究氯胺酮对脓毒症时重要器官核因子-κB(NF—κB)活性及其肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平的的影响。方法：成年雄性Wistar大鼠被随机分为6组：正常对照组(等渗盐水10ml／kg)；内毒素(5mg／kg)组；内毒素(5mg／kg) 氯胺酮(0．5mg／kg)组；内毒素(5mg／kg) 氯胺酮(5mg／kg)组；内毒素(5mg／kg) 氯胺酮(50mg／kg)组；氯胺酮(50mg／kg)组。2h后以EMSA法测定肺、肝、肠和肾组织NF-κB的活性；以ELISA法测定TNF-α的水平。结果：与对照组相比，体内注射内毒素可增强肺、肝、肠和肾组织NF—κB的活性及TNF-α的释放。氯胺酮(0．5、5、50mg／kg)可抑制肠和肾组织NF—κB活性及TNF-α的释放，而抑制肺部NF-κB及TNF—α所需氯胺酮的最小剂量为5mg／kg。氯胺酮(0．5、5、50mg／kg)不能抑制肝NF-κB活性及TNF-α的释放，50mg／kg的氯胺酮反而会增加肝NF-κB的活性，促进TNF-α的生成。结论：氯胺酮可抑制脓毒症时NF—κB的活性及TNF-α的释放，亚麻醉剂量氯胺酮具有抗炎作用；而大剂量可能对机体有害。     

L-NAME对内毒素致大鼠肺动脉内皮细胞损伤的保护作用

目的探讨左旋硝基精氨酸甲酯（L—NAME）是否对内毒素脂多糖（LPS）导致的大鼠肺动脉内皮细胞（RPAECs）损伤具有保护作用。方法利用大鼠肺动脉组织块贴壁法进行细胞原代培养。通过形态观察和Ⅷ因子相关抗原抗血清间接免疫荧光染色对细胞进行鉴定。将细胞分组，LPS、L—NAME与细胞共育24小时，检测各组细胞及培养上清中的硝基酪氨酸阳性细胞百分比（NT％）和乳酸脱氢酶（LDH）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、内皮素-1（ET-1）的含量。结果L—NAME组中LDH（2237．04±50．32，2104．26±58．57）、MDA（8．36±0．25，7．26±0.24）比LPS组LDH（2553．01±55．75）、MDA（10．95±0．33）明显降低（P〈0．05），SOD（41．09±2．20，50．76±2．66）较LPS组SOD（33．16±2．9）明显升高（P〈0．05），NT％（33．7±1．94％，28．88±1．73％）与LPS组（40．28±2．3％）相比显著下降（P〈0．05），ET-1为（417．98±21．44，467．8±17．94Pg／ml，505．88±20pg／m1）与LPS组ET-1（391．67±14．62pg／m1）相比明显升高（P〈0．05）。结论L—NAME可能通过抗氧化作用来保护大鼠肺动脉内皮细胞。但是L—NAME升高细胞培养上清中的ET-1，单独用药可能导致肺动脉压力的增高。     

热休克反应对内毒素诱导的IP-10基因表达的影响

目的探讨在RAW264.7巨噬细胞中热休克反应(HSR)对大肠杆菌内毒素(脂多糖,LPS)诱导的干扰素诱导蛋白10(IP-10)表达的影响。方法RAW264.7巨噬细胞分别给予不同剂量及不同反应时间的LPS处理,并行HSR后抽提总RNA进行RT-PCR实验。结果LPS可促进RAW264.7巨噬细胞中IP-10基因的转录,具有剂量依赖性;用浓度为600μg/L的LPS刺激2h并行HSR时,IP-10的mRNA表达量最大。结论HSR能促进LPS诱导的IP-10基因mRNA表达水平。     

红细胞贮存时间对脂多糖诱导的中性粒细胞炎症释放的影响

目的研究红细胞（RBC）随保存时间的延长对受者中性粒细胞（PMN）炎症释放水平的影响。方法分别将红细胞在保存的第1、21、35天（D1、D21、D35）分离上清,-20℃冻存备用。将冻存的上清与健康受者PMN体外培养12 h后,加入脂多糖（LPS）后培养12、24 h收集上清冻存待检。用ELISA方法检测其IL-6和TNF-α水平。结果红细胞在LPS的刺激下IL-6水平随保存时间延长而增高,差异有统计学意义（P〈0.05）,TNF-α水平也有所增高,但差异无统计学意义（P〉0.05）。结论在LPS的刺激下,D35较之D1红细胞上清促使PMN释放更多的IL-6和TNF-α,可以解释为输注保存时间长的红细胞增强了PMN的炎症反应,这对预防患者在大量输血后引发的相关免疫反应有一定作用。     

LPS和IL-10对低密度脂蛋白诱导泡沫细胞形成的影响

目的探讨动脉粥样硬化早期泡沫细胞形成与致炎症因子脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和抗炎因子白介素-10(interleukin-10,IL-10)的相互作用关系。方法以佛波醇酯(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)诱导单核细胞株THP-1细胞分化为巨噬细胞,再以氧化型低密度脂蛋白刺激巨噬细胞形成泡沫细胞,采用油红O染色法同时观察致炎症因子LPS及抗炎因子IL-10在这一过程中对泡沫细胞形成的干预作用。结果氧化型低密度脂蛋白单独刺激巨噬细胞24 h后泡沫细胞的形成率由对照组的(9.77±1.70)%增加到刺激组的(16.27±2.27)%,且随时间延长增加更明显;LPS的协同作用能增加到40%以上,并随浓度升高而增多;IL-10能有效地抑制泡沫细胞形成,拮抗氧化型低密度脂蛋白和LPS的作用,且与浓度呈正相关。结论氧化型低密度脂蛋白能诱导泡沫细胞形成,LPS能明显加快泡沫细胞的转化,而抗炎因子IL-10能显著抑制这一过程。揭示血管炎症能加速泡沫细胞形成,而IL-10能抑制泡沫细胞的形成,这对延缓动脉粥样硬化进程具有重要作用。