兔雪旺细胞的培养方法及形态学研究

利用兔坐骨神经组织进行体外细胞培养研究，获得雪旺细胞，脱雪旺细胞的形态与其他文献报道的鼠或人的外周神经培养获得的雪旺细胞形态基本相似，典型的雪旺细胞形态特征为胞体较小、梭形、两侧突起纤长，核窄长，侄置 显微镜下看，胞体四周常用亮边，细胞成极性生长排列。     

与雪旺细胞联合培养的成肌细胞生物学特性研究

目的 探讨体外联合培养条件下雪旺细胞对成肌细胞生物学特性的影响，为神经化人工肌肉的构建提供理论依据．方法 碘酒．酒精消毒后．剥离并获取新生SD乳鼠的臂丛、坐骨神经及小腿三头肌，手术显微镜下彻底剥除其外膜、血管和脂肪，充分剪碎神经和肌肉组织．胰酶、胶原酶混合消化分离，DMEM培养基联合培养雪旺细胞与成肌细胞。倒置相差显微镜观察联合培养状态下两种细胞的形态及生长情况；^3HTdR同值素标记掺入及液闪计数，每分钟射线绝对衰变数(DPM)判断雪旺细胞分泌物对成肌细胞增殖的影响：统计不同培养时间的肌管形成率．并采用横纹肌肌功蛋白免疫组织化学显色(SABC)及图像分析检测雪旺细胞对成肌细胞功能分化程度的影响。结果 联合培养的成肌细胞生长增殖旺盛．肌管出现早、外形粗长．DPM峰值远高于对照组：横纹肌肌动蛋白反应阳性细胞呈棕褐色．联合培养的成肌细胞胞浆中肌动蛋白灰度值明显高于单独培养的成肌细胞。结论 与雪旺细胞联合培养有利于原代培养大鼠成肌细胞的生长、增殖及其功能分化．     

成年鼠坐骨神经雪旺细胞体外培养的实验研究

目的探讨从成年鼠坐骨神经分离培养获得大量雪旺细胞的有效手段。方法取SD大鼠双侧预变性的坐骨神经．预变性后，剪碎至1mm^3。大小的组织块，单酶消化法进行分离培养，GenetiCin液抑制成纤维细胞生长，低浓度酶快速消化传代进一步纯化雪旺细胞，通过相差显微镜活细胞计数和S-100细胞化学标记相结合鉴定了雪旺细胞增值和纯化程度。结果通过上述方法分离培养获得了经S-100蛋白鉴定纯度为85％的第三代雪旺细胞，细胞数量为2．764×10^7／ml，细胞形态多数为梭形。结论本方法可从大鼠预变性的坐骨神经获得形态与活力良好的雪旺细胞。     

新生SD大鼠坐骨神经雪旺细胞培养与纯化的方法学研究

目的探讨简单、可靠地获取大量纯度高、活力强的雪旺细胞的细胞培养方法。方法选用新生4～6d的SD大鼠,解剖双侧坐骨神经,在解剖镜下剥离去除神经外膜,获得神经束。将其剪碎,采用双酶二次消化法消化,DMEM培养液培养4d后应用G-418纯化,4d后对培养的细胞进行细胞计数、活力测定和免疫细胞化学鉴定。结果该法从新生大鼠双侧坐骨神经可提取3.62×106个雪旺细胞,纯化后经S-100蛋白免疫细胞化学染色,雪旺细胞的纯度可达96%以上。细胞活力强,经培养8d后即可进行传代。结论该方法可以获得纯度高、活力强的大量雪旺细胞,满足组织工程人工神经的需要。     

利用Geneticin纯化雪旺细胞的实验研究

目的：了解Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ在雪旺细胞培养过程中去除成纤维细胞的作用。方法：组织块法培养雪旺细胞，４～３天后应用含有１００μｇ／ｍｌ浓度的Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ培养液培养４～５天，再改用普通培养液进行培养，并进行细胞传代，利用Ｓ－１００蛋白和ＧＦＡＰ（胶质纤维酸性蛋白）进行免疫组化染色，鉴定培养的雪旺细胞。结果：应用含有Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ的培养液培养雪旺细胞４～５天后成纤维细胞基本消失，雪旺细胞仍生长良好，并可传代培养。经Ｓ－１００蛋白和ＧＦＡＰ免疫组化染色鉴定培养的细胞基本为染色阳性的雪旺细胞。结论：应用含Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ的培养液培养雪旺细胞能够有效地去除成纤维细胞，获得纯度高、活力良好的雪旺细胞。     

不同部位取材的雪旺细胞培养与纯化研究

目的探讨不同部位取材分离纯化雪旺细胞(Schwann cells,SCs)的纯度、活性以及数量差异,为神经缺损修复提供优质、足量种子细胞奠定理论基础。方法 6只5日龄SD大鼠,雌雄不限,体重8～10 g;切取背根神经节(实验组)和坐骨神经(对照组)。采用联合酶消化加机械吹打法分离培养SCs,并进行纯化及传代培养。取第1代SCs,用计数法绘制8 d内SCs生长曲线,MTT法检测8 d内SCs增殖情况,抗S-100免疫细胞化学检测SCs纯度,ELISA法检测脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)浓度。结果每只大鼠可切取背根神经节36～43个。消化成单个细胞后计数,实验组可获取(7.5±0.6)×106个SCs,对照组可获取(3.5±0.4)×106个SCs,差异有统计学意义(t=13.175,P=0.000)。两组SCs第3天开始进入对数增长期,随培养时间延长,细胞数及细胞增殖吸光度(A)值均呈上升趋势;且培养3、4、5、6 d时,实验组细胞数及A值明显高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。经S-100免疫细胞化学检测,实验组SCs纯度为92.08%±3.45%,对照组为77.50%±3.57%,差异有统计学意义(t=6.869,P=0.001)。ELISA法检测示实验组培养3 d和5 d时BDNF浓度均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论与坐骨神经相比,取材于背根神经节能获得数量更多、纯度和活性更高的SCs,为神经损伤修复创造了必要条件。     

单酶消化复合植块法培养雪旺细胞的实验研究

目的探讨一种快速获取高纯度、高活性雪旺细胞的分离、培养方法,并从转录及翻译水平对获取细胞进行鉴定。方法取4周龄SD大鼠双侧坐骨神经,胶原酶Ⅰ消化15 min后接种于培养瓶中,进行体外培养并按1∶2比例传代,倒置相差显微镜观察细胞生长状态及形态变化,MTT法检测细胞增殖情况并绘制生长曲线,RT-PCR检测S100及胶原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)基因表达情况,并行免疫组织化学染色观察S100及GFAP蛋白表达水平,计算细胞纯度。结果胶原酶Ⅰ消化后组织块培养24 h即可见成纤维样细胞迁出,胞体细长,折光性较弱;48 h后可见大量细胞迁出,细胞多呈双极或三极,突起细长,胞体饱满,折光性强,72 h形成细胞集落。细胞传代后48～72 h即可长满瓶底,并出现螺旋形细胞集落,多次传代后细胞仍生长旺盛,细胞质饱满。MTT结果显示,第3代细胞第3天即进入对数生长期,随时间延长逐渐增殖,第7天进入平台期,生长曲线呈"S"形。RT-PCR结果示培养细胞表达S100、GFAP基因;免疫组织化学染色检测显示大部分细胞呈阳性染色,表达S100及GFAP蛋白,雪旺细胞纯度为98.37%±0.30%。结论单酶消化复合植块法可以快速获得高纯度、高活性的大鼠雪旺细胞。     

植块法与酶消化法结合培养原代大鼠雪旺细胞

目的:探讨利用植块法与酶消化法相结合培养大鼠原代雪旺细胞的可行性;并研究其增殖规律.方法:取10只新生2～3d的SD大鼠双侧坐骨神经;剥除神经外膜;剪成约1mm3大小的碎块;用0.03%胶原酶和0.25%胰蛋白酶按1:2对神经碎块消化12min;加入少量含10%胎牛血清的DMED培养基小心吹打细胞及组织块;再植于培养皿中培养.用S-100免疫组化染色鉴定雪旺细胞;结合Hoechst3342染色计算其纯度;在显微镜下确定细胞数量.结果:在植块培养24h后即有大量细胞迁出;2～6d细胞生长迅速;10d以后生长较为缓慢;其倍增时间为2-3d.经S-100染色证实所培养细胞为雪旺细胞;结合Hoechst3342染色可得其培养8d时纯度为95.1%;传代后纯度可达96.3%.10只新生鼠培养12d后可得细胞数约为4.8×106个.结论:利用植块法与酶消化法相结合的方法可以迅速获得大量高纯度的雪旺细胞;其增殖速度在前6d最快;倍增时间为2.3d.     

大鼠神经干细胞与小鼠雪旺细胞混合培养的研究

外培目的观察小鼠雪旺细胞体养时对大鼠神经干细胞存活及分化的影响。方法获取Wistar鼠坐骨神经并采用组织块法分离和纯化雪旺细胞；体外分离新生乳鼠脑神经干细胞，将雪旺细胞和神经干细胞分别培养扩增后进行共培养。共分5组进行：实验组1（NSC悬浮＋SC悬浮＋DMEM／F12）；实验组2（NSC悬浮＋SC贴壁＋DMEM／F12）；试验对照组1（SC培养基＋NSC＋DMEM／F12）；试验对照组2（EGF／bFGF＋NSC＋DMEM／F12）；试验对照组3（NSC＋DMEM／F12）。倒置相差显微镜对各组培养细胞每天观察形态和计数，免疫组织化学检测混合培养细胞特异性标记物的表达：SC采用P0和S100，NS采用nestin标记，神经干细胞分化神经元分别采用GFAP、GalC、Tubulin-β染色。结果共培养组NF染色阳性神经元样细胞的百分率明显高干其他各组；实验组1克隆球直径明显高于其他各组，其平均直径为8μm；实验组神经元样细胞突起的长度比对照组的长，3周长度差为26．5-67．3μm。结论大鼠神经干细胞与小鼠雪旺细胞共培养使两者不仅能够共生，而且雪旺细胞能显著促进体神经干细胞分化为神经元样细胞；神经干细胞分化神经元突起增长并且有序排列成轴索样结构。     

周围神经高压电击伤后雪旺细胞DNA定量分析及形态学变化

目的 探讨周围神经高压电击伤后雪旺细胞及神经纤维损伤的特点和机制。方法 采用高压电击伤家兔模型,30只家兔分为对照组（9只）和实验组（21只）,分别于伤后0、3、7、10、14、21d,在光、电镜下观察其坐骨神经的形态结构变化,并作雪旺细胞DNA定量的动态变化分析。结果 坐骨神经组织的轴突、髓鞘持续变性,新生受抑制;雪旺细胞DNA合成在伤后3d启动;电流在周围神经横断面上分布不均匀。结论 雪旺细胞DNA合成的迟发启动与轴素、雪旺细胞的继发性坏死及新生过程受抑制,是周围神经高压电击伤的明显特征。     

许旺细胞诱导下脂肪来源干细胞向神经细胞方向分化的研究

目的 探讨脂肪来源干细胞(ADSCs)和SD大鼠许旺细胞(Schwann cells)利用Transwell非接触式共培养时生长增殖特性和向神经元样细胞分化的规律.方法 取1月龄SD大鼠腹股沟处脂肪组织,按酶原消化法获取脂肪来源干细胞,同时取大鼠坐骨神经按改良植块法获取许旺细胞.取P3代脂肪来源干细胞分三组:A组使用ADSCs和许旺细胞构建Transwell非接触式共培养体系,B组利用β-巯基乙醇(BME)、丁酸酯羟基茴香醚(BHA)作为脂肪来源干细胞诱导因子使其向神经方向诱导,C组脂肪干细胞为对照组.比较各组细胞形态,观察脂肪来源干细胞代谢、轴突生长、免疫荧光染色情况,并做统计学分析.结果 A组脂肪来源干细胞部分分化为具有细长突起的细胞,B组诱导培养后,大多数存活的细胞也同样转变为类似于神经元的形态,A组突起长度(11.64±1.64)μm,B组突起长度 (13.03±1.35)μm,差异有统计学意义(P>0.05),细胞生长代谢旺盛.A组B组诱导分化后的细胞NF表达阳性率分别为(54.16±9.35)%和(62.25±8.95)%,两者差异无统计学意义,而GFAP染色阴性.在细胞数量上,A组为(4.08±0.68)×107/L,C组(4.20±0.79)×107/L,差异无统计学意义(P>0.05),但明显高于B组(3.23±0.37)×107/L(P<0.05).结论 许旺细胞能促进脂肪来源干细胞向神经方向分化,效果与使用β-BME加BHA试剂诱导的结果相近,并能有效防止脂肪来源干细胞损伤.     

感觉性和运动性神经来源许旺细胞神经生长因子的表达

目的;研究感觉性和运动性许旺细胞神经生长因子的表达是否有区别,进而探讨对神经特异性再生的影响。方法：体外培养高纯度的运动性许旺细胞,每种细胞分别在常规和添加白细胞介素－1培养基中培养,用双抗体夹心ELISA法测量不同时间培养培养基中神经生长因子表达量。结果：两种培养条件一,感觉性许旺细胞的神经生长均呈双峰状,第二峰较第一峰明显增高,运动性许旺细胞的表达在第6、7d达峰值,但总体水平较感觉性许旺细胞为低。结论：两种许旺细胞神经生长因子的表达量和特点具有差别,这种差别可以为解释神经特异性再生提供依据。     

Novel three-dimensional nerve tissue engineering scaffolds and its biocompatibility with Schwann cells

To develop a novel scaffolding method for the copolymers poly lactide-co-glycolide acid (PLGA) to construct a three-dimensional (3-D) scaffold and explore its biocompatibility through culturing Schwann cells (SCs) on it. Methods: The 3-D scaffolds were made by means of melt spinning, extension and weaving. The queueing disci-pline of the micro-channels were observed under a scan-ning electronic microscope (SEM).The sizes of the micropores and the factors of porosity were also measured. Sciatic nerves were harvested from 3-day-old Sprague Dawley (SD) rats for culture of SCs. SCs were separated, purified, and then implanted on PLGA scaffolds, gelatin sponge and poly-L-lysine (PLL)-coated tissue culture poly-styrene (TCPS) were used as biomaterial and cell-support-ive controls, respectively. The effect of PLGA on the adherence, proliferation and apoptosis of SCs were exam-ined in vitro in comparison with gelatin sponge and TCPS. Results: The micro-channels arrayed in parallel manners, and the pore sizes of the channels were uniform. No significant difference was found in the activity of Schwann cells cultured on PLEA and those on TCPS (P>0.05), and the DNA of PLGA scaffolds was not damaged. Conclusion: The 3-D scaffolds developed in this study have excellent structure and biocompatibility, which may be taken as a novel scaffold candidate for nerve-tissue engineering.     

免疫抑制剂FK506对雪旺细胞的影响

周围神经损伤后，雪旺细胞对周围神经再生过程中的形态和功能的修复起着至关重要的作用。其增殖速度的提高可大大改善神经移植桥接体的存活率，但免疫排斥反应仍是影响异体组织工程化神经移植成败的关键所在。迄今为止，已经有很多免疫抑制剂应用于临床。免疫抑制剂FK506能有效地抑制周围神经同种异体和异种移植中的排斥反应。本综述从免疫抑制剂FK506的理化性质和作用机制及其对雪旺细胞增殖的影响因素入手，阐述免疫抑制剂FK506对雪旺细胞的增殖作用，为FK506进一步的深入研究和临床应用提供理论依据。     

周围神经损伤后巨噬细胞游走抑制因子mRNA在许旺细胞的表达状况

目的　探讨周围神经损伤后 ,许旺细胞表达巨噬细胞游走抑制因子 (macrophagemigrationinhibitoryfactor,MIF)mRNA的变化 ,明确许旺细胞及MIF在激活巨噬细胞、促进神经再生中的作用。　方法　取 50只大鼠 ,随机分为 1 0组 ,每组 5只。 1组设为正常对照组 ,其余 9组分别在预损伤坐骨神经后 1、1 2h及 1、3、7、1 0、1 4、1 7、2 1d ,分离纯化许旺细胞 ,提取RNA。采用半定量RT PCR法检测RNA的水平。经图像分析测出正常及各预损伤组MIFmRNA的相对水平。　结果　许旺细胞中MIFmRNA的表达量在神经损伤后 1 2h开始出现明显升高 (0 342 0± 0 0 0 2 6) ;伤后 7d达到最高(0 6388± 0 0 0 2 0 )后 ,维持在较高水平 ;至伤后 1 0d(0 6397± 0 0 0 2 3)开始缓慢下降 ;2 1d(0 2 76 4±0 0 0 2 7)后恢复至伤前水平。　结论　周围神经损伤后 ,许旺细胞及其所分泌的MIF在巨噬细胞聚集激活过程中可能起着重要作用     

雪旺细胞悬液植入成鼠正常脊髓

目的：了解雪旺细胞（ＳＣ）促进脊髓受损轴索再生作用。方法：将Ｗｉｓｔａｒ大鼠２０只随机分为两组,各１０只,实验组将自成鼠坐骨神经培养获取的雪旺细胞悬液（ＳＣＳ）采用显微注射植入成鼠正常胸段（Ｔ７）脊髓,对照组以相同量的Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改良细胞培养液（ＤＭＥＭ）植入。移植术后２周、６周通过组织学及免疫组织化学检查,观察移植物的存活及促进轴索再生能力。结果：实验组宿主中ＳＣ形态正常,束状排列,轴索可长入移植物中。束状排列的ＳＣ间有髓鞘碱性蛋白（ＭＢＰ）阳性纤维存在,相伴随的ＳＣ胞质亦呈ＭＢＰ阳性。对照组无再生轴索长入。结论：ＳＣ植入成鼠正常脊髓后,与宿主融合好,可存活,促进宿主再生轴索越过宿主－移植物交界面长入移植物,并形成髓鞘。     

雪旺氏细胞移植至大鼠中脑损伤区域的研究

目的　探讨雪旺氏细胞移植对电针损伤的大鼠中脑网状结构的修复作用。方法　新生大鼠坐骨神经雪旺氏细胞体外培养 ,5溴 脱氧尿嘧啶 (BrdU)标记后移植至电针损伤的大鼠中脑网状结构。免疫组织化学方法观察不同时间BrdU、生长相关蛋白 43 (GAP 43 )的表达及髓鞘染色观察新生的髓鞘。结果　雪旺氏细胞移植后 8个月仍可见BrdU阳性细胞 ,且细胞数增加 2 3 % ,并主要向损伤侧大脑皮层迁移 ;与对照组相比 ,移植后 1个月损伤的中脑神经元GAP 43的表达有显著意义 (P <0 .0 5 ) ;在损伤的脑干区域可见新生的髓鞘。结论　雪旺氏细胞对损伤的中脑网状结构有促修复作用。     

用Iodogen法标记许旺细胞源神经营养因子的实验研究

目的：用Iodogen法标记许旺细胞源神经营养因子（SDNF）,以便下一步进行了SDNF在组织的受体的研究。方法：先将Iodogen涂布于小瓶内,加入SDNF和Na^128I溶液,摇匀,在室温下反应6min,滴入Sephadex LH20柱,分步收集而成SDNF放射性碘标记物。结果：本法可获得的SDNF放射性碘标记物可达99．7％放化纯度,SDNF的神经营养活性和免疫活性没有下降,能在－80℃保存条件下较稳定,符合进行SDNF受体分析的要求。结论：用Iodogen法标记SDNF方法简单,6min内便完成,既省时又达到较高的标记率,比通常用氯胺T法容易控制,其反应交易好得多。     

壳聚糖-胶原生物膜介导雪旺细胞联合神经干细胞桥接周围神经缺损

目的 观察以壳聚糖一胶原偶联的生物膜为载体,联合移植雪旺细胞(SCs)与神经干细胞(NSCs)在坐骨神经损伤修复过程中所起的作用,评价该方法的疗效.方法 分离纯化SCs和NSCs,传代4代后共培养于壳聚糖一胶原生物膜上.32只Wistar成鼠(体重350～400 g)建立坐骨神经缺损动物模型,随机分为4组:空白组;SCs移植组;NSCs移植组;NSCs联合SCs移植组.14周后观察Cy3荧光素染色、MBP免疫酶染色及苏木素-伊红(HE)染色的结果.结果 BDA示踪显示术后联合移植组和SCs组有较多的神经纤维穿过缺损部位,大鼠右后肢感觉和运动功能恢复较其他组明显,修复神经段神经传导速度比值也大于其他组(P<0.05).SCs组和联合移植组间差异无统计学意义(P>0.05).结论 NSCs和SCs与壳聚糖一胶原生物膜相容性良好,壳聚糖一胶原生物膜介导的SCs联合NSCs桥接周围神经缺损可使部分神经再生.     

运用组织工程学原理构建许旺细胞三维培养体系

目的 探讨普通重力和模拟微重力条件下构建许旺细胞三维培养体系的方法。方法 对聚羟基乙酸细丝支架进行化学改性处理后再以层粘连蛋白进行生物学修饰;分别在普通重力和模拟微重力条件下把原代许旺细胞悬液接种在支架材料上,观察许旺细胞的粘附生长情况。结果 两种重力条件下许旺细胞在聚羟基乙酸支架表面都能良好贴壁生长,培养2d时细胞生长稳定、密度适中;模拟微重力条件下许旺细胞在支架表面的分布更均匀。结论 普通重力和模拟微重力环境都适宜构建许旺细胞的三维培养体系,模拟微重力环境可能为有利。