乙型肝炎病毒基因在哺乳动物细胞中的表达

有关乙型肝炎病毒(HBV)的研究正在不断深入,近些年的研究进一步涉及到HBV基因组表达过程中的一些问题。本文就HBV基因在人体不同组织细胞中和体外哺乳动物细胞系中的表达及调节作一综述。     

VEGF165在哺乳动物细胞中的稳定表达

目的探讨pcDNA3．1-VEGF165质粒对哺乳动物细胞的表达和转染。方法将pcDNA3．1-VEGF165质粒用电转的方法导入CHO细胞中，C418筛选细胞克隆。通过RT—PCR、ELISA、Westen—blot在转录水平和蛋白质水平上检测VEGF165在转基因CHO细胞中的表达。通过内皮细胞增殖实验和血管通透性实验检测所表达的VEGF165的生物学活性。结果获得有C418抗性的CHO细胞克隆。RT—PCR扩增出一条大小约600bp的特异性泳带，测序结果与VEGF165mRNA一致。ELISA显示细胞培养上清的VEGF浓度约为10-20ng／ml。WESTEN—BLOT检测到大小为23KD的特异性蛋白质条带。内皮细胞增殖实验显示细胞培养上清具有促内皮细胞增殖作用。血管通透性实验显示细胞培养上清明显增加毛细血管通透性。结论pcDNA3．1-VEGF165质粒真核表达系统能在哺乳动物细胞中表达具有良好生物学活性的VEGF165蛋白。     

乙型肝炎病毒前S1抗原的研究分析

目的探讨乙肝病人以乙肝病毒前S1抗原（HBV—PreS1抗原）的检测作为早期诊断乙肝病毒（HBV）感染及其传染性的依据。方法491份样品采用ELISA法做HBV—M、HBV—PreS1抗原及PCR法做HBV—DNA检测,并进行分类计算统计。结果乙肝表面抗原（HBsAg）阳性模式的样品做HBV—PreS1抗原及HBV—DNA检测,两者符合率达90％以上;尤其是急性肝炎两者符合率达97．89％。结论HBV—PreS1抗原检测可用ELISA法,方法直接,操作简单,成本低廉,可作为临床上判断乙肝病毒复制及传染性的新标志。     

哺乳动物RNA干扰中的小干扰RNA表达载体

载体表达小干扰RNA的方法因便宜，稳定，操作方便的优点，在哺乳动物RNA干扰研究中有非常大的潜力和优势。本文对当前哺乳动物RNA干扰研究中的小干扰RNA表达用载体作一综述。小干扰RNA载体表达方法的广泛应用，将对功能基因组研究以及抗病毒和肿瘤的基因治疗产生深远的影响。     

用家蚕细胞表达HBeAg及其应用

对经重组病毒感染的ＢｍＮ细胞的表达产物ＨＢｅＡｇ进行实验研究，并与菌产ＨＢｅＡｇ进行了比较。结果表明用家蚕细胞表达的ＨＢｅＡｇ分别作为捕获和酶标抗原建立的检测抗ＨＢｅ方法，不仅传统方法检测的阳性标本全部阳性，而且在传统方法阴性（抗ＨＢｃ阳性）组中，检出２例阳性，在抗ＨＢｅ和抗ＨＢｃ全部阴性的４２例标本中，也发现２例阳性。说明本法的敏感性高于传统方法。同时，用此方法制备的ＨＢｅＡｇ，在相同的蛋白浓度下，其抗原反应性也比用原核细胞表达的ＨＢｅＡｇ高出１００倍，且与抗ＨＢｃ交叉反应低１００倍，表明用家蚕细胞表达的ＨＢｅＡｇ不但效价高，且特异性、敏感性均优于大肠杆菌表达系统产生的ＨＢｅＡｇ。     

哺乳动物细胞在生物技术药物研究与开发中的应用

分析了20多年来欧美已上市的生物技术药物,指出哺乳动物细胞已成为生物技术药物研发主要采用的基因表达系统。对外源基因高表达工程细胞株、高效工程细胞培养工艺、工程细胞产物分离纯化技术及工程细胞制品的安全性评价等进行了综述分析,并论述了中国哺乳动物细胞工程化技术现状和在药物研发中的作用。     

鸭乙型肝炎病毒全基因重组质粒构建及表达

目的构建鸭乙型肝炎病毒（DHBV）感染性克隆,通过体外细胞转染获得单一来源、基因序列清楚的体内实验的感染毒种。方法以湖北麻鸭DHBV分离株（DQ276978）为模板,用PCR法从该DHBV全基因组克隆质粒（pMD-DHBV）和DHBV阳性血清中获取3部分基因片段,总长4.4kb,克隆至载体PCR2.1的SacI和NotI酶切位点,构建含1.5倍鸭乙型肝炎病毒全基因的重组质粒,并酶切鉴定其插入方向。将构建的重组质粒经脂质体Lipo-fectineTM 2000导入鸡肝癌细胞系（LMH）细胞中转染表达,收集纯化后的转染细胞培养上清液作为体内实验感染的标准毒种。结果PCR鉴定、酶切鉴定及序列测定,证实成功获得正向插入的1.5倍鸭乙型肝炎病毒全基因重组质粒PCR2.1-DHBV1.5。Southernblot检测表明,该重组质粒在LMH细胞内存在各种病毒复制中间体;通过电镜观察,转染细胞上清液中存在DHBV完整病毒颗粒。结论经体外重组,构建出携带1.5倍加长DHBV基因组片段的重组质粒PCR2.1-DHBV1.5,并可在鸡肝癌细胞LMH中介导高水平病毒复制,从而获得含可自我复制病毒颗粒的转染细胞上清液作为动物体内感染接种物。     

乙型肝炎病毒前S蛋白及其临床意义

最近的研究表明,HBV 前 S 蛋白对肝细胞感染的机理、机体的免疫应答和临床诊断等均具有重要意义。本文阐述了前 S 蛋白的分子生物学、生物学作用、HBV 感染时前 S 蛋白及其抗体的检测,以及前 S 蛋白在乙型肝炎疫苗制备中的作用。     

哺乳动物细胞中MAPK信号转导途径的研究进展

丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)属于丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，可被多种刺激所活化。MAPK在所有真核细胞中均有表达。近年来，人们越来越关注MAPK在细胞反应中所起的重要作用。目前，哺乳动物细胞中已明确了5条MAPK途径。本文主要对哺乳动物细胞中MAPK信号转导途径——ERK1／2、JNK、P38等途径的研究情况进行综述。     

乙型肝炎病毒前S1抗原在慢性乙型肝炎诊断中的应用价值

目的分析前S1抗原（PreS1Ag）和慢性乙型肝炎（CHB）血清标志物之间的关系,探讨PreS1Ag对CHB诊断的临床意义。方法研究对象为164例表面抗原（HBsAg）阳性至少6个月的CHB患者,采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测CHB血清标志物和PreS1Ag,同时采用聚合酶链反应（PCR）检测HBV-DNA。结果 164例CHB患者中PreS1Ag和HBV-DNA的阳性率之间比较无统计学差异（P〉0.05）。不同CHB血清标志物中HBV-DNA与PreS1Ag的阳性率之间比较无统计学意义（P〉0.05）。结论 PreS1Ag与HBV-DNA的一致性较好,可作为临床上CHB感染诊断的一项辅助检测指标。     

水痘-带状疱疹病毒糖蛋白I基因在昆虫细胞中的表达及纯化

目的 将北京水痘-带状疱疹病毒(VZV)84-7株克隆糖蛋白I(gpI)基因在杆状病毒-昆虫细胞表达系统中表达,并对其表达产物进行纯化。方法 采用PCR方法从VZVDNA中扩增gpI全基因序列,并将其插入杆状病毒转移质粒pBacPAK9中,获得重组转移质粒pBacVZVgpI,对pBacVZVgpI中的插入基因进行测序。重组转移质粒与线性杆状病毒BacPAK6DNA(Bsu36Idigested)共转染Sf9昆虫细胞,获得重组病毒BacPAK-gpI。通过亲和层析纯化重组蛋白,并检测其抗原性。结果 PCR扩增得到gpI基因,测序结果表明克隆的外源基因正确。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)、免疫印迹(weotem-blot)方法证明gpI基因在昆虫细胞中获得表达,表达产物在培养72h达到高峰,重组蛋白的相对分子质量约为58000和70000,与理论值相符,蛋白质加工与天然蛋白类似。动物实验结果表明,重组蛋白具有较好的免疫原性,可刺激小鼠产生中和抗体。SDS—PAGE检测纯化的重组蛋白,纯度达80％。纯化蛋白经western-blot和ELISA检测后显示,具有特异的抗体结合活性。结论 应用昆虫细胞表达水痘-带状疱疹病毒gpI基因,可为水痘-带状疱疹病毒抗原定量分析、糖蛋白ELISA的研制和制备亚单位疫苗提供基础。     

河蚌多糖抗乙型肝炎病毒实验研究

目的提取河蚌多糖并且研究其抗乙肝病毒的作用。方法采用碱法提取河蚌多糖,并以河蚌多糖作用于体外培养的2.2.15细胞株,观察其对2.2.15细胞株HBsAg与HBeAg分泌的影响,评价其抗HBV作用。结果半数毒性浓度（TC50）〉200 mg/L;治疗指数（TI）分别为18.34、67.33。结论河蚌多糖具有体外抗乙肝病毒的活性。     

乙型肝炎病毒不同基因区RNA干扰抑制乙型肝炎病毒复制和表达的实验研究

目的针对乙型肝炎病毒(HBV)不同基因区设计siRNA,观察其对HBV表面抗原、e抗原分泌和HBVDNA复制的影响。方法靶向HBV基因区S、C、X的siRNA分别转染可稳定分泌HBV颗粒的HepG2.2.15细胞,转染后72h,采用ELISA方法检测上清液中HBsAg、HBeAg的含量,Real-timePCR定量检测HBVDNA拷贝数。结果靶向不同基因区的siRNA均能不同程度地抑制HepG2.2.15细胞HBsAg、HBeAg的分泌和HBVDNA的复制,其中S区siRNA对HBsAg呈现非常显著的抑制作用,抑制率为91.88%(P﹤0.01),对HBeAg表达的抑制作用较弱,抑制率为24.85%(P﹤0.05),对HBVDNA的抑制率为63.07%(P﹤0.01);C区siRNA对HBeAg和HBVDNA抑制作用较强,分别为54.77%(P﹤0.01)和76.97%(P﹤0.01),但对HBsAg的表达无明显影响(P﹥0.05);X区siRNA对HBsAg和HBeAg、HBVDNA均有抑制作用,抑制率分别为90.83%(P﹤0.01)、34.85%(P﹤0.01)和70.31%(P﹤0.01)。靶向不同基因区的siRNA对HBsAg、HBeAg、HBVDNA的抑制作用在一定的程度上存在剂量效应,而无关序列对HBsAg、HBeAg和HBVDNA的复制和表达几乎无干扰作用(P﹥0.05)。结论靶向HBVC、S、X基因区的siRNA可特异、高效、稳定地抑制HBV的复制和表达,为应用RNA干扰治疗乙型肝炎病毒奠定了一定基础。     

乙型肝炎病毒基因在宫内传播中的选择性

目的探讨乙型肝炎病毒（HBV）基因突变与宫内传播的关系。方法采用聚合酶链反应（PCR）方法从HBsAg阳性孕妇及其新生儿血清中扩增得到包括HBV前C／C区和前S／S区基因的2．5kb基因片断或前S／S区1．2kb基因片断,克隆、测序,分析测序结果,比较母婴HBV基因序列的差异。结果4对发生宫内感染的母婴HBV序列共得到43株,都属于HBVC基因亚型、adr血清亚型。HBV前S／S区序列中,新生儿序列的差异性低于母体（P〈0．05）。4对母婴问序列的平均相似率分别为99．47％、99．39％、99．37％和99．46％;母婴序列具有高度一致性;每对母婴序列间的进化距离都比较小,核苷酸差异率分别为0．4、0．8、1．2和0．3。母婴序列间均存在1个或数个核苷酸位点的差异,母体内的优势株和新生儿体内的优势株不完全相同。结论母体内的优势株或弱势株都可以通过宫内传播感染新生儿,可能与其基因突变有密切关系。提示HBV的宫内传播存在基因选择性。     

非细胞毒性清除乙型肝炎病毒机制的研究

乙型肝炎发病机制主要是机体清除HBV而引发的细胞免疫病理损伤,涉及到病毒和机体两方面因素,而非细胞毒性机制在清除HBV中发挥主要作用。     

乙型肝炎病毒前S1蛋白检测及临床意义

目的探讨乙型肝炎前S1蛋白(preS1)检测方法及在乙肝病毒诊断中的临床意义.方法采用ELISA法对158例各型乙型肝炎病毒患者血清标志物PreS1进行检测,同时对每个标本进行HBV-DNA定量及乙肝"两对半"的双盲测定.比较各组PreS1,HBV-DNA,HbeAg三者之间的关系.结果PreS1在HbeAg阳性组合中的检出率为87.9%,明显高于HbeAg阴性组46.7%.以乙肝病毒HBV-DNA≥103拷贝/ml为判断乙肝病毒存在复制的标准,PreS1在HBV-DNA阳性组合的检出率为93.0%,明显高于HBV-DNA阴性组25.8%.结论血清乙型肝炎病毒PreS1测定可以作为乙型肝炎病毒早期感染,复制及预后判断的重要指标.