重组人角质细胞生长因子-1突变体表达载体的构建

目的构建重组人角质细胞生长因子-1突变体的表达载体。方法采用PCR突变方法,将rhKGF cDNA第40位的Cys密码子突变为Ser密码子,所得的突变片断插入表达载体的表达框架中。结果 DNA测序分别证实合成的基因序列克隆入pET-22b中。结论构建重组人角质细胞生长因子-1突变体的表达载体,得到突变体蛋白40位丝氨酸突变截短型角质细胞生长因子[Ser40]rhKGFdest-23。     

人β-防御素DEFB113的重组表达及活性鉴定

DEFB113为人β-防御素家族新成员,其生物学功能尚不清楚。为了探索一种可以较低成本和较高产量表达活性DEFB113多肽的方法,将编码DEFB113成熟肽的序列克隆到载体pTWIN1上,并转化至E.coliBL21(DE3)中进行表达。结果表明融合蛋白主要以可溶形式存在;重组载体中融合标签的几丁质结合域(CBD)和内含肽(intein)分别使亲和层析纯化和融合标签自剪切一步完成。最终得到DEFB113多肽的产率为6～7 mg/LLB。经活性鉴定,该重组DEFB113多肽对于S.aureus,E.coli K12D31和C.albicans均表现出较强的抑制作用;另外DEFB113无明显的溶血活性,是一种较理想的多肽抗生素。该研究为进一步研究DEFB113的生理功能以及其它人β-防御素结构与功能奠定了基础。     

基因变构人白细胞介素-2克隆构建和原核表达

目的构建基因变构IL-2穴88N→R雪的重组克隆熏并将其在原核系统中进行高效表达,为研究基因变构IL-2穴88N→R雪的生物学活性奠定基础。方法分离人体T细胞经PHA刺激活化后,提取细胞的RNA为模板,逆转录构建cDNA文库,经套式PCR扩增出编码IL-2的基因,插入T-A载体后获得编码天然IL-2的克隆,核苷酸测序证实成功后,自行设计含有突变位点的引物,利用重组PCR技术,进行定点诱变构建基因变构IL-2穴88N→R雪的重组克隆熏DNA测序确认变构成功。将改构后的IL-2基因重组于原核pGEX-4T-2质粒上,转化宿主菌E.coli.DH5α中,经IPTG诱导后表达IL-2变构体,表达产物经SDS-PAGE电泳分析。结果获得了人类天然IL-2的编码基因克隆和基因变构IL-2的编码基因克隆,并将变构IL-2穴88N→R雪在大肠杆菌中获得了高效表达。结论IL-2基因的成功定点变构及其在原核生物中获得稳定高效的表达,为进一步在真核细胞中表达以及研究制备低毒、高效的新型基因变构IL-2药物奠定基础。     

HPV_(16)E7-HSP_(70)融合表达质粒的构建及鉴定

采用分子克隆技术 ,首先将 HSP70 基因片段克隆到真核表达载体 pc DNA3 .1ˉ上 ,获得 pc DNA-HSP重组质粒 ,然后采用 PCR扩增技术 ,定点突变编码 HPV1 6 E7蛋白 C末端锌指结构的基因序列 ,将该突变的 E7基因插入 pc DNA-HSP重组质粒 ,通过粘端连接的方式构建 pcd-HPV1 6 E7-HSP70 融合表达质粒 ,最后通过限制性内切酶酶切、PCR和 DNA测序等技术鉴定。结果显示 ,重组融合表达质粒经酶切、PCR和 DNA测序证明其突变位点、碱基及阅读框架均准确无误。     

古核嗜热菌组蛋白基因多点突变的新方法

嗜热菌组蛋白基因序列中精氨酸密码子在大肠杆菌中的表达率极低，限制了组蛋白的大量获得。运用分子生物学技术，在传统PCR定点突变技术的基础上进行改进，参照古核嗜热菌组蛋白基因序列和大肠杆菌偏爱密码子表，设计了一对含有5个精氨酸突变密码子的单链DNA，全长为115nt，在3‘端有20nt互补序列。将单链DNA在94℃，45℃复性，使其互补结合，72℃进行延伸反应，得到含有突变位点的组蛋白基因；再以此基因为模板设计相应的一对引物进行PCR扩增反应，得到大量组蛋白突变基因。该研究为一些序列已知，片段较小基因的多态突变提供了一种简单、易行的方法。     

β-内酰胺酶抑制短肽SIPIS04-01的表达、纯化与抑制作用测定

通过酵母双杂交系统从一个随机DNA片段文库中筛选到一个编码能与β-内酰胺酶结合的短肽SIPIS04—01的DNA序列，将它克隆到pGEX-4T-1的多克隆位点中，得到重组质粒pYG205。当用适量的IPTG诱导后，携带pYG205的E．coli DH5α能表达短肽SIPIS04-01-GST融合蛋白。利用谷胱甘肽Sepharose 4B亲和层析介质分离纯化短肽SIPIS04-01-GST融合蛋白，经凝血酶切割并分离纯化后，体外试验表明短肽SIPIS04-01具有抑制β-内酰胺酶的作用。     

用PCR定点突变方法研究人抗菌肽FALL-39功能与结构的关系

目的：构建人抗菌肽FALL-39的原核表达系统，解决抗菌肽获取困难的难题；用：PCR定点突变法构建人抗菌肽FALL-39基因突变体，并比较研究FALL-39及其突变肽的功能：方法：应用RT-PCR从人肺腺上皮细胞株SPC-A-1总RNA中扩增FALL-39成熟肽cDNA，以pGEX-1λT为载体，构建抗菌肽FALL-39基因大肠杆菌表达载体；采用一步法和两步法PCR体外定点突变技术，用赖氨酸替代第24位的谷氨酰胺和／或第32位的天门冬氨酸，构建FALL-39突变体大肠杆菌表达载体；该载体表达的融合蛋白经亲合层析、凝血酶酶切、胶回收和高效液相色谱分离纯化，获得高度纯化的重组FALL-39以及突变肽；对纯化产物进行的：MEC、MIC、MBC和溶血性实验等比较抗菌作用以及对红细胞膜的溶解性，用RT-PCR测定人单核巨噬细胞株THP-1：iNOS的表达，研究FALL-39及其突变肽的抗内毒作用。结果：重组质粒pGEX-1λT-FALL-39测序结果说明其插入片段序列与GenBank登录的FALL-39基因的cDNA序列相符，且插入方向正确；DNA测序结果表明在预期位点发生突变，用一步法得到突变体质粒pGEX-λT-FALL-39-Lys32，用两步法得到pGEX-1λT-FALL-39-Lvs24以及pGEX-λT-FALL-39-Lys24’32；重组原核表达质粒pGEX-λT-FALL-39及其突变体融合蛋白有高效表达，经提取纯化可得到高纯度的活性蛋白FALL-39，FALL-39-Lys24，FALL-39-Lys32和FALL-39-Lys24’32(约4Kd)：突变后的FALL-39蛋白对大肠杆菌ATCC25922和耐氨苄青霉素ML-35p的抗菌活性明显增强，最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)值FALL-39-Lys24’32最小，其次是FALL-39-Lys32和FALL-39-Lys24，均小于FALL-39-FALL-39Lys32和FALL-39两种蛋白均在含：Medium E的LB培养基中表现出较高活性，在LB培养基中抗菌活性最低，但在同一种培养基中FALL-39-Lys32蛋白抗菌活性要高于FALL-39蛋白。突变后FALL-39蛋白在抗菌剂量时对红细胞的溶解作用未见明显增加，较大剂量时对红细胞的溶解作用略有增加。突变后FALL-39-Lys32蛋白对LPS引起的iNOS mRNA的表达量增强抑制作用明显。结论：用FALL-39基因大肠杆菌表达载体可得到高效表达的蛋白；用高保真的Polybest DNA多聚酶进行一步法PCR定点突变技术简单、有效；突变质粒表达分子的抗菌活性和抗内毒素明显增强，对红细胞的溶解作用在抗菌剂量时未见明显增加，较大剂量时略有增加，提示在FALL-39分子中增加碱性氨基酸可以增强其抗菌活性。     

菊欧氏杆菌β-1,4-内切葡聚糖酶celY基因在大肠杆菌中的克隆、表达及活性分析

以菊欧氏杆菌(Erwinia chrysanthemi)基因组DNA为模板,通过PCR方法扩增了该菌的β-1,4-内切葡聚糖酶celY基因及其调控元件并克隆至pUC19载体。测序结果经分析,该基因编码的蛋白序列与菊欧氏杆菌Ech586的β-1,4-内切葡聚糖酶同源性达到98%。将celY的开放阅读框基因插入到表达载体pET-28a中,转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),采用LB-CMC平板刚果红染色筛选含celY基因的转化子。12%SDS-PAGE显示,重组菌经IPTG诱导后表达了目的蛋白,其相对分子质量与预期结果相符。CMCase活力测定显示重组pET-28a-celY阳性菌分泌到培养基中的CelY酶活力为84.4 U/L,周质中的酶活力为12.7 U/L。β-1,4-内切葡聚糖酶CelY工程菌的获得,为研究菊欧氏杆菌纤维素酶基因在菊欧氏杆菌同源转化中的表达及工程菌的酶学特性提供了重要的资料。     

APPβ分泌酶切割位点特异性单链抗体的制备和鉴定

目的制备针对人淀粉样蛋白前体(APP)β分泌酶切割位点的特异性单链抗体(ScFv),并进行鉴定。方法设计扩增单克隆抗体细胞株重链和轻链可变区基因片段VH和VL的引物,利用RT-PCR技术,从本室制备的抗人APPβ分泌酶切割位点单克隆抗体细胞株中扩增出VH和VL基因片段,然后通过重叠引物延伸法(SOE)将VH和VL基因拼接成ScFv基因片段,再将其亚克隆入原核表达载体pET-28a中,转化E.coli BL21(DE3)诱导表达,目的蛋白经镍柱纯化和复性后,用SDS-PAGE、ELISA和Western blot等方法对其检测分析。结果成功从一株抗人APPβ位点单克隆抗体细胞株2H10中扩增出VH和VL并拼接成ScFv片段,片段长744 bp,编码248个氨基酸。PCR、酶切和测序表明表达载体构建成功,转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导可以表达出约29 ku的目的蛋白,主要为包涵体形式,经镍柱纯化和复性后,获得纯度达90%以上的ScFv蛋白,ELISA和Western blot检测表明可溶性ScFv可以与人APPβ分泌酶切割位点序列短肽和全长APP结合。结论成功构建并表达人APPβ分泌酶切割位点的特异性单链抗体,为进一步研究其生物学活性奠定基础。     

ret基因体外定点突变及其突变效应分析

目的 体外完成ret基因cDNA 2 753处T→C定点突变,并理论分析突变后效应.方法 采用PCR诱导突变完成ret体外定点突变;利用OMIGA2.0蛋白分析软件,通过分析突变前后ret基因cDNA序列变化,预测RET蛋白构象、结构域及理化性质改变.结果 PCR筛选突变序列最佳复性温度为61℃;DNA序列分析提示ret基因cDNA 2 753处碱基由T变为C;软件分析后发现,点突变导致相应位置处蛋白质二级结构折叠方向改变,且增添一个新的磷酸化位点.结论 ret基因体外定点突变完成;cDNA 2 753处T→C单点突变可能是MEN2B发生的分子机制.     

175例儿童地中海贫血的基因诊断分析

目的 探讨深圳地区儿童α和β地中海贫血（简称地贫）的基因表型特征。方法 对有不同程度贫血或黄疸的儿童以红细胞休克-管定量法进行地贫筛查，并对检出的部分地贫患儿共175例进行基因分析，即采用跨断裂点（gap-PCR）PCR技术和PCR反向斑点杂交技术（PCR／RDB）分别对α地贫和β地贫进行基因检测。结果 全部病例中α地贫70例，占40．0％，其中标准型α地贫（即α地贫）54例，基因型为α α/--^SEA，HbH病16例；β地贫105例，占60．0％，共检出9种基因突变类型。其中重型β地贫14例，占β地贫患儿的13．3％。几种常见β地贫基因频率依次为CD41-42（-CTTT）0．430，IVS-2nt654（C→T）0．316，CDl7（A→T）0．105，TATA box nt-28（A→G）0．053，CD43（G→T）0．035等。结论 深圳地区儿童地贫基因频率与广东省其他地区大致相似。人群中儿童地贫检出率较高，广泛开展遗传咨询和地贫的产前基因诊断，对指导优生优育具有重大意义。     

逆转录病毒介导耐药基因的高效表达

目的　建立多药耐药基因MDR1的逆转录病毒转移系统。方法　脂质体转染法将携带MDR1基因的逆转录病毒载体HaMDR导入单向型包装细胞GP E86 ;用获得的单向型病毒重复转导双嗜型包装细胞GP envAm12 ,经秋水仙碱加压选择获得高滴度的病毒生产细胞Am12 /HaM DR ;MDR1基因的转移和表达用聚合酶链反应 (PCR)、MTT比色法和流式细胞术 (FCM )分析。结果　单向型与双嗜型病毒生产细胞的滴度分别为 6 2× 10 5和 9 0× 10 5CFU/ml;PCR分析证实生产细胞有MDR1基因整合并稳定表达 ,但同时存在异常剪接的转录本 ;MTT比色法和FCM分析显示MDR1基因转移细胞的耐药程度提高 12～ 2 6 7倍 ,P 糖蛋白表达率达 97%～ 99%。结论　逆转录病毒可有效介导MDR1基因转移和表达 ,为导入造血干 /祖细胞后进行根治性化疗奠定基础。     

应用耳聋基因芯片检测150例极重度感音神经性耳聋患者的结果分析

目的分析极重度感音神经性耳聋患者的耳聋基因检测结果。方法选取150例极重度非综合征型耳聋患者,采用遗传性耳聋基因芯片试剂盒,对基因组DNA的GJB2、SLC26A4、GJB3和mtDNA12srRNA四个耳聋相关基因的9个致聋突变位点进行检测;对所有患者进行颞CT、内耳水成像MRI扫描。结果在150例极重度非综合征型耳聋患者中检出耳聋相关基因突变者82例,占54.67%;其中GJB2基因突变41例(27.33%);SLC26A4基因突变35例(23.33%);mtDNA12srRNA基因突变6例(4%)。结论遗传因素是极重度感音神经性耳聋患者的主要致病原因,GJB2和SLC26A4是主要的致病基因。     

复制缺陷重组腺病毒有效转染兔心包组织的实验研究

目的观察腺病毒载体转染兔心包组织的有效性和外源性基因表达的时相性。方法用第五代腺病毒粘粒(Adv5-CAG)为对照组或含β-半乳糖苷酶基因的第五代腺病毒质粒(Adv5-CAG／LacZ)为实验组转染兔心包组织，转染后第3、7、14、28d取被转染组织行β-半乳糖苷酶(X-gal)染色及β-半乳糖苷酶活性检测。结果X-gal染色显示实验组转染后第3、7、14、28d注射部位心包组织均见蓝染，尤以第7d最明显，而对照组心包组织均无蓝染；β-半乳糖苷酶活性检查示实验组转染后第3d心包组织中即有β-半乳糖苷酶表达，7、14d达高峰，28d表达量明显减少。结论重组腺病毒载体可有效地转染兔心包组织，外源性基因在兔心包组织中能够表达并能维持1个月左右。     

p16基因表达与胃癌组织类型的关系

目的：研究p16基因的表达与人胃癌组织类型的关系。方法：选择30例病理确诊胃癌患者的胃癌组织及相应正常胃粘膜组织,用蛋白质免疫印迹（Western blot)技术检测 p16基因在两种组织中的表达。结果：30例胃癌组织中,7例无p16基因表达的癌组织为低分化腺癌或印戒细胞癌;2例p16基因表达可疑;分化较高的6例p16基因表达增多;其余15例p16基因的表达与相应正常组织无区别。结论：p16基因在胃癌组织中的表达既可减低,也可增加,相当一部分胃癌组织p16基因的表达同相应正常组织无明显区别;p16基因表达减低的病例,其病理诊断往往属于恶性程度较高的低分化腺癌或印戒细胞癌,可能与患者的预后有一定关系。     

13例Wilson病患者基因8号外显子778密码子碱基突变的SSCP及酶切分析

目的 寻找山东籍Wilson病患者WND基因突变热点,以便易于用SSCP及酶切分析方法检出。使无先证者及独生子女家系易于作出基因诊断,同时可用于杂合子筛查。方法 PCR扩增WND基因8号外显子778密码子区域,SSCP检洲点突变,用MSPI内切酶进一步验证G-T突变的正确性。结果 13例Wilson患者,检出778密码子G-T纯合突变2例,杂舍突变7例,未突变4例,共计26条染色体,突变染色体11条,总染色体突变率为42.3％。结论 WND基因8号外显子,778密码子G-T突变是山东WD患者的一个突变热点。SSCP和酶切分析是诊断此位点突变的便捷方法,可用于WD患者及杂合子检出。     

基因芯片法检测抗高血压药物相关基因

目的：检测219例样本的高血压药物相关基因的突变位点,并进行基因分型。对比不同检测方法,验证实验所用芯片检测方法的可靠性。方法：采用基因芯片法对5个与高血压药物相关的基因进行检测分型,并与直接测序或片段长度多态性检测法所得结果进行比对。结果：两种方法所得基因分型结果具有较高的一致性。结论：本实验采用的抗高血压药物相关基因芯片检测法具有一定的可靠性,方法简便快捷。     

肿瘤基因治疗的现状与展望

针对肿瘤发生的遗传学背景,将外源目的基因引入肿瘤细胞或其它体细胞内以纠正过度活化或补偿缺陷的基因,而从达到治疗肿瘤的目的,即为肿瘤基因治疗（CGT）。分为针对肿瘤细胞的CGT策略和针对机体的CGT策略。前者有包括针对抑癌基因的CGT、针对癌基因的CGT、针对肿瘤细胞的免疫基因治疗、自杀基因治疗、耐药基因治疗;后者包括免疫效应细胞介导的CGT、树突状细胞介导的CGT、抗血管生成CGT。虽然CGT不太可能完全治愈肿瘤,但随着它的不断完善,能提高恶性肿瘤晚期的治疗的有效性,改善患者的生存质量。     

肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（TRAIL）可溶性胞外区在大肠杆菌中的高效表达

肿瘤坏死相关凋亡诱导配体（TNF－related apoptosis-inducing ligand,TRAIL),也称为凋亡素2配体（Apoptosisin 2 Ligand,Apo2L),是肿瘤坏死因子超家族成员,能够激发肿瘤细胞选择性地发生凋亡,并对正常组织细胞几乎无毒性。TRAIL通过细胞表达受体,即死亡受体4和5（Death Receptor 4,DR4 and Death Receptor5)发挥作用,而大多数肿瘤细胞表面表达这2种受体。为了深入研究TRAIL在肿瘤治疗中的价值,我们采用RT－PCR方法克隆了TRAIL基因,并对其细胞外可溶性区域（114－281氨基酸残基）在大肠杆菌中进行了表达。重组的TRAIL可溶性蛋白占细菌总蛋白的45％以上,初步分析具有TRAIL的生物学活性。     

The era of gene therapy: From preclinical development to clinical application

Three decades of promise have culminated in the development of gene therapies that can be applied to a broad range of human diseases. After a brief history, we provide an overview of gene therapy types and delivery methods, gene editing technologies, regulatory affairs, clinical trials, approved products, ongoing challenges, and future goals. Information on clinical trials of candidates and on approved products for gene therapy developed between 1988 and 2020 is systematically collated. To obtain this global information, we scanned and reviewed more than 46,000 records of clinical trials from 17 clinical trial database providers. The medical benefits of transformative gene therapies are gradually being accepted by payors, and a significant increase in the number of gene therapy clinical trials and approved gene therapy products has resulted.