表达可溶性TβRⅡ胞外区腺病毒载体的构建及功能试验研究

目的：探讨表达可溶性TβRⅡ胞外区片段的腺病毒载体构建．及其在肿瘤生物治疗学方面的作用机制和效果。方法：RT—PCR法克隆鼠源性TβRⅡ胞外区编码序列，采用AD—easy XL Adenovirus Vector System试剂盒构建表达上述基因的腺病毒载体。通过ELISA试验验证表达可溶性TβRⅡ胞外区序列的腺病毒载体转染细胞后所具有的阻断TGF-β的作用。应用于小鼠体内试验，观察该病毒载体对免疫效应细胞抗肿瘤活性的影响．从而评价其在肿瘤治疗方面的作用。结果：克隆了鼠源性TβRⅡ胞外区编码序列并成功地构建了表达这些基因的腺病毒载体。功能试验表明由腺病毒表达的TβRⅡ胞外区片段具有阻断TGF-β信号通路的作用。体内试验则表明应用于荷瘤小鼠可抑制肿瘤的发展。结论：表达可溶性TβRⅡ胞外区片段的腺病毒载体可显著地提高免疫细胞的杀伤能力．抑制肿瘤生长，为肿瘤的生物学治疗提供了新的研究方向。     

TβR-Ⅱ-RANTES融合基因重组腺病毒的抗肿瘤作用

目的构建表达融合基因TGF-βⅡ型受体(TβR-Ⅱ)胞外区及活化T细胞表达和分泌的调节因子(RANTES)重组腺病毒载体,并观察其抗肿瘤作用。方法RT-PCR扩增小鼠TβR-Ⅱ胞外区和RANTES基因,重叠PCR扩增融合基因TβR-Ⅱ胞外区-RANTES。采用adMax adenovjrus vector creation试剂盒构建表达融合基因重组腺病毒。体外感染小鼠肺腺痛LA795细胞系,绘制细胞生长曲线。采用Western blot法检测感染后细胞融合基因的表达;酶联免疫吸附试验(FLISA)法检测其培养上清的蛋白含量;Annexin V-FITC法检测感染后细胞的凋亡;并观察感染后细胞培养上清对小鼠脾细胞的趋化作用。将感染后的细胞(1×105个)接种于T739小鼠,观察成瘤时间和生存时间;1×1010pfu的重组腺病毒局部注射荷瘤小鼠,观察肿瘤的大小变化,并统计肿瘤的重量和计算抑瘤率。结果经测序证实,RT-PCR正确扩增小鼠TβR-Ⅱ胞外区和RANTFS基因,重叠PCR正确扩增融合基因TβR-Ⅱ胞外区-RANTES。重组质粒pDC316-融合基因经酶切鉴定正确,与pJM17双质粒共转染获得表达融合基因重组腺病毒,病毒滴度为8×1010pfu/ml。Western blot结果表明,感染后的LA795细胞有融合蛋白的特异性条带出现;培养上清中,游离TGF-β1的水平显菩减低,而RANTES的水平显著升高。感染融合基因重组腺病毒的细胞生长速度明显减低,凋亡率为16.9%;培养上清可趋化小鼠脾细胞,与对照组之间差异均有统计学意义。感染融合基因重组腺病毒组与对照组相比,体内成瘤时间和生存时间明显延长;局部注射融合基因重组腺病毒可显著抑制肿瘤的生长,抑瘤率为37.6%。结论成功构建表达融合基因TβR-Ⅱ胞外区-RANTES重组腺病毒可有效结合TGF-β1,显著逆转TGF-β介导的免疫抑制状态,高水平表达RANTES强化肿瘤局部的免疫功能,具有显著的抗肿瘤作用。     

肝癌患者A-LAK细胞与苯乙酸协同抗瘤的观察

目的：构建重组人FN多肽的真核表达载体,研究体内表达对免疫细胞的趋化作用及抑制肿瘤的生长的作用。方法：采用重组DNA技术构建表达质粒;体内外进行基因转染;用Western blot方法鉴定表达产物;肌肉组织切片与染色观察体内基因转染后的趋化作用;小鼠实体瘤模型研究基因转染抑制肿瘤生长的作用。结果：将人FN cDNA5'端非编码区及信号肽编码区、CH50多 编码区cDNA、人FN cDNA的3'端非编码区重组连接并插入pcDNA3.1质粒,构建出pCH510。以pCH510转染小鼠NIH3T3细胞,可以表在产生CH50多肽。肌肉内注射转染pCH510可对免疫细胞产生趋化作用,抑制实体肿瘤的生长。结论：质粒pCH510可在细胞中及小鼠体内表达;体内表达可对免疫细胞产生趋化作用,并可抑制实体瘤生长。     

hMIP-1β基因修饰瘤苗体内诱导抗肿瘤免疫效应的研究

目的：探讨人巨噬细胞炎性蛋白-1β（hMIP-1β）基因修饰瘤苗体内诱导的抗肿瘤免疫效应。方法：通过重组腺病毒载体介导将hMIP-1β基因导入CT26细胞中，X-gal染色法检测基因转染效率；ELISA法检测hMIP-1β基因修饰CT26细胞培养上清中hMIP-1β的含量；Boyden趋化小室法检测培养上清对CD4^＋T细胞、CD8^＋T细胞、NK细胞及未成熟树突状细胞（imDCs）的趋化作用；制备hMIP-1β基因修饰的CT26细胞瘤苗并免疫BALB／c小鼠，观察其诱导免疫细胞的杀伤活性和保护性免疫反应。结果：腺病毒载体可介导hMIP-1β基因转染CT26细胞和表达（X—gal染色的阳性率〉95％），培养上清中hMIP-1β水平为980pg／mL，并对CD4^＋T细胞、CD8^＋T细胞、NK细胞及imDCs有显著的趋化作用，与转染对照基因LacZ的CT26细胞及野生型CT26细胞比较差异均有统计学意义，P〈0．01。hMIP-1β基因修饰的CT26细胞瘤苗免疫小鼠能有效诱导肿瘤特异性CTL活性和非特异性NK活性，产生明显的免疫保护作用，可抵抗肿瘤细胞的再攻击，成瘤率降低，肿瘤生长速度减慢，小鼠生存期延长。结论：hMIP-1β基因修饰瘤苗可诱导产生有效的抗肿瘤免疫保护作用，有希望成为预防肿瘤转移与复发的有效手段。     

腺病毒介导IL-2基因转染的瘤苗体内抗肿瘤作用

目的 :探讨重组腺病毒介导的 IL- 2基因转染的瘤苗的体内抗肿瘤作用及其免疫学机制。方法 :应用腺病毒介导的鼠 IL- 2基因转染 CT2 6小鼠结肠癌细胞 ,灭活后用作瘤苗治疗荷瘤小鼠 ,观察皮下肿瘤生长及其存活期。采用乳酸脱氢酶释放法检测荷瘤小鼠脾细胞 CTL、L AK、NK细胞的杀伤活性。结果 :鼠 IL- 2基因转染瘤苗治疗能显著抑制荷瘤小鼠皮下肿瘤生长并明显延长其存活期 (P<0 .0 1)。体内免疫功能检测表明 ,鼠 IL- 2基因转染疫苗治疗组小鼠脾细胞 CTL 活性、L AK活性和 NK活性显著高于对照组 (P<0 .0 1)。结论 :腺病毒介导鼠 IL- 2基因转染的瘤苗体内具有较强的抗肿瘤效应 ,其机制可能是提高了荷瘤小鼠特异性和非特异性抗肿瘤免疫反应     

人巨噬细胞炎性蛋白-1β基因修饰肿瘤细胞的体内致瘤性和瘤苗效果

目的 探讨人巨噬细胞炎性蛋白-1β(hMIP-1β)基因修饰小鼠结肠腺癌CT26细胞的致瘤性和瘤苗免疫效果.方法 通过重组腺病毒载体介导,将hMIP-1β基因导入CT26细胞中,X-gal染色法检测基因转染效率;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测hMIP-1β基因修饰CT26细胞培养上清中hMIP-1β的含量;采用Boyden趋化小室法检测培养上清对CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、NK细胞和未成熟树突状细胞(imDC)的趋化作用.BALB/c小鼠皮下接种hMIP-1β基因修饰的CT26细胞,观察其体内致瘤性的改变和对免疫细胞的趋化作用;制备hMIP-1β基因修饰的CT26细胞瘤苗并免疫BALB/c小鼠,观察其诱导免疫细胞的杀伤活性和保护性免疫反应.结果 腺病毒载体可介导hMIP-1β基因转染CT26细胞和表达,X-gal染色的阳性率可达95.0%以上.在培养上清中hMIP-1β水平为980 pg/ml细胞,并对CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、NK细胞和imDC有显著的趋化作用,与转染对照基因LacZ的CT26细胞及野生型CT26细胞比较,差异有统计学意义(P＜0.01).体内致瘤实验显示,hMIP-1β基因修饰的CT26细胞皮下接种后,成瘤率降低,肿瘤生长速度减慢,肿瘤内可见明显坏死灶,坏死灶内和周围可见较多淋巴细胞浸润.hMIP-1β基因修饰的CT26细胞瘤苗免疫小鼠能有效诱导肿瘤特异性CTL活性和非特异性NK活性,产生明显的免疫保护作用,可抵抗肿瘤细胞的再攻击.结论 hMIP-1β基因修饰的CT26细胞致瘤性显著下降,其瘤苗可诱导强烈的抗肿瘤免疫反应,提示hMIP-1β基因修饰瘤苗有望成为更有效的抗肿瘤免疫治疗手段.     

莪术醇瘤苗治疗胃癌的实验研究

目的：研究中药单体莪术醇生物修饰构建的肿瘤细胞瘤苗对荷瘤小鼠（SGC-7901胃癌）的免疫功能影响及治疗效率。方法：观察莪术醇-SGC-7901细胞瘤苗体外激活脾淋巴细胞的能力，体内成瘤性变化及作为瘤苗对荷瘤胃癌的小鼠治疗作用。结果：莪术醇-SGC-7901细胞瘤苗在体外能有效诱导免疫细胞活化增殖和特异性CTL活性的产生，体内的成瘤能力明显下降，用各组免疫接种后长期存活的脾细胞制备的LAK细胞，较同龄未免疫小鼠的脾细胞制备的LAK细胞具有更强的抗瘤效应（P〈0．05）；经莪术醇修饰构建的SGC-7901瘤苗与对照组相比能明显阻止胃癌细胞的肺转移，显著抑制皮下肿瘤结节形成，明显延长荷瘤鼠的生存时间（P〈0．05）；接种瘤苗后对荷瘤胃癌小鼠有较好的治疗效果。结论：莪术醇修饰构建的SGC-7901新型疫苗可以增强胃肿瘤细胞的免疫原性，对荷瘤胃癌小鼠（SGC-7901）有较好的治疗效果。     

重组Ad-SurvivinT34A腺病毒对Lewis肺癌细胞生长的抑制作用

目的：探讨Survivin的显性负突变体SurvivinT34A的重组腺病毒治疗小鼠Lewis肺癌的效果及作用机制。方法：采用Gateway技术分别构建、制备高滴度的人源的SurvivinT34A重组腺病毒和鼠源的SurvivinT34A重组腺病毒。在体外试验中,采用Hoechst染色和流式细胞术检测感染重组腺病毒的小鼠LLC细胞的促凋亡作用。在体内实验中,绘制肿瘤生长曲线和荷瘤小鼠的生存曲线观察Ad-HS和Ad-MS的抗LLC肿瘤效果;TUNEL荧光显色检测肿瘤组织内凋亡情况;通过CD31免疫组化染色,观察肿瘤组织内新生血管抑制情况;通过Cr51释放法检测脾T细胞对肿瘤细胞的特异杀伤活性。结果：制备的高纯度和高滴度的Ad-HS和Ad-MS在体外均能够有效诱导抗LLC肿瘤效应,其中异种重组腺病毒（Ad-HS）的效果更好,但差异无统计学意义。主要表现为治疗组肿瘤细胞凋亡率增加,肿瘤组织内微血管密度降低,激发肿瘤特异性的细胞免疫反应,杀伤LLC肿瘤细胞,因此治疗组荷瘤小鼠肿瘤生长缓慢,生存期延长。结论：异种Ad-SurvivinT34A重组腺病毒对LLC细胞有较强的抑制作用。     

复制缺陷型重组腺病毒介导mIFN-β基因治疗小鼠黑色素瘤的研究

目的:探讨人类复制缺陷型重组腺病毒载体介导mIFN-β基因治疗小鼠黑色素瘤的可行性和效果。方法:利用人类复制缺陷型重组腺病毒将目的基因mIFN-β经体外、体内两种途径导入小鼠黑色素瘤细胞(B16细胞)中,观察体外转mIFN-β基因的B16细胞的体内致瘤性和瘤苗作用,及通过腺病毒载体介导的mIFN-β对体内局部肿瘤治疗和抗肿瘤转移的作用。结果:1)携带目的基因的重组腺病毒感染B16细胞能获得较高的转移效率和目的基因的有效表达;2)将mIFN-β基因导入B16细胞对B16细胞的体外增殖能力无明显影响,但能显著提高细胞表面MHC-I类抗原的表达;3)将转mIFN-β基因的B16细胞接种小鼠,其体内致瘤性明显降低,且对对侧野生型B16细胞的致瘤性有抑制作用;4)瘤体内注射和经尾静脉注射途径给予AdCMVmIFN-β,对局部肿瘤和转移瘤有治疗作用。结论:利用人类复制缺陷型腺病毒载体介导mIFN-β基因治疗小鼠黑色素瘤是可行的,并具有较好疗效,提示用腺病毒载体携带有效的目的基因来开发瘤苗和治疗肿瘤具有良好的临床应用前景。     

转染趋化因子MCP-3基因诱导抗小鼠大肠癌主动免疫

背景与目的:趋化因子对于免疫细胞在肿瘤组织中的浸润起重要作用,转染趋化因子基因在许多类型的肿瘤中诱导了抗肿瘤免疫反应,本研究的目的是通过将趋化因子单核细胞趋化蛋白-3(monocytechemotacticprotein-3,MCP-3)基因转染小鼠大肠癌CMT93瘤细胞,探讨MCP-3用于诱导抗大肠癌主动免疫的可行性。方法:用脂质体将小鼠MCP-3基因导入小鼠大肠癌细胞CMT93,G418筛选抗性克隆,RT-PCR检测MCP-3的表达,趋化实验检测MCP-3的活性,体内实验观察野生型及MCP-3基因修饰瘤细胞的致瘤性,组织病理学检测肿瘤中免疫细胞的浸润及肿瘤的转移。结果:RT-PCR检测发现G418筛选得到的转染MCP-3的抗性克隆(CMT93/MCP3)表达MCP-3,而野生型CMT93不表达MCP-3。趋化实验显示CMT93/MCP-3的培养上清具有良好的趋化活性,趋化指数达5.57(P<0.05),对照组培养上清均无趋化活性。体内成瘤实验显示:与野生型瘤细胞相比,CMT93/MCP-3的成瘤率没有显著性下降,但源于CMT93/MCP-3的肿瘤生长速度与对照组相比显著减慢(P<0.05)。在CMT93/MCP-3所形成肿瘤中有明显的免疫细胞浸润,对照组肿瘤中免疫细胞的浸润较少。接种CMT93/MCP-3瘤细胞的小鼠,肿瘤的转移受到了显著性的抑制,转移率为0%(0/5),与对照组CMT93(100%,4/4)和CMT93/mock(80%,4/5)相比均有显著     

人骨髓、脐血CD34~ 干细胞体外扩增的树突状细胞的表型及其T细胞刺激活性分析

目的:扩增出单纯疱疹病毒I型(HSV-I)Stocker株胸苷激酶(tk)基因,并将其克隆到真核表达质粒中,构建一个含有tk基因片段的高效真核表达载体.方法:根据已发表的HSV-I CL101株tk基因的核苷酸序列,设计并合成了一对引物,以HSV-I Stocker株核酸为模板,进行PCR扩增,并将扩增产物连接到pUCll9中,进行序列分析,将此基因进一步克隆到含巨细胞病毒极早期启动子的真核表达质粒pCR3-Uni中,并对重组子进行酶切鉴定.结果:PGR扩增出1.427Kb大小的片段,通过酶切和序列分析证明含完整的tk基因序列,此序列与CL101株tk基因的同源性为98.5%.酶切证实了构建的真核表达载体株的同源性很高,重组子pCR3-tk含tk基因并获得了正向重组子.结论:克隆的HSV-I Stocker株tk基因与CL101株的同源性很高,重组于pCR3-tk是一种高效真核表达载体,这为今后应用非病毒载体特别是脂质体进行基因转导来研究HSV-tk/CCV系统在肿瘤基因治疗中的应用打下了基础.     

肿瘤特异性Survivin、Livin共沉默RNAi载体的构建及其在前列腺癌细胞中的RNA干涉作用

目的:构建含Survivin基因启动子的、肿瘤特异性Survivin、Livin共沉默RNAi载体,研究该载体在前列腺癌细胞中的RNA沉默作用。方法:运用分子克隆技术,选取Survivin、Livin基因RNAi特异性序列,构建以Survivin、Livin基因为靶点的、含Survivin启动子的CGM30 miR-30 shRNA载体。经测序验证,用脂质体法转染PC-3细胞,RT-PCR、免疫印迹实验检测Survivin、Livin的表达变化,并用流式细胞术检测转染后PC-3细胞的凋亡变化。结果:构建的共沉默RNAi重组载体转染PC-3细胞后,Survivin、Livin基因在mRNA和蛋白水平上的表达均明显下调（P＜0.01）,且转染后的细胞凋亡增加了约15％,而正常前列腺上皮BPH-1细胞中则无此作用。结论:成功构建了含Survivin启动子、特异性沉默Survivin、Livin基因表达的RNAi共沉默载体CGM30-SP-svv-liv,转染该重组质粒后可促进肿瘤细胞的凋亡。     

Administration of wild-type p53 adenoviral vector synergistically enhances the cytotoxicity of anti-cancer drugs in human lung cancer cells irrespective of the status of p53 gene

Recombinant adenovirus mediated p53 gene transfer combined with anti-cancer drugs has clinical potential for gene therapy of lung cancer. We constructed a recombinant adenoviral vector expressing wild-type p53 cDNA (Ad-p53), and assessed the efficacy of a combined treatment with Ad-p53 and six anti-cancer drugs (cisplatin, 5-fluorouracil, doxorubicin, docetaxel, irinotecan, and etoposide) for human lung cancer cell lines, H1299 (with deleted p53), RERF-LC-OK (with mutant p53), and A549 (with wild-type p53). The infection of the Ad-p53 vector into H1299 cells, RERF-LC-OK cells, or A549 cells increased the sensitivity to all six drugs regardless of the cellular p53 status, and a synergism was observed by the isobolic method in combination studies (D<1). We conclude that our strategy using adenoviral mediated p53 gene transfer to cancer cells can enhance the cytotoxic effect of anti-cancer drugs, which leading to an improvement of lung cancer chemotherapy.     

CRT180基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的构建表达CRT180基因重组的腺病毒载体,为肿瘤的基因治疗奠定实验基础。方法采用腺病毒表达系统（Vira Power^TM Adenoviral Expression System）构建重组腺病毒表达载体。首先利用RT-PCR的方法在人肺腺癌细胞系A549细胞中扩增CRT180基因,以连接、转化等方法克隆入载体pENTR／D—TOPO以获得重组的入门克隆,经测序及PCR鉴定正确后,用重组酶（LRClonase^TMⅡ Enzyme Mix）进行入门克隆与腺病毒表达载体（pAd—CMV／V5-DEST）间的重组反应,以获得表达克隆（rAd．CRT180）质粒。重组表达克隆鉴定后,用限制性内切酶PacⅠ是使之线性化后转染HEK293A包装细胞得到重组腺病毒。用极限稀释法检测病毒滴度用Western Blot法检测rAd．CRT180载体是否能正确表达CRT180蛋白。结果用RT-PCR的方法扩增到CRT180基因;重组入门和表达克隆经酶切和PCR鉴定构建正确,重组表达克隆转染HEK293A细胞获得病毒原液并扩增后测定病毒滴度为1．8×10^11pfu／mL,且这个病毒能正确表达CRT180蛋白。结论成功构建了CRT180基因的重组腺病毒载体,可为此重组载体用于肿瘤基因治疗提供实验依据。     

腺病毒介导的HBsAg基因修饰树突状细胞瘤苗的制备

目的:构建含人HBsAg基因的腺病毒载体,体外转染树突状细胞,制备树突状细胞肝癌瘤苗。方法:将HBsAg基因亚克隆到pIND载体和Shuttle2载体中,构建穿梭载体Shuttle2-S。用PI-SceⅠ和I-CeuⅠ双酶切后将所获HBsAg基因片段再与线性化的腺病毒载体pAdeno-X连接,构成pAdeno-S重组腺病毒载体。其后,用重组腺病毒载体转染HEK293细胞,包装腺病毒表达载体。通过酶切、PCR对腺病毒载体进行鉴定。包装好的重组病毒载体pAdeno-S体外感染树突状细胞制备树突状细胞肝癌瘤苗后Westernblot法检测其表达,流式细胞仪检测其能否诱导树突状细胞凋亡。结果:酶切、PCR鉴定证实,穿梭质粒插入片段为HBsAg基因。包装的腺病毒载体具有良好的感染性,可以在293细胞中形成病毒颗粒,腺病毒载体内携带HBsAg基因感染树突状细胞,经Westernblot法鉴定证实能够表达转染基因,并且不会诱导树突状细胞凋亡。结论:构建成功的含HBsAg腺病毒载体可以在树突状细胞中表达HBsAg,为DC瘤苗的进一步研究奠定了基础。     

哺乳动物细胞CDK2系列表达载体的构建与表达

目的：构建一系列细胞周期蛋白依赖激酶2（cyclin-dependent kinase 2,CDK2）在哺乳动物细胞的表达载体,为研究CDK2的功能和修饰提供实验材料。方法：从食管癌细胞中提取总RNA,逆转录PCR扩增CDK2编码区,然后将PCR产物克隆到T载体;扩增后的CDK2片段分别亚克隆入pcDNA3、pcDNA4、pNTAP和pEGFP等4种哺乳动物表达载体;最后,将获得的表达载体PEGFP/CDK2转染小鼠成纤维细胞NIH3T3进行初步的CDK2表达分析。结果：RT-PCR扩增获得约900 bp的目的片段,经T载体克隆和DNA序列分析,显示重组片段是人CDK2基因序列;CDK2片段分别亚克隆入上述4种载体后获得相应表达载体;运用构建的PEGFP/CDK2表达载体,在NIH3T3细胞中表达出CDK2蛋白。结论：成功构建了CDK2的哺乳动物细胞系列表达载体,并在NIH3T3细胞中成功表达目的蛋白。     

正反义人Pin1基因克隆及真核表达载体的构建

Objective： To clone and construct eukaryotic expressing vectors of sense and antisense human Pin1 （hPinl） genes. Methods： Total RNA was extracted from MG-63 cells, then the hPinl cDNA was amplified by RT-PCR. The same time the sense and antisense hPinl genes were formed by binding BamH Ⅰ and Hind Ⅲ in cis and trans-directions. At the end they were cloned into the eukaryotic expressing vector pIRES2-EGFP in cis and trans directions using DNA recombinant technology. The recombinant vectors were further identified by digestion of BamHⅠ and Hind Ⅲ. Results： The results of sequencing showed that the orientation of the ligations and the reading frame were correct. After digested by BamH Ⅰ and Hind Ⅲ, two fragments exhibiting 5.3 kb and 0.99 kb were formed in sense and antisense eukaryotic expressing vectors. Electrophoretic results were completely coincident with theoretical calculation. Conclusion： Human Pin1 sense and antisense genes were successfully cloned and eukaryotic expressing vectors were successfully constructed.