耐多药结核分支杆菌基因突变在耐药性检测中的应用

目的:探讨耐多药结核病(MDR-TB)临床分离株rPOB、KatG和rpsL基因突变在耐药性检测中的应用价值。方法:采用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术分析了同时54株耐异烟肼(INH)、利福平(RFP)、链霉素(SM)的多耐药临床分离株和45株药物敏感株的rPOB、KatG、rpsL基因突变。结果:以结核分支杆菌H37RV为对照,45株药物敏感株的rPOB、rpsL基因SSCP图谱正常,其特异性为100%;KatG基因有2株图谱异常,特异性为96.3%。89株结核分支杆菌临床分离株均未发现rPOB、KatG、rpsL基因缺失,其PCR扩增产物SSCP分析结果表明:54株多耐药临床分离株中,49株rPOB基因图谱异常;32株KatG基因图谱异常;40株rpsL基因图谱异常。其敏感性分别为rPOB(90.7%)、KatG(59.3%),rpsL(74.1%)。结论:结核分枝杆菌耐RFP、INH、SM耐药性的产生主要是由于rPOB、KatG和rpsL基因突变所致。PCR-SSCP技术有望成为结核分枝杆菌耐药性检测的方法之一。     

耐多药结核分支杆菌基因突变在耐药性检测中的应用

目的探讨耐多药结核病（MDR-TB）临床分离株rPOB、KatG和rpsL基因突变在耐药性检测中的应用价值。方法采用聚合酶链反应-单链构象多态性（PCR-SSCP）技术分析了54株同时耐异烟肼（INH）、利福平（RFP）、链霉素（SM）的多耐药临床分离株和45株药物敏感株的rPOB、KatG、rpsL基因突变。结果以结核分支杆菌H37RV为对照，45株药物敏感株的rPOB、rpsL基因SSCP图谱正常，其特异性为100％；KatG基因有2株图谱异常，特异性为95．6％。89株结核分支杆菌临床分离株均未发现rPOB、KatG、rpsL基因缺失，其PCR扩增产物SSCP分析结果表明：54株多耐药临床分离株中，49株rPOB基因图谱异常；32株KatG基因图谱异常；40株rpsL基因图谱异常。其敏感性分别为rPOB（90．7％）、KatG（59．3％），rpsL（74．1％）。结论结核分支杆菌耐肿、INH、SM耐药性的产生主要是由于rPOB、KatG和rpsL基因突变所致。PCR-SSCP技术有望成为结核分支杆菌耐药性检测的方法之一。     

耐多药结核分支杆菌耐药分子机制的研究

目的　研究耐多药结核病 (MDR TB)临床分离株rPOB、KatG和rpsL基因突变在耐药性检测中的应用价值及鉴定是否含有质粒。方法　采用聚合酶链反应 单链构象多态性 (PCR SSCP)技术分析了 4 6株同时耐异烟肼 (INH)、利福平 (RFP)、链霉素 (SM)的多耐药临床分离株和 6 2株药物敏感株的rPOB、KatG、rpsL基因突变。同时对 78株结核分支杆菌临床分离株按碱性溶菌法抽提分离并鉴定是否含有质粒。结果　以结核分支杆菌H37RV为对照 ,6 2株药物敏感株的rPOB、rpsL基因SSCP图谱正常 ,其特异性为 10 0 %。KatG基因有 2株图谱异常 ,特异性为 96 8%。rPOB、KatG、rpsL基因突变率分别为 91 3%、6 0 9%、71 7%。结核分支杆菌 30株药物敏感株和 37株同时INH、RFP、SM的多耐药临床分离株均未提取分离与鉴定含有质粒。结论　结核分支杆菌耐RFP、INH、SM耐药性的产生主要是由于rPOB、KatG和rpsL基因突变所致。未发现结核分支杆菌含有质粒及由质粒介导的耐药机制。     

耐多药结核分支杆菌耐药分子机制的研究

目的研究耐多药结核病(MDR-TB)临床分离株rPOB、KatG和rpsL基因突变在耐药性检测中的应用价值及鉴定是否含有质粒。方法采用聚合酶链反应单链构象多态性(PCR—SSCP)技术分析了46株同时耐异烟肼(INH)、利福平(RFP)、链霉素(SM)的多耐药临床分离株和42株药物敏感株的rPOB、KatG、rpsL基因突变。同时对67株结核分支杆菌临床分离株按碱性溶菌法抽提分离并鉴定是否含有质粒。结果以结核分支杆菌H37RV为对照，42株药物敏感株的rPOB、rpsL基因SSCP图谱正常，其特异性为100％；KatG基因有2株图谱异常，特异性为95．8％。tPOB、KatG、rpsL基因突变率分别为91．3％，60．9％，71．7％。结核分支杆菌30株药物敏感株和37株同时INH、RFP、SM的多耐药临床分离株均未提取分离与鉴定含有质粒。结论结核分支杆菌耐RFP、INH、SM耐药性的产生主要是由于rPOB、KatG和rpsL基因突变所致。未发现结核分支杆菌含有质粒及由质粒介导的耐药机制。     

聚合酶链反应-单链构象多态性技术鉴别结核分枝杆菌利福平耐药基因

目的:采用PCR-SSCP技术检测结核分枝杆茵rpoB基因突变,并探讨其在结核分枝杆菌对RFP耐药性测定方面的临床价值.方法:应用聚合酶链反应-单链构象多态性技术分别检测48株RFP药物敏感和耐药结核分支杆茵临床分离株,先用PCR扩增rpoB基因,随后用SSCP方法鉴定其扩增产物有无突变,并与药敏结果做对照分析.结果:48株结核临床分离株中11株RFP敏感株SSCP带谱均与对照相同,37株砌RFP耐药株中有3株带谱与对照相同,另34株SSCP带谱与对照有不同程度的差异.48株临床分离株的L-J药敏法与SSCP的平行分析结果对比,PCR-SSCP方法检测RFP耐药结核菌的敏感性为91.90%,特异性为90.90%.结论:PCR-SSCP技术可快速准确检测结核分枝杆菌rpoB基因突变,此技术可用于临床结核分枝杆菌RFP药物敏感性的直接快速检测,以及时指导临床合理选用敏感抗结核药物.     

青岛地区结核分支杆菌吡嗪酰胺耐药基因pncA的检测

目的 了解青岛地区结核分支杆菌耐吡嗪酰胺（PZA）分离株pncA基因突变的情况,探讨其与耐PZA之间的关系。方法 应用BACTEC-460培养系统对76例结核分支杆菌临床分离株进行结核分支杆菌常规培养和药敏检测,聚合酶链反应-单链构象多态性（PCR-SSCP）技术检测pncA基因的突变。结果 76株结核分支杆菌临床分离株均经PCR扩增出结核分支杆菌复合群保守序列IS6110基因片段,69株扩增出pncA基因的特异序列。后者包括：SSCP泳动异常者18株,其中耐药株13株,敏感株5株;SSCP泳动正常者51株,其中耐药株14株,敏感株37株。结论 青岛地区结核分支杆菌临床分离株耐PZA主要分子机制之一为pncA基因的突变;PCR—SSCP技术能快速准确地检测结核分支杆菌耐PZA基因pncA的突变,可弥补常规药敏试验的不足。     

结核分支杆菌耐异烟肼分子机制的研究

目的为了解新疆地区结核分支杆菌耐异烟肼（INH）分离株KatG基因突变情况，探讨其在INH耐药性中的可能作用。方法采用PCR和PCR—SSCP方法对60株结核分支杆菌临床分离株KatG基因突变进行检测。结果以结核分支杆菌H37RV为对照，28株药物敏感株的KatG基因PCR扩增产物273bp片段28例SSCP图谱正常。32例耐INH分离株中KatG基因扩增均阳性，其中11株SSCP图谱异常，其敏感性为34．37％。结论新疆地区结核分支杆菌INH耐药株存在KatG基因突变，其突变对INH耐药性的影响有待于进一步研究。     

中国部分地区耐利福平耐药基因的检测

目的　研究中国部分地区耐利福平 (RFP)结核分支杆菌临床分离株rpoB基因突变情况并评价其耐药分子机制。方法　采用聚合酶链反应 -单链构象多态性 (PCR -SSCP)对 45 3株结核分支杆菌临床分离株 (其中敏感株 14 8株 ,耐RFP或含耐RFP株 3 0 5株 )rpoB基因进行检测。并对其中 12株SSCP阴性的耐药株用双脱氧末端终止法进行测序分析。结果　北京市、上海市、河北省、河南省、辽宁省、吉林省、安徽省 ,结核分支杆菌耐RFP临床分离株rpoB基因突变率分别为 90 % ,92 % ,90 % ,90 % ,92 % ,94% ,93 %。经统计学处理不同地区间差异无显著性 ( χ2 =0 3 1,P >0 0 5 )。同时敏感株均无突变 ,特异性为 10 0 %。 12株SSCP阴性耐药株中经测序 4株在 5 3 1位密码子TCG→TTG ,1株 5 2 6位密码子CAC→TAC ,1株发生在 5 16位密码子GAC→GTC ,6株未改变。结论　中国不同地区耐利福平耐药基因突变率大致相同 ,rpoB基因突变是耐RFP结核分支杆菌耐药性的主要分子机制 ,PCR -SSCP可快速检测结核分支杆菌RFP耐药性     

耐多药结核分支杆菌基因突变在耐药性检测中的应用

目的：探讨耐多药结核病（MDR－TB）临床分离株rpoB,KatG,rpsL基因突变在耐药性检测中的应用价值。方法：采用聚合酶链反应－单链构象多态性（PCR－SSCP）技术分析了同时耐异烟肼（INH），利福平（RFP），链霉素（SM）的多耐药临床分离株和35株药敏感株的rpoB,KatG,rpsL基因突变，结果：以结核分支杆菌H37RV为对照，35株药物敏感株的rpoB,rpsL基因SSCP图谱正常，其特异性为100％，KatG基因有2株图谱异常，特异性为94％，71株结核分支杆菌临床分离株均未发现rpoB,KatG,rps基因缺失，其PCR扩增产物SSCP分析结果表明，36株多耐药临床分离株中，32株rpoB基因图谱异常，21株KatG基因图谱异常，26株rpsL基因图谱异常，其敏感性分别为rpoB(89%),KatG(58%),rpsL(72%)，结论：结核分支杆菌耐RFP，INH，SM耐药性的产生主要是由于rpoB,KatG,rpsL基因突变所致，PCR－SSCP技术有望成为结核分支杆菌耐药性检测的方法之一。     

结核分枝杆菌耐药基因快速检测

目的 探讨结核分枝杆菌耐链霉素(SM)和利福平(RFP)的耐药分子机制，采用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)同时检测rpsL基因、rpoB基因突变在结核分枝杆菌耐链霉素(SM)和利福平(RFP)耐药性测定中的应用价值。方法 采用PCR-SSCP技术对122株结核分枝杆菌临床分离株rpsL基因、rpoB基因突变同时进行检测，即首先用PCR方法同时扩增RFP、SM的rpoB基因和rpsL基因，然后进行SSCP分析。结果 以结核分枝杆菌H37RV为对照，48株药物敏感株的rpsL基因、rpoB基因均未见SSCP图谱异常。特异性为100.0％，74株同时耐链霉素和利福平的耐药株中，59株(79.7％)有rpsL基因图谱异常；69株(93.2％)有ropB基因图谱异常。结论 ropB基因突变和rpsL基因突变分别是结核分枝杆菌耐利福平和链霉素的主要分子机制。应用PCR-SSCP技术可同时快速检测结核分枝杆菌链霉素和利福平耐药性。     

Detecting drug resistant genetic mutation among pneumoconiosis patients complicated with tuberculosis in Mycobacterium tuberculosis L-forms application of PCR-SSCP technique in Huainan mining district

Objective： To study the relationship between drug resistant genetic mutation and drug resistance in Mycobacterium tuberculosis L-form, discuss the internal relationship between drug resistances and drug-resistant related genes and explore the value of PCR- SSCP to clinical application. Methods： A total of 52 clinically isolated strains of tuberculosis L-form were collected among 97 pneumoconiosis patients complicated with tuberculosis. The gene mutations of katG, rpoB and rpsL were detected by PCR-SSCP, and the results were compared with those analyzed by traditional antimicrobial susceptibility test（AST）. Results： The gene muta- tion rates of katG, rpoB and rpsL by PCR-SSCP were respectively 57.70% （30/52）, 65.38% （32/52） and 40.38% （21/52）. The rate of reversion was 78.85%（41/52） and the result of drag-resistant genes was invariable. The results of AST showed that there were 40 （76.92%） multi-drug resistant strains in 52 clinically isolated strains. The number for three-drug resistant strain was 21 （40.38%） and that of two-drug resistant was 19（36.54%）, but only 12（23.08%） strains were one drug resistant. The rate of total drug-resistance was 100%, but there were 15 strains of allied mutation of three genes, 16 of two mutations and 6 of only one by PCR-SSCP. The coincidences were respectively 71.43%, 84.12% and 50.00%. Then there was no significant difference between the allied mutations of multi-drug resistant gene and the mutations of only one drug resistant gene （P 〉 0.05）. Conclusion： PCR-SSCP technique has a higher sensibility and specificity to detect the genes of katG, rpoB and rpsL in tuberculosis L-form among pneumoconiosis complicated with tuberculosis,and the detecting rate of two drug resistant strains and three drug resistant strains was higher. The combined application of PCR-SSCP and AST has advantages at earlier diagnosis and guidance of clinical medications.     

耐异烟肼结核分枝杆菌及其katG、inhA基因的突变

目的 探讨耐异烟肼结核分枝杆菌及其katG与inhA基因突变的特征,为临床选择抗结核药物治疗提供实验室参考。方法 回顾性分析2015年1月1日-2017年1月1日在上海交通大学附属同仁医院海南分院的260例患者标本,对213例进行结核分枝杆菌分离培养,对47例进行博奥芯片法检测,再对213例培养所得菌株进行博奥芯片检测,对博奥芯片检测的47例痰标本进行结核分枝杆菌分离培养;对101株结核分杆菌进行katG与inhA基因检测。结果 培养法和博奥芯片结核分枝杆菌检出率分别为36.6%（78/213）和48.9%（23/47）;培养法和博奥芯片耐多药结核分枝杆菌检出率分别为41.0%（32/78）和47.8%（11/23）;博奥芯片法和比例法耐异烟肼符合率98.7%(77/78);男性结核分枝杆菌阳性率45.9%高于女性阳性率29.2%;检测katG基因和inhA基因,3个基因区域都发生突变,突变发生率大小依次为katG315（AGC→ACC）密码子(32株,54.2%)、katG315（AGC→AAC）密码子(16株,27.1%)、inhA-15（C→T）(10株,16.9%)。24株(23.8%,24/101)对异烟肼无突变但对利福平发生突变;43株也同时耐利福平(42.6%,43/101)。突变频率较高的突变位点是315,突变频率为81.4%(48/59),1株(1.7%,1/59)为双位点联合突变且突变频率最低。结论 结核分枝杆菌katG和inhA基因突变与耐INH相关,这为临床及时准确诊断、及早使用抗结核药物联合治疗提供了帮助。     

Detecting katG Drug Resistant Genetic Mutation among pneumoconiosis patients complicated with tuberculosis in Mycobacterium tuberculosis L-forms by PCR-SSCP

Objective：To study the relationship between mutation in the katG gene and drug resistance of INH in Mycobacterium tuberculosis L-forms among patients of pneumoconiosis complicated with pulmonary tuberculosis, and to explore the clinical application of PCR-SSCP. Methods： A total of 52 clinical isolated strains of Mycobacterium tuberculosis L-forms were collected. Mutation in the katG genes was detected by PCR-SSCP and traditional antimicrobial susceptibility test （AST）. Results： The results by AST showed that there were 40 persisters in 52 clinical isolated strains. The drug resistant rate was 76.92%（40/52）, and the gene mutation rate of katG was 57.70%（30/52）by PCR-SSCP, the difference was no quite significance （X^2 = 2.8507, P 〉 0.05）. The coincidence rate of two methods was 75.00% （30/40）. Conclusion： The detectionrate of katG resistant strains in Mycobacterium tuberculosis L-forms was high by PCR-SSCP. The combined application of PCR-SSCP and traditional antimicrobial susceptibility test can improve the detecting rate.     

耐多药结核分枝杆菌基因突变在耐药性检测中的应用

目的:探讨结核分枝杆菌耐链霉素(SM)和利福平(RFP)的耐药分子机制,应用聚合酶链反应一单链构象多态性(PCR-SSCP)同时检测rpsL基因、rpoB基因突变在结核分枝杆菌耐SM和RFP耐药性测定中的应用价值。方法:采用PCR-SSCP技术对168株结核分枝杆菌临床分离株rpsL基因、rpoB基因突变同时进行检测。即首先用PCR方法同时扩增RFP、SM的rpoB基因和rpsL基因,然后进行SSCP分析。结果:以结核分枝杆菌H37RV为对照,82株药物敏感株的rpsL基因、rpoB基因均未见SSCP图谱异常。特异性为100%。86株同时耐SM和RFP的耐药株中,68株(79.1%)有rpsL基因图谱异常;81株(94.2%)有rpoB基因图谱异常。结论:rpoB基因突变和rpsL基因突变分别是结核分枝杆菌耐RFP和SM的主要分子机制。应用PCR-SSCP技术可同时快速检测结核分枝杆菌SM和RFP耐药性。     

Molecular mechanisms of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates

ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｓｔｕｄｙｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（Ｍ）ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ,ｔｏｅｖａｌｕａｔｅｔｈｅｖａｌｕｅｏｆｔｈｅβｓｕｂｕｎｉｔｏｆＲＮＡｐｏｌ...     

结核分枝杆菌异烟肝耐药基因突变的研究

目的：了解我国结核分枝杆菌耐异烟肼（INH）分离株katG基因突变情况,探讨快速检测结核分枝杆菌耐药基因型的分子药敏检测方法。方法：用PCR单链构象多态性（PCR－SSCP）和PCR直接测序法（PCR－DS）检测30株结核分枝杆菌临床分离株的katG基因。结果：以结核分枝杆菌H37Rv标准株对照观察所有INH敏感株的PCR－SSCP和PCR－DS图谱,均未发现异常;而在12株INH耐药株中,有4株无PCR－SSCP和PCR－DS图谱异常,占INH耐药株的33．4％;有5株在94位发生核苷酸错义突变,占INH耐药株41．7％,有3株在96位发生核苷酸同义突变,占INH耐药株的25％。结论：多数结核分枝杆菌对INH是由于其katC基因突变所致,可先用PCR－SSCP筛选突变株,再用PCR－DS方法测定其突变位点,达到快速检测结核分枝杆菌INH耐药基因型的目的。     

PCR-SSCP法检测结核分枝杆菌耐药性

目的：探讨耐多药结核分枝杆菌耐药基因突变与耐药性的关系以及聚合酶链反应-单链构象多态性分析(poly merase chain reaction-single strand cinfomlation polymorphism，PCR-SSCP)方法的临床应用价值。方法：用PCR-SSCP方法检测58株结核分枝杆菌临床分离株katG，rpoB，rpsL基因突变并与常规药敏试验检测结果进行对比。结果：经常规药敏试验检测，58株结核分枝杆菌临床分离株中共有41株耐药，其中，耐异烟肼(INH)为35株，高耐药株27株；耐利福平(RFP)为31株，高耐药株24株；耐链霉素(SM)有31株，高耐药株26株。同时耐3种药物的有21株(51．2％)，耐2种药物的14株(34．1％)，单耐药株6株(14．6％)．PCR-SSCP方法对58株临床分离株katG，rpoB，rpsL基因突变的检测率为40％(23／58)，45％(26／58)，38％(22／58)，其中检出3个基因同时突变的有13株(32％)，2种基因突变的12株(29％)，1种基因突变的有10株(23．8％)．常规药敏试验与PCR-SSCP法检出结核分枝杆菌同时耐3种药物的符合率为61．9％(13／21)，检出耐2种药物的符合率为85．70k，(12／14)，检出耐1种药物的符合率为50％(3／6)．高耐药株中突变率为80．5％(62／77)，低耐药株中突变率为60％(12／20)．结论：PCR-SS-CP方法对耐2种以上药物的结核杆菌检出率较高，且耐药基因突变率随着耐药浓度增高而增高。将PCR-SSCP法与药敏试验联合应用可互相弥补，已成为临床指导用药的好方法。     

结核分枝杆菌rpoB基因突变与多重耐药及利福平耐药程度的相关性

目的 研究结核分枝杆菌，rpoB基因突变与多重耐药及利福平耐药程度强弱之间的关系。方法应用绝对浓度法测定58株结核分枝杆菌对4种－线抗结核药物的药敏特性，对耐利福平结核分枝杆菌的耐药谱进行分析。同时对含有核心突变区的结核分枝杆菌，rpoB基因片段进行PCR扩增和DNA测序，分析rpoB基因突变与多重耐药的关系，以及突变位点和突变性质与利福平耐药强弱的相关性。结果58株结核分枝杆菌中，利福平耐药株36株，敏感株22株。36株耐药株均存在，rpoB基因突变，其中88．9％(32／36)至少对利福平和异烟肼同时耐药。90．O％的利福平高度耐药株(18/20)与rpoB基因531位和526位密码子突变相关。密码子531位和526位各有1株双碱基突变，且均为多重耐药株。结论结核分枝杆菌，rpoB基因突变所致的利福平耐药株大部分对异烟肼耐药，因此单独检测rpoB基因突变即可初步筛选多重耐药的结核分枝杆菌；而rpoB基因的突变位点与利福平耐药程度之间具有一定的相关性。     

结核分枝杆菌链霉素耐药基因突变特征分析

目的 了解广东地区链霉素耐药结核分枝杆菌rpsL、rrs基因突变特征。方法 对137株链霉素耐药、166株链霉素敏感的结核分枝杆菌临床分离株应用聚合酶链式反应技术（PCR）扩增rpsL、rrs基因片段,并进行测序、分析比对。结果 137株链霉素耐药菌株中, 118株存在rrs或者rpsL基因突变,突变率86.13%;其中92株存在rpsL基因突变（突变率为67.15%）,主要分布在43位氨基酸（70株）与88位氨基酸（20株）,其中43位氨基酸突变类型为K→R（AAG→AGG,49.64%）和K→T（AAG→ACG,1.46%）,88位氨基酸突变类型为K→R（AAG→AGG,13.14%）、K→T（AAG→ACG,0.73%）和K→Q（AAG→CAG,0.73%）,并有2株存在39、43位氨基酸的联合突变,即T→T（ACC→ACT）联合K→T（AAG→ACG）突变（1.46%）; 47株存在rrs基因突变（突变率为34.31%）,包括8种核苷酸突变,主要分布在1401位A→G（13.14%）、514位A→C（8.76%）、517位C→T（6.57%）,2株存在514、1401位核苷酸A→C;A→G的联合突变;15株存在rpsL与rrs基因的同时突变;166株链霉素敏感菌株中,7株存在rpsL基因突变,13株存在rrs基因突变。结论 广东地区链霉素耐药结核分枝杆菌株的rpsL、rrs基因突变具有其自身特点,存在地域差异。