缓激肽对转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导视网膜色素上皮细胞发生上皮间充质转化的影响

目的　制作增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy,PVR)的上皮间充质转化（epithelial-mesenchymal transformation,EMT）细胞模型,研究缓激肽（bradykinin,BK）对视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium,RPE）细胞发生EMT的影响,并探讨BK对PVR的影响机制。方法　体外培养人RPE细胞株ARPE-19细胞,采用不同浓度转化生长因子-β1（transforming growth factor- β1,TGF- β1）分别作用于ARPE-19细胞24 h、48 h,于倒置显微镜下观察细胞形态变化;采用CCK-8检测细胞增殖情况,确定TGF-β1浓度及作用时间;利用Western blot和细胞免疫荧光检测EMT标志蛋白E-钙黏素、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）和波形蛋白（Viminten）表达情况;细胞划痕实验、Transwell实验检测细胞迁移能力。同时采用Western blot检测TGF/Smad通路下游pSmad3和Smad7的表达。结果　TGF- β1刺激ARPE-19细胞后可以成功诱导EMT体外细胞模型。当TGF-β1浓度为10 μg·L^-1、作用时间为48 h时,细胞增殖最明显。BK在TGF- β1诱导的EMT中可以降低α-SMA、Viminten的表达,升高E-钙黏素的表达并且降低细胞迁移能力。这些影响能被BK-2受体拮抗剂HOE-140逆转。TGF-β1诱导ARPE-19细胞发生EMT时,pSmad3表达量升高;TGF-β1刺激前给予BK刺激,pSmad3表达量减少;加入BK前预敷HOE-140,然后给予TGF-β1刺激,BK作用减弱,pSmad3表达量升高。Smad7表达趋势与pSmad3表达趋势相反。结论　10 μg·L^-1 TGF-β1可导致ARPE-19细胞发生EMT。BK通过TGF-/Smad信号通路上调Smad 7的表达、下调pSmad 3的表达,从而逆转TGF-β1诱导的EMT。提示BK可能是一种新的、有效的治疗PVR的方法。     

核心蛋白多糖对兔晶状体上皮细胞增生的抑制作用

背景 研究发现,白内障囊外摘出术后组织修复反应可诱导房水中活性转化生长因子β(TGF-β)的增加,残留的晶状体上皮细胞(LECs)移行、分化,细胞外基质沉积,引起上皮-间质转化,导致后囊膜混浊(PCO)的发生.寻求有效的抑制LECs增生的药物对于临床上防治PCO的发生具有重要意义. 目的 探讨核心蛋白多糖( decorin)对兔LECs增生的抑制作用及其剂量-效应与时间-效应的关系. 方法 兔LECs细胞株进行培养和传代,将处于指数生长期的细胞以8×106个/L密度接种于96孔板,将0.1、1.0、10.0 mg/Ldecorin分别加入培养基中培养24、48、72 h,加入体积分数0.1％ DMSO培养的细胞为阳性对照组,常规培养基培养的细胞为空白对照组.MTT比色法分别测定不同质量浓度的decorin作用于LECs不同时间后的细胞生长抑制率;采用流式细胞技术测定各组细胞的细胞周期,用ELISA法检测各组培养液上清中TGF-β的水平,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法测定TGF-βmRNA在LECs中的表达,免疫细胞化学法观察α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达.结果 ELISA检测结果表明,各组培养基上清液中TGF-β表达量的差异有统计学意义(F=39.24,P=0.03),不同质量浓度组TGF-β水平均明显低于空白对照组,差异有统计学意义(P＜0.01),1.0 mg/L、10.0 mg/L decorin组TGF-β水平均明显低于0.1 mg/L decorin组(P＜0.05).MTT比色法结果显示,≥1.0 mg/L decorin组LECs增生的抑制率明显高于空白对照组,各质量浓度decorin组药物作用48 h和72 h后LECs增生的抑制率明显高于24 h的值,药物作用72 h后LECs增生的抑制率明显高于48 h的值,差异均有统计学意义(P＜0.05),各质量浓度decorin组G0/G1期LECs所占比例均较空白对照组明显增加,差异均有统计学意义(P＜0.05).RT-PCR检测显示,TGF-β mRNA的表达随着decorin质量浓度的升高而降低.免疫组织化学染色表明,10.0 mg/L decorin组α-SMA在LECs中的表达明显弱于空白对照组. 结论 Decorin可以抑制LECs的增生,也可以诱导LECs凋亡,其效应呈明显的剂量和时间依赖性,有望成为最具潜力的防治PCO的药物之一.     

吡咯烷二硫代氨基甲酸酯对TGF-β2诱导人晶状体上皮细胞EMT的抑制作用

目的：探究吡咯脘二硫代氨基甲酸酯(PDTC)对转化生长因子-beta2(TGF-β2)诱导人晶状体上皮细胞(LECs)上皮-间充质转化(EMT)的逆转机制。

方法：TGF-β2诱导人晶状体上皮细胞EMT,并给予不同浓度PDTC处理TGF-β2诱导的LECs。CCK-8、划痕试验检测细胞增殖与迁移,Western Blot检测EMT标志物E-cadherin、α-SMA和NF-κB信号传导通路相关蛋白表达,以及凋亡相关蛋白BAX、BCL-2、Caspase-3、细胞周期蛋白D₁的表达。

结果：TGF-β2处理组细胞增殖和迁移活力明显高于未添加TGF-β2的实验组; E-cadherin表达下调,α-SMA表达上调。在TGF-β2的作用下NF-κB p65和磷酸化的NF-κB p65表达增加(P<0.05)且在TGF-β2 10 ng/mL刺激浓度时LECs表现出较强的增殖活力和迁移能力。PDTC逆转EMT和诱导细胞凋亡的机制研究表明,PDTC干预处理后细胞活力和迁移能力都显著降低,PDTC抑制IκB的磷酸化进而抑制NF-κB核移位,NF-κB信号通路中NF-κBp65/p-NF-κB p65、Iκκ-α/p-Iκκ-α表达下调(P<0.05),诱导促凋亡蛋白BAX/Caspase-3表达上调、抑凋亡蛋白BCL-2、细胞周期蛋白Cyclin D₁表达下调,NF-κB/IκB mRNA表达下调,凋亡相关mRNA BAX表达上调BCL-2表达下调。

结论：PDTC可显著逆转由TGF-β2诱导的LECs细胞EMT过程,可能与抑制NF-κB信号通路活化使NF-κB p65/IκB/Iκκ-α表达降低以及激活凋亡相关蛋白表达有关,PDTC可通过抑制NF-κB信号通路达到逆转EMT的进程并使异常增殖的细胞发生凋亡,这将为后发性白内障的治疗提供新的潜在的治疗药物。     

地塞米松对人晶状体上皮细胞核转录因子κB及其抑制蛋白α的表达和细胞凋亡的影响

背景长期全身或眼局部应用糖皮质激素可诱导皮质类固醇性白内障,但其作用机制尚不明确。目的研究地塞米松作用于人晶状体上皮细胞（LECs）后对LECs中核转录因子κB（NF—κB）／NF—κB抑制蛋白κ（IκBκ）表达的影响及LECs凋亡的发生情况,了解皮质类固醇性白内障的发病机制。方法取人LECs系（HLE283）在含质量分数20％胎牛血清的DMEM中进行培养和传代。将不同浓度的地塞米松（0．01、0．1、1、10、100μmol／L）分别加入DMSO无血清DMEM培养液中作为不同浓度地塞米松组,不含地塞米松的DMSO无血清DMEM培养液培养的LECs作为空白对照组。采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）、Western blot、流式细胞术等方法,分别在基因水平、蛋白水平检测LECs中NF—κB／IκB α浓度的改变及LECs凋亡率的变化。结果扩增的基因片段与所设计片段大小一致。地塞米松作用后NF—α核蛋白在LECs中的表达量随着地塞米松浓度的增加而下降,差异有统计学意义（F=36．077,P=0．004）;IκBα蛋白的表达随着地塞米松浓度的增加而上升,差异有统计学意义（F=35．741,P=0．002）。在同浓度地塞米松组,NF—κB核蛋白在LECs中的表达量随作用时间的不同差异有统计学意义（F=16．606,P=0．01）,与地塞米松作用24h时的表达量比较,36h和48h时的NF—κB核蛋白表达量明显下降,差异有统计学意义（P=0．002;P=0．01）。与地塞米松作用24h时的表达量比较,36h和48hIκBα蛋白在LECs中的表达量明显增加,差异均有统计学意义（P=0．014;P=0．002）。流式细胞仪检测显示LECs的凋亡率随着地塞米松浓度的增加明显上升,与空白对照组相比差异有统计学意义（P〈0．05）。结论地塞米松通过上调IκBα的表达而过度抑制了NF—κB的活性,并导致LECs凋亡,其作用呈浓度依赖性,这可能是皮质类固醇性白内障发生发展的细胞学和分子生物学机制之一。     

TGF-β2作用于人晶状体上皮细胞后Smad 4与p-Smad2／3的动态表达

目的观察转化生长因子β2（TGF-β2）作用于人晶状体上皮细胞（LECs）后2类通路转导蛋白Smad4和p-Smad2／3的动态表达变化。方法体外培养的人LECs中添加10ng／mL人TGF—β2,RT-PCR方法测定不同时间点Smadg mRNA的表达,Western blot观察p-Smad2／3的表达,免疫组织化学法观察p-Smad2／3在LECs表达的特点。结果人LECs添加了外源性人TGF-β2,后1h,可出现Smad 4 mRNA表达增高,16h时达峰值（0．72±0．07）,并持续至24h。与对照组比较差异无统计学意义（P〈0．05）。p-Smad2／3在2h后逐渐增强,与对照组比较差异明显,16h达到峰值（2．53g／L）。16h有p-Smad2／3颗粒胞浆表达,24b向核内聚集。结论TGF-β2刺激LECs后,可激活膜受体激活型Smad和通用型Smad,TGF-β2对Smad通路蛋白的激活存在时效关系。TGF—β2可通过特异性激活Smad通路,将信号转导至细胞核内。     

Mfn2在TGF-β2诱导的晶状体上皮细胞上皮-间质转化中的作用

目的　研究线粒体融合蛋白基因2（mitofusin 2,Mfn2）在转化生长因子β₂（transforming growth factor β₂,TGF-β₂）诱导的人晶状体上皮细胞（human lens epithelial cells,HLECs）发生上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）过程中的表达及作用。方法　实时荧光定量PCR检测不同浓度（10 ng·mL^-1、50 ng·mL^-1、100 ng·mL^-1）TGF-β₂处理HLECs 24 h后,各TGF-β₂处理组与对照组（0 ng·mL^-1 TGF-β₂） Mfn2 mRNA表达量差异。选取最佳作用浓度后,免疫荧光细胞化学检测TGF-β₂处理组与对照组的Mfn2蛋白表达变化,实时荧光定量PCR和免疫荧光细胞化学检测分别验证TGF-β₂处理组与对照组中E-钙黏蛋白（E-Cadherin）和波形蛋白（Vimentin） mRNA表达量和蛋白表达变化。Mfn2基因荧光表达载体（pEGFP-Mfn2）转染后实时荧光定量PCR和免疫荧光细胞化学检测分别验证转染组和对照组Mfn2、E-Cadherin和Vimentin mRNA表达量差异和蛋白表达变化。结果　TGF-β₂处理组与对照组相比,E-Cadherin mRNA表达量减少;Vimentin、Mfn2的mRNA表达量均增加,且差异均有统计学意义（均为P<0.001）。E-Cadherin蛋白表达降低,Vimentin、Mfn2的蛋白表达增加。成功转染Mfn2后转染组与对照组相比,E-Cadherin mRNA表达量下调,Vimentin mRNA表达量均增加,差异均有统计学意义（均为P<0.001）。E-Cadherin蛋白表达降低,Vimentin蛋白表达增加。结论　HLECs在发生EMT时Mfn2表达量上调,过表达Mfn2可使HLECs发生EMT。Mfn2参与了TGF-β₂诱导的HLECs的EMT过程。     

mTOR在TGF-β2诱导的人晶状体上皮细胞上皮-间叶样转化过程中的动态表达

目的观察雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)在转化生长因子β2(transforming growth factor-β2,TGF-β2)诱导的人晶状体上皮细胞(human lens epithelial cells,HLEC)上皮-间叶样转化过程中的动态表达变化。方法将10μg·L-1TGF-β2加入HLEC-B3细胞系,分别在体外培养0h、1h、6h、12h、24h、48h,光学倒置显微镜下观察细胞的形态变化,Western blot-ting检测mTOR及其磷酸化水平在该过程中的动态表达情况,同时观察HLEC上皮细胞标志物缝隙连接蛋白43(connexin43,Cx43)、上皮性钙黏附蛋白(E-cadherin,E-cad)和间叶样细胞标志物纤维连接蛋白(fibronectin,FN)、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表达水平。结果在10μg·L-1TGF-β2诱导HLEC间叶样分化过程中,随着培养时间的增加,HLEC从类椭圆形、多角形逐渐变为长梭形,且细胞间隙增大。与未经TGF-β2处理的HLEC相比,E-cad和Cx43分别于培养的6h和12h时表达开始明显下降(E-cad:1.059±0.004,P=0.000;Cx43:0.477±0.076,P=0.032),FN和α-SMA于处理24h时表达开始明显增高(FN:0.872±0.134,P=0.011;α-SMA:0.516±0.049,P=0.000);mTOR的磷酸化水平从培养的6h开始明显增高(0.542±0.124,P=0.003),并呈时间依赖性表达上调,在24h时达到最高水平,但总mTOR的表达水平没有明显变化。结论 TGF-β2诱导HLEC上皮-间叶样转化过程中mTOR磷酸化激活,并随间叶样转化程度的增高而表达增加,提示mTOR可能参与了HLEC向间叶样细胞转化的过程。     

TGF-β2刺激人Tenon囊成纤维细胞生物学行为改变及表达整合素连接激酶(ILK)的研究

目的 探讨转化生长因子β2(transforming growth factor beta 2,TGF-β2)对体外培养的人Tenon囊成纤维细胞(human Tenon fibroblasts,HTFs)生物学行为及表达整合素连接激酶(integrin-linked kinase,ILK)的影响.方法 组织块贴壁法培养原代HTFs,免疫荧光染色鉴定波形蛋白和角蛋白.MTT法检测不同浓度TGF-β2对HTFs细胞的促增殖作用,RT-PCR检测TGF-β2作用前后α-平滑肌肌动蛋白(smooth muscle actin,SMA)、ILK mRNA的表达,Western Blot检测α-SMA、ILK、E-cadherin蛋白的表达,细胞免疫荧光染色检测α-SMA、E-cadherin蛋白的表达.结果 MTT检测结果显示,TGF-β2作用48 h、72 h,5.0 μg· L-1及10.0 μg· L-1诱导下的OD值显著高于0.1μg·L-1、1.0 μg·L-1组及空白对照组(均为P＜O.05),5.0 μg·L-1及10.0 μg·L-1作用48 h及72 h的OD值显著高于24 h(均为P＜0.05).RT-PCR检测结果显示,5.0μg·L-1TGF-β2诱导48 h后,α-SMA mRNA及ILK mRNA水平和空白对照组相比明显上调,差异均有统计学意义(均为P＜0.05).Western Blot检测结果显示,ILK、α-SMA及E-cadherin在空白对照组和5.0 μg· L-1TGF-β2处理组均有表达,但TGF-β2能够明显上调三者的表达,5.0 μg·L-TGF-β2处理48 h组与空白对照组差异均有统计学意义(均为P＜0.05).细胞免疫荧光染色结果显示,TGF-β2处理组α-SMA、E-cadherin均有荧光表达,其中oα-SMA表达在细胞质中,而E-cadherin在细胞质和细胞核中均有表达.结论TGF-β2可以诱导体外培养HTFs增殖,转分化及黏附性增强,同时促进ILK的高表达,提示ILK在青光眼术后瘢痕化过程中可能也起到一定作用.     

ILK siRNA对高浓度葡萄糖诱导的人LECs增生和上皮向间质转化的抑制作用

目的探讨整合素连接激酶（ILK）对高浓度葡萄糖诱导的人晶状体上皮细胞（LECs）增生和转化的作用。方法将体外培养的人LECs系SRA01/04细胞分别培养在含葡萄糖5.5mmol/L（正常对照组）和30.5mmol/L（高糖组）的培养液中,用RT-PCR检测培养0、6、24h后ILK mRNA的表达;用ILK siRNA脂质体转染细胞,转染6h后,加入2组培养液处理24h,检测ILK、细胞增生核抗原（PCNA）、LECs转化指标α-SMA和FN在mRNA水平的表达。结果高糖组培养6h和24h,SRA01/04细胞ILK mRNA是正常对照组的2.48倍和2.32倍（P〈0.01）,刺激后24h,SRA01/04细胞PCNA、α-SMA、FN的mRNA表达分别是正常对照组的1.75、1.96和1.75倍（P〈0.01）。ILK siRNA干扰后,正常对照组ILK的表达是非转染细胞的30%,高糖组转染细胞ILK mRNA水平（P〈0.01）是非转染细胞的21%（P〈0.01）,转染细胞PCNA、α-SMA和FN的表达分别是非转染细胞的29%、33%和39%（P〈0.01）。结论高浓度葡萄糖可诱导LECs增生、上皮向间质转化及ILK表达上调,抑制ILK的高表达能阻止这些过程。     

后囊膜混浊的体外上皮-间质转化模型的建立

背景 上皮-间质转化(EMT)是导致后囊膜混浊(PCO)的主要发病机制之一,研究LECs的EMT过程对PCO的防治具有重要意义,但目前缺乏研究EMT的PCO体外细胞模型. 目的 建立新的人晶状体囊外摘出术PCO的体外囊袋培养模型,探讨PCO形成过程中LECs EMT的发生情况.方法 利用健康供体的40只尸眼行体外模拟的白内障摘出术,游离晶状体囊袋后用昆虫针固定于培养皿,置于含体积分数10％胎牛血清的DMEM/F12培养液中培养4周,分别于培养后0、3、7、14和28 d在光学显微镜下观察培养囊袋中LECs的生长情况;收集0、3、7和28 d的囊袋组织制备组织病理学切片,采用苏木精-伊红染色法检测囊袋上LECs的细胞形态;采用免疫组织化学染色法检测EMT标志物α-SMA、E-cadherin和Vimentin蛋白在囊袋上LECs中的表达和定位;采用实时荧光定量PCR和Western blot法检测不同时间点囊袋上LECs中α-SMA、E-cadherin和Vimentin mRNA及其蛋白的表达变化. 结果 未进行培养的囊袋后囊膜上未发现LECs生长,囊袋培养后3d可见后囊膜周边出现LECs并逐渐向中央区增生,培养后7 d LECs完全覆盖后囊膜,略呈铺路石样外观并出现皱褶,此后随着培养时间的延长皱褶的数量增多并伸长,囊袋张力增强.免疫组织化学染色结果显示,随培养时间的延长,囊袋上LECs中E-cadherin的表达强度逐渐下降,而α-SMA和Vimentin的表达强度逐渐增强.实时荧光定量PCR检测表明,培养后0、3、7、14和28 d囊袋上LECs中E-cadherin mRNA的相对表达量分别为3.35±0.13、1.47±0.20、1.13±0.14、1.00±0.85和0.23±0.03,Vimentin mRNA的相对表达量分别为1.00±0.73、1.05±0.14、2.24±0.43、2.84±0.34和8.570±0.40,α-SMA mRNA的相对表达量分别为1.00±0.06、2.68±0.28、4.24±0.05、2.05±0.90和15.30±0.19,总体比较差异均有统计学意义(E-cadherin mRNA:F=23.430,P=0.000;Vimentin mRNA:F=8.915,P=0.002;α-SMA mRNA:F=103.500,P=0.000),其中培养后28 d囊袋上LECs中E-cadherin mRNA的相对表达量最低,而Vimentin mRNA和α-SMA mRNA的相对表达量均最高,差异均有统计学意义(均P＜0.01).Western blot检测结果表明,培养后0、3和28 d囊袋上LECs中E-cadherhin蛋白表达的灰度值分别为1.443±0.017、1.023±0.003和0.568±0.018,Vimentin蛋白表达的灰度值分别为0.565±0.012,1.156±0.007和1.241 ±0.009,α-SMA蛋白表达的灰度值分别为0.195±0.045,0.693±0.036和1.501±0.005,总体比较差异均有统计学意义(E-cadherhin:F=2 787.000,P=0.000:Vimentin:F=4 488.000,P=0.000;α-SMA:F=1 173.000,P=0.000),其中培养后3、28 d LECs中E-cadherhin蛋白表达明显低于0d,而Vimentin和α-SMA蛋白表达明显高于0d,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 本研究中的新囊袋模型进行LECs体外培养能模拟体内白内障术后晶状体后囊LECs的EMT自然过程,是探讨PCO发生机制和方法新的体外细胞模型.     

MG132对人晶状体上皮细胞增生、移行和上皮-间充质转化的抑制作用

背景 晶状体后囊膜混浊（PCO）发生的主要病理机制是白内障术后后囊膜残留的晶状体上皮细胞（LECs）的增生、移行和分化,研究发现蛋白酶体抑制剂MG132可抑制牛LECs的增生,但对人LECs的生物学影响尚不明确. 目的 研究蛋白酶体抑制剂MG132对体外培养的人LECs增生、移行和上皮-间充质转化（EMT）的抑制作用.方法 收集白内障超声乳化摘出术中连续环形撕囊的囊膜片用组织块培养法进行原代培养并传代,取第2代或第3代LECs进行常规消化,调整细胞密度至5×105个/ml,以200 μl/孔接种至96孔板常规培养24 h,分别加入成纤维细胞生长因子-2（FGF-2）、MG132或MG132＋FGF-2,以基础培养液培养的细胞作为对照组,培养24 h后用MTT法测定吸光度（A490）值,计算LECs的增生率.在移行能力测定中,应用传代的人LECs分别加入FGF-2、MG132或MG132＋FGF-2,以基础培养液培养的细胞作为对照组,用无菌棉棒在细胞层中划出细胞裸露区,继续培养24 h,计数移行至裸露区的细胞,评估细胞移行率.在传代的人LECs培养液中分别加入转化生长因子-β2（TGF-β2）、MG132或MG132＋TGF-β2,以基础培养液培养的细胞作为对照组,培养24 h后用免疫组织化学法检测细胞质中纤维连接蛋白（FN）的表达. 结果 对照组、FGF-2组、MG132组和MG132＋FGF-2组的LECs增生值（A490）分别为0.582±0.020、0.723 ±0.010、0.434±0.011和0.465±0.008,总体差异有统计学意义（F=110.482,P＜0.01）,FGF-2组LECs增生值明显高于对照组,MG132组和MG132＋FGF-2组的LECs增生值明显低于对照组,差异均有统计学意义（P＜0.05）.对照组、FGF-2组、MG132组和MG132＋FGF-2组LECs移行数目分别为8.67±1.08、11.58±1.59、2.67±0.09和2.75±0.09,差异有统计学意义（F=34.301,P＜0.01）,其中FGF-2组LECs的移行数明显多于对照组,而MG132组和MG132＋FGF-2组LECs移行数明显少于对照组,差异均有统计学意义（P＜0.05）.与对照组比较,MG132组LECs的增生率和移行率分别降低25.4％和75.0％,FGF-2组LECs增生率和移行率分别增加24.2％和33.6％,MG132＋FGF-2组LECs的增生率和移行率分别下降20.1％和68.3％.对照组、TGF-β2组、MG132组和MG132＋TGF-β2组LECs中FN表达量（A值）分别为1.242±0.023、2.329±0.113、1.043±0.021和1.163±0.018,差异有统计学意义（F=113.752,P＜0.01）,TGF-β2组LECs中FN表达量明显高于对照组,而MG132组和MG132＋TGF-β2组明显低于对照组,差异均有统计学意义（P＜0.05）.TGF-β2可以诱导人LECs转分化,FN表达增强;MG132与TGF-β2同时存在时可以减弱人LECs转分化,FN表达下降. 结论 MG132抑制体外培养的人LECs的增生与移行,并可阻止TGF-β2诱导的人LECs的EMT.     

丹参酮ⅡA对人角膜基质细胞纤维化的抑制作用

目的　研究丹参酮ⅡA （tanshinoneⅡA,TSN） 对转化生长因子β1 （transforming growth factor-β1,TGF-β1） 诱导的人角膜基质细胞 （human keratocyte,HK） 纤维化的作用,探索该药物是否具有防治角膜瘢痕的潜能。方法　采用胰蛋白酶消化培养HK,并传代至4-7代用于实验。通过TGF-β1诱导建立HK纤维化模型,并分别用5.0 μg·L^-1 TGF-β1和不同浓度的TSN联合给药方法对HK进行处理。采用Western blot检测α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）与Vimentin的表达,qPCR检测纤连蛋白 （fibronectin,FN） 和I型胶原（collgen I,COL I） mRNA的表达;利用细胞免疫荧光染色观察HK细胞形态的改变。结果　5.0 μg·L^-1 TGF-β1可以显著上调α-SMA与Vimentin蛋白的表达和胞外基质成分FN mRNA（2.238±0.227）、COL I mRNA（3.554±0.526）的表达。2.5 μmol·L^-1和5.0 μmol·L^-1 TSN均能抑制α-SMA蛋白的表达和FN mRNA（0.619±0.017、0.263±0.006）、COL I mRNA（0.631±0.011、0.275±0.081）的表达。5.0 μg·L^-1 TGF-β1诱导组HK形态呈长梭形,具有两极,细胞呈极性分布;5.0 μmol·L^-1 TSN联合5.0 μg·L^-1 TGF-β1培养HK形态同原始细胞形态,细胞呈三角形或星形。结论　TSN可抑制TGF-β1诱导的HK纤维化,具有抗角膜瘢痕的潜力。     

RNA干扰技术干扰信号通路在后发性白内障防治中的应用

后发性白内障即后囊膜混浊(PCO),是白内障超声乳化摘出联合人工晶状体植入术后常见的并发症.白内障术后残留的晶状体上皮细胞(LECs)向后囊膜表面移行、增生及上皮-间质转化(EMT)等细胞生物学行为的改变可引起LECs纤维化、PCO及囊袋皱缩.转化生长因子β2(TGF-β2)是目前已知的参与诱导LECs的EMT及组织病理性纤维化关键的细胞因子,它可通过Smad经典通路参与诱导LECs的EMT过程.除此之外,PI3 K/AKT/mTOR信号通路也参与了TGF-β2诱导的EMT过程.RNA干扰(RNAi)技术作为基因调控手段之一,在通过干扰信号通路而抑制LECs的纤维化及增生、迁移等生物学行为中有一定的应用前景.本文就RNAi技术通过干扰PI3 K/AKT/mTOR信号通路和TGF-β2/Smad信号通路对LECs的生物学行为的影响,及其在PCO防治中的作用进行综述.     

自噬调节高浓度葡萄糖诱导的人晶状体上皮细胞上皮间质转化

目的:探究自噬水平变化对高糖诱导人晶状体上皮细胞上皮间质转化(EMT)的影响及其机制。方法:人晶状体上皮细胞(HLE-B3)分为正常对照组(NC组)和高糖处理组(HG组),分别用含5.5mmol/L葡萄糖的DMEM和添加了30mmol/L葡萄糖的上述DMEM培养12、24、48h,用Western blot检测上皮间质转化标志蛋白(E-cadherin、α-SMA)和自噬标志蛋白(LC3、Beclin 1和SQSTM1/p62)的表达变化,用划痕实验观察细胞的移行能力以明确高糖对晶状体上皮细胞自噬和EMT的影响。利用雷帕霉素调节自噬水平,将细胞分为正常对照组(NC组)、高糖处理组(HG组),高糖处理细胞的同时添加DMSO溶剂组(DMSO组)和添加200nmol/L雷帕霉素的雷帕霉素组(RAPA组),处理细胞24h,用Transwell实验观察细胞的移行能力,用Western blot检测EMT、自噬标志蛋白和TGF-β信号通路蛋白(TGF-β2、Smad2/3、p-Smad2/3、Snail)的表达。用细胞免疫荧光染色观察SQSTM1/p62与Smad2/3在细胞内的表达,免疫共沉淀方法检测细胞中SQSTM1/p62与Smad2/3之间的相互结合。结果:在高糖刺激后12、24、48h,HG组细胞E-cadherin、LC3Ⅱ/Ⅰ和Beclin 1蛋白表达逐渐降低(F=67.52、163、206,均P<0.0001),而α-SMA、SQSTM1/p62蛋白表达增加(F=53.37、302.1,均P<0.0001),细胞移行也较NC组增加(均P<0.001),提示高糖刺激后细胞发生EMT,而自噬水平降低;雷帕霉素处理后,与HG组和DMSO组相比,RAPA组LC3Ⅱ/Ⅰ和E-cadherin蛋白表达水平增加,α-SMA、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3及Snail蛋白表达降低(均P<0.05),TGF-β2表达无明显改变(均P>0.05),细胞移行被抑制(均P<0.001),提示雷帕霉素在提高自噬水平的同时下调了TGF-β信号通路分子的表达进而抑制了EMT。细胞免疫荧光染色结果显示SQSTM1/p62与Smad2/3在胞浆内存在共定位,免疫共沉淀实验证实了SQSTM1/p62与Smad2/3蛋白相互结合。结论:高糖可刺激HLE-B3细胞发生EMT,下调细胞的自噬水平;自噬通过SQSTM1/p62与Smad2/3相互作用,改变了TGF-β信号通路中Smad2/3的表达,实现对EMT的调节。     

转化生长因子-β2诱导人Tenon囊成纤维细胞转化及其在瘢痕形成中的作用

背景 研究表明转化生长因子-β2(TGF-β2)能够促进瘢痕形成,但其在青光眼滤过术后局部瘢痕形成中的作用机制值得研究. 目的 探讨TGF-β2对人Tenon囊成纤维细胞(HTFs)转化以及在滤过术后瘢痕形成中的作用.方法 在斜视手术中获取3例患者的Tenon囊组织,并用组织块培养法在含质量分数10％胎牛血清的DMEM中培养,培养的细胞贴壁后达到70％ ～ 80％亚融合状态时更换为无血清培养基饥饿培养24 h,然后分别加入质量浓度1、2、5、10、20 μg/L TGF-β2诱导HTFs 24 h,另用2μg/L或5μg/L TGF-β2诱导HTFs 6、24、48、72 h,阴性对照组培养基中不加TGF-β2.用Western blot法检测HTFs中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和pSmad2蛋白的表达,采用细胞免疫荧光技术检测α-SMA及纤维状肌动蛋白(F-actin)表达的定位,采用凝胶收缩实验检测培养细胞收缩力的变化.结果 不同质量浓度TGF-β2组HTFs中α-SMA表达的强度均明显强于阴性对照组,2μg/L、5μg/L TGF-β2作用24～48 h后HTFs中α-SMA表达强度达峰值,10 μg/L、20 μg/L TGF-β2组较2μg/L、5μg/L TGF-β2组α-SMA蛋白表达强度减弱.对照组HTFs中有少量α-SMA及F-actin表达,1、2、5μg/L TGF-β2组α-SMA及F-actin荧光表达明显增强,阳性细胞数明显增加,10 μg/L TGF-β2组α-SMA及F-actin荧光表达较低质量浓度组减弱.2μg/L TGF-β2作用后pSmad2表达强度明显强于PBS组和FBS组,在作用后30 min ～2 h表达较强,2h后开始出现下降.对照组HTFs收缩凝胶面积所占原面积的百分数为(78.00±3.13)％,1、2、5、10 μg/L TGF-β2组分别为(63.88±1.78)％、(20.69±0.65)％、(19.49±0.54)％、(16.24±0.84)％,HTFs收缩凝胶面积占原面积的百分数随着TGF-β2质量浓度的增加而明显增加(F组别=859.400,P=0.000).结论 TGF-β2可诱导成纤维细胞转分化,一定程度上其作用呈质量浓度依赖性和时间依赖性,且细胞收缩力随质量浓度的增加而增强,可能是青光眼滤过术后滤过通道建立失败的重要机制.     

丝裂素蛋白激活激酶信号途径介导水杨酸钠诱导的人晶状体上皮细胞中HSP27表达

背景热休克蛋白（HSPs）是生物体在各种应激情况下产生的高度保守蛋白,HSP27与人晶状体中α-晶状体蛋白在氨基酸和基因水平上高度同源,其结构和表达的异常与白内障的形成密切相关。此研究先前的研究证实水杨酸钠对H2O2造成的人品状体上皮细胞（LECs）损伤具有保护作用。目的探讨水杨酸钠诱导的人LECs中HSP27的表达及与丝裂素蛋白激活激酶（MAPK）信号途径的关系。方法人LECs—B3系在含质量分数15％胎牛血清的DMEM中进行培养,将不同浓度的水杨酸钠（0～55mmol／L）加入培养基中刺激人LECs不同时间,然后去除刺激再分别培养。在阻断实验中,分别给予P38MAPK、ERK1／2及JNK／SAPK信号通路特异性阻断剂SB20350（10μmol／L）、PD98059（20μmol／L）及SP600125（10μmol／L）预孵育细胞1h,在给予水杨酸钠刺激后检测相关指标,采用Westernblot法检测各种处理情况下人LECs中HSP27的表达,用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）法检测HSP27mRNA的表达;免疫组织化学法检测HSP27蛋白在人LECs中的表达。结果正常人LECs仅有微弱的HSP27表达,35～55mmol／L水杨酸钠刺激人LECs1h去除刺激再培养6h后可使HSP27表达显著增加,与正常对照组比较差异有统计学意义（F=509．953,P〈0．01）;55mmol／L水杨酸钠刺激人LECsI～5h不能诱导HSP27的表达（F=2．119,P〉0．05）,而去除刺激再分别培养6h后可诱导HSP27表达,差异有统计学意义（F：452．534,P〈0．01）;55mmol／L水杨酸钠刺激人LECs1h后去除刺激再培养3h后HSP27表达明显增加,6h达到高峰,直至24h恢复到基础水平,差异有统计学意义（F=419．234,P〈0．01）。水杨酸钠刺激30min时磷酸化p38MAPK表达增加,1h表达显著,各组总体差异有统计学意义（F=865．680,P〈0．01）;磷酸化ERK1／2在水杨酸钠刺激时间内未见升高;去除水杨酸钠刺激再培养1h后开始增加,6h达到高峰,各时间点总体差异有统计学意义（F=388．840,P〈0．01）;水杨酸钠刺激1h及去除刺激再培养过程中未见到磷酸化JNK的表达;加入P38MAPK、ERK1／2特异性阻断剂预处理人LECs1h后可使水杨酸钠诱导的HSP27表达受到显著抑制,加入JNK特异性阻断剂未见对水杨酸钠诱导的HSP27表达产生影响。结论水杨酸钠可诱导人LECs中HSP27的表达,P38MAPK和ERK1／2信号途径促进水杨酸钠诱导的HSP27在人LECs中的表达。     

tTG小干扰RNA对人晶状体上皮细胞转分化和细胞外基质沉积的抑制作用

目的探讨RNA干扰抑制组织型转谷氨酰胺酶(tissue transglutaminase,tTG)的表达对人转化生长因子β2(transforming growth factor-beta2,TGF-β2)诱导的晶状体上皮细胞(lens epithelial cells,LEC)转分化和细胞外基质沉积的抑制作用。方法设计并合成针对tTG的3对小干扰RNA(siRNA):tTG-siRNA-1、tTG-siRNA-2、tTG-siRNA-3,用Real-time PCR和Western blot检测转染了siR-NA后HLE-B3细胞表达tTG mRNA和tTG蛋白的变化。然后将体外培养的HLE-B3细胞分为正常对照组、TGF-β2组和TGF-β2+siRNA组。48h后,用Western blot检测各组tTG、平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、纤维连接蛋白(fibronec-tin,FN)和Ⅳ型胶原(collagenⅣ,Col-Ⅳ)的表达。结果转染tTG-siRNA-1、tTG-siRNA-2、tTG-siRNA-348h后,tTG mRNA的表达分别下降为空白对照组的46.60%、12.84%、66.75%(均为P<0.05);tTG蛋白的表达量分别下降为空白对照组的60.49%、27.87%、55.91%(均为P<0.01)。Real-time PCR与Western blot检测结果一致显示了tTG-siRNA-2对tTG基因的抑制效果最佳。与正常对照组相比,TGF-β2组中tTG、α-SMA、FN、Col-Ⅳ的表达量均明显增加(均为P<0.01);与TGF-β2组相比,TGF-β2+tTG-siRNA-2组中tTG、α-SMA、FN、Col-Ⅳ的表达量均明显减少(均为P<0.01)。结论靶向tTG的siRNA可以显著降低tTG的表达水平,同时可以明显抑制TGF-β2诱导的HLE-B3细胞合成α-SMA、FN、Col-Ⅳ。提示tTG是介导TGF-β2诱导人LEC转分化和细胞外基质沉积的重要分子。     

原代培养兔晶状体上皮细胞的环境和细胞状态的变化

目的:探讨体外原代培养的兔晶状体上皮细胞(lens epithelial cells,LEC)分泌活性转化生长因子β1(transforming growth factorβ1,TGF-β1)和异常表达α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的状况变化方法:体外原代培养兔眼LEC,当细胞接近融合时转板培养,观察细胞转板培养后1,6,12d的状态变化,并采用ELISA法检测各时项培养液上清中TGF-β1的水平,免疫细胞化学和计算机图像分析统计各时项细胞中α-SMA的表达水平。结果:转板培养12d的细胞活性TGF-β1的水平明显高于转板培养1和6d的水平(均P<0.05),同时转板培养12d的细胞表达α-SMA的水平分别明显高于转板培养1和6d的水平(P<0.05);而且α-SMA的表达量随着TGF-β1水平的升高而升高,两者高度正相关(r=0.995,P<0.01)。结论:原代培养的LEC活性TGF-β1逐渐增多,向表达有α-SMA的肌成纤维细胞转分化。     

ALK5抑制剂对转化生长因子-β1（TGF-β1）致视网膜色素上皮细胞纤维化的干预作用

目的　探讨转化生长因子-β1（transforming growth factor-beta1，TGF-β1）对人视网膜色素上皮（retinal pigment epithelial，RPE）细胞向成纤维细胞转化的影响，及活化素受体样激酶5（activated receptor kinase 5，ALK5）抑制剂（SB-431542）对这一影响的干预作用。方法　体外培养人RPE细胞，随机分为对照组、TGF-β1处理组、TGF-β1+SB-431542处理组、SB-431542处理组。对照组不做任何处理，其余三组分别用10 μg·L^-1 TGF-β1、10 μg·L^-1 TGF-β1+30 μmol·L^-1 SB-431542、30 μmol·L^-1 SB-431542处理细胞24 h。MTT法检测各组RPE细胞增殖率；划痕实验观察各组处理后0 h、12 h、24 h RPE细胞迁移情况；免疫荧光法检测各组细胞ALK5蛋白的分布和表达；Western blot法检测各组ALK5、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、Ⅰ型胶原（collagen typeⅠ，ColⅠ）以及纤维粘连素（fibronectin，FN）蛋白的表达。结果　与对照组相比，TGF-β1作用于RPE细胞24 h后，可改变RPE细胞表型，使其呈成纤维细胞样外观，并明显促进RPE细胞增殖和迁移。10.0 g·L^-1 TGF-β1作用24 h后RPE细胞增殖率为对照组的（1.33±0.08）倍，30 μmol·L^-1 SB-431542作用24 h后RPE细胞增殖率为10.0 g·L^-1 TGF-β1处理组的（67.77±6.78）%。经TGF-β1作用24 h后RPE细胞内ALK5、VEGF、α-SMA、ColⅠ及FN蛋白的表达显著上调，分别是对照组的（3.69±0.37）倍、（1.76±0.05）倍、（2.58±0.18）倍、（1.86±0.11）倍、（1.74±0.08）倍；SB-431542可逆转TGF-β1诱导的ALK5、VEGF、α-SMA、ColⅠ及FN蛋白表达上调，分别是TGF-β1处理组的（67.73±5.15）%、（71.71±3.50）%、（79.87±0.05）%、（63.59±3.16）%、（83.07±2.31）%，差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。结论　TGF-β1可促进RPE细胞增殖、迁移，向成纤维细胞转化，并能显著上调RPE细胞内ALK5、VEGF、α-SMA、ColⅠ及FN蛋白的表达；SB-431542可通过抑制TGF-β1的作用而抑制RPE细胞的纤维化。     

EGR1对晶状体上皮细胞炎症反应及EMT的早期调控作用

目的：探究早期生长反应基因1（EGR1）对小鼠白内障术后晶状体上皮细胞（LECs）炎症反应以及上 皮-间质转化（EMT）的早期调控作用。方法：实验研究。选取10～16周龄EGR1敲除小鼠（EGR1-/-） 和野生型小鼠（WT）行白内障手术造模，于造模后0 h，3 h，24 h，48 h，72 h，4 d和5 d处死相应小 鼠并取眼球做冰冻切片。免疫荧光染色观察晶状体囊袋中EGR1蛋白、CD11b、LCN2、CXCL1和 αSMA的表达情况，Image J定量荧光强度。EGR1-/-小鼠和WT小鼠组间比较采用配对t检验，组内不 同时间点比较采用单因素方差分析。结果：WT小鼠白内障术后LECs中EGR1蛋白表达上调、炎症 反应指标CD11b、LCN2、CXCL1表达升高。EGR1-/-小鼠白内障术后LECs中EGR1蛋白表达无变化， CD11b、LCN2、CXCL1表达量明显小于WT小鼠（均P<0.01）。此外，EGR1-/-小鼠白内障术后EMT特 征性标记物αSMA的表达量、囊袋内有形细胞数量亦明显小于WT小鼠（72 h、4 d和5 d，均P<0.05）。 结论：白内障手术可早期激活LECs中的EGR1，激活的EGR1参与调控LECs的炎症反应和EMT，敲 除EGR1可以减轻上述炎症反应和EMT。