PDGF对人RPE细胞中MMP-2、MMP-9和TIMP-1表达的影响

背景研究表明血小板源性生长因子（PDGF）能调节多种细胞中基质金属蛋白酶／基质金属蛋白酶组织抑制剂（MMP／TIMP）的表达和平衡,但视网膜色素上皮（RPE）细胞中MMP／TIMP的表达与PDGF作用剂量和作用时间的关系尚不明确。目的观察PDGF对RPE细胞中MIP-2、MMP-9和TIMP-1表达的影响。方法体外培养人RPE细胞系ARPE-19,将达到70％～80％融合的细胞分为5个组。分别将0、0．1、1、10、50mg／LPDGF加入RPE细胞培养基作用36h,分别采用逆转录PCR（RT—RCR）法和Western blot法检测各组RPE细胞中MMP-2、MMP-9和TIMP-1 mRNA及其蛋白的表达。PDGF组采用10mg／LPDGF组PDGF分别刺激RPE细胞24、36和48h,对照组用不含PDGF的培养液培养,采用逆转录PCR（RT—RCR法和Western blot法分别检测RPE细胞中MMP-2、MMP-9和TIMP-1 mRNA及蛋白的表达。结果随着PDGF质量浓度的增加和刺激时间的延长,RPE细胞生长速度加快,细胞增生明显。PDGF刺激RPE细胞36h,随着PDGF质量浓度的增加,MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA在RPE细胞中表达相对值逐渐增加,各组间差异均有统计学意义（MMP-2 mRNA：F=79．304,P=0．000;MMP-9 mRNA：F=8．465,P=0．003）,其中1、10、50mg／LPDGF组RPE细胞中MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA表达相对值明显高于0mg／L PDGF组,差异均有统计学意义（P〈0．05）。RPE细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达相对值随着PDGF质量浓度的增加而逐渐增加,各组间差异均有统计学意义（MMP-2：F=26．550,P=0．000;MMP-9：F=80．993,P=0．000）,其中1、10、50mg／LPDGF组RPE细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达相对值明显高于0mg／L PDGF组,差异均有统计学意义（P〈0．05）。各质量浓度PDGF组RPE细胞中TIMP-1 mRNA和蛋白表达相对值差异均无统计学意义（F=0．143,P=0．962;F=1．955,P=0．178）。随着10mg／L PDGF刺激RPE细胞时间的延长,RPE细胞中MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA表达逐渐增加,差异均有统计学意义（MMP-2 mRNA：F时间=83．250,P=0．002;MMP-9 mRNA：F时间=6．785,P=0．019）;各时间点RPE细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达相对值明显增加,差异均有统计学意义（MMP-2：F时间=11．185,P=0．041;MMP-9：F时间=968．413,P=0．000）。PDGF作用不同时间点对照组与PDGF组间MMP-2、MMP-9 mRNA及蛋白在RPE细胞中的表达差异均有统计学意义（分组：均P=0．000,时间点：P〈0．05）,而各时间点2个组间RPE细胞中TIMP-1表达相对值的差异均无统计学意义（P〉0．05）。结论PDGF上调PRE细胞中MMP-2和MMP-9的表达,其作用呈剂量和时间依赖性,但对PRE细胞中TIMP-1的表达无明显影响。PDGF导致RPE细胞中MMP／TIMP的平衡失调,从而导致细胞外基质的破坏,促进RPE细胞的迁移。     

MMPs激动剂和抑制剂对人巩膜成纤维细胞MMP-1／2以及I型胶原表达的作用研究

目的研究基质金属蛋白酶（MMPs）家族MMP-1、MMP-2激动剂和抑制剂对人巩膜I型胶原表达的作用,探讨MMP-1和MMP-2在人巩膜胶原代谢中的作用。方法应用人巩膜成纤维细胞系作为研究模型,用荧光定量检测MMPs激动剂醋酸氨基苯汞（APMA）及抑制剂对人巩膜成纤维细胞MMP-1和MMP-2活性的影响;实时荧光定量反转录聚合酶链反应以及免疫印迹蛋白定量法检测比较激动剂组与抑制剂组对MMP-1／2以及I型胶原mRNA和蛋白表达的变化;最后用siRNA干扰敲除MMP-1、MMP．2或MMP-1／2后,检测巩膜成纤维细胞I型胶原蛋白水平的变化。结果MMPs激动剂引起MMP．1／2活性显著增加,I型胶原mRNA和蛋白表达下降,MMPs抑制剂引起MMP．1／2活性显著下降,相应的I型胶原mRNA和蛋白表达增加（均P〈0．01）。激动剂可引起MMP．1mRNA表达增加（P〈0．01）,对MMP-2mRNA表达无明显影响（P〉0．05）,而抑制剂能引起MMP．2mRNA表达下降（P〈0．01）,但对MMP．1mRNA表达无显著影响（P〉0．05）。应用siRNA干扰方法敲除MMP-1、MMP-2或两者同时被敲除后,MMP-1蛋白表达均显著降低（均P〈0．01）,MMP-2除在MMP-1siRNA干扰敲除组无明显变化外（P〉0．05）,其余各组均显著下降（均P〈0．01）;I型胶原的表达在各敲除组中显著增加,当MMP-1和MMP．2均干扰敲除时,I型胶原的表达增加最为显著（均P〈0．01）。结论在人巩膜成纤维细胞系中,MMP-1／2激动剂和抑制剂均能引起MMP-1／2活性改变及相应的MMP-1／2蛋白表达变化,并最终导致I型胶原表达的变化;MMP．1和MMP-2是调控人巩膜I型胶原重塑的关键因子。     

白细胞介素-1α对猪小梁细胞基质金属蛋白酶／基质金属蛋白酶抑制剂表达的影响

背景房水外流通路的阻塞或小梁网细胞外基质（ECM）的异常堆积导致房水流畅系数降低是引起眼压升高的原因之一,基质金属蛋白酶（MMPs）和组织金属蛋白酶抑制剂（TIMPs）的平衡对ECM的代谢至关重要,白细胞介素-1α（IL-1α）可以通过调节MMPs的表达而调节房水的外流。目的研究猪重组IL-1α对体外培养的猪眼小梁细胞MMP-2、MMP-3及TIMP-1表达的影响。方法从猪眼取出带有小梁组织的巩膜,用组织块培养法培养小梁细胞并进行传代,第3代的猪小梁细胞应用纤维连接蛋白（FN）和层黏连蛋白（LM）进行鉴定。第3代小梁细胞血清饥饿培养24h后分为2组,对照组加入无血清培养基,IL组加入10m／L IL-1α,分别培养30min。采用细胞免疫化学法分析IL组MMP-2、MMP-3及TIMP-1蛋白在培养小梁细胞中的表达;采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）法检测小梁细胞中MMP-2mRNA、MMP-3mRNA及TIMP-1 mRNA的表达,并与对照组的检测结果进行比较。结果传3代的细胞对FN和LM呈现阳性反应。与对照组比较,IL组小梁细胞中MMP-3和TIMP-1蛋白的表达量（A值）明显升高,差异均有统计学意义（t=-7．694、t=-5．199,P〈0．05）,但2组间小梁细胞中MMP-2表达的差异无统计学意义（t=-2．365,P〉0．05）。IL组小梁细胞中MMP-3mRNA和TIMP-1mRNA的表达量（A值）明显高于对照组,差异均有统计学意义（t=-3．025、t=-1．921,P〈0．05）,而2组间小梁细胞中MMP-2mRNA的表达差异无统计学意义（t=-1．173,P〉0．05）。结论外源性IL-1α能增加猪眼小梁细胞中MMP-3、TIMP-1的表达,引起MMP-3／TIMP-1平衡改变,促进小梁网ECM的分解,增加房水外流,而对MMP-2的表达无影响。     

不同浓度重组Canstatin蛋白对碱烧伤后角膜MMP-2及TIMP-2表达的影响

目的：探讨不同浓度重组Canstatin蛋白对碱烧伤后小鼠角膜基质金属蛋白酶－2（ matrix metalloproteinase－2,MMP－2）及其组织抑制剂－2（ tissue inhibitor of metalloproteinase－2, TIMP－2）表达的影响及其调节作用。方法：BALB／c小鼠60只随机分为实验组A、实验B及对照组C,每组20只。采用1mol／L氢氧化钠溶液烧伤小鼠右眼角膜,建立炎症性角膜碱烧伤动物模型,分别予以A组、B 组重组 Canstatin 蛋白3μg／mL、5μg／mL 点右眼,4次／d,对照组C组予以生理眼水点右眼。在碱烧伤后第1、3、7、14d以形态学分析评价角膜上皮损伤面积及新生血管生长的情况,并于碱烧伤后第1、3、7、14 d 应用Western－blot检测角膜MMP－2和TIMP－2的表达,增强化学发光法（ ECL）对结果进行分析。结果：形态学分析显示,A组和B组小鼠在碱烧伤后第3d起各时间点角膜上皮缺损面积均小于对照组（P＜0．01）,角膜新生血管均得到抑制,CNV面积明显小于对照组（ P＜0．01）。 Western－blot结果显示,碱烧伤后各时间点MMP－2的表达,A组和B组均明显低于对照组（P＜0．01）,TIMP－2的表达高于对照组（P＜0．01）,且A组和B组间MMP－2的表达在第14d比较差异有统计学意义（P＜0．05）,TIMP－2的表达在第7d及第14d比较差异有统计学意义（P＜0．05）。结论：重组Canstatin蛋白可通过抑制角膜细胞及浸润的炎性细胞产生MMP－2,促进TIMP－2表达,从而抑制和延迟碱烧伤后角膜融解的发生和发展,对碱烧伤后角膜的重塑起着重要作用。     

NF-κB对人眼小梁细胞MMP-3及TIMP-1 mRNA表达的影响

目的研究NF-κB对人眼小梁细胞基质金属蛋白酶-3（matrix metalloproteinase-3，MMP-3）及组织金属蛋白酶抑制剂-1（tissue inhibitor of metalloproteihase-1，TIMP-1）mRNA表达的影响。方法采用原代培养的人眼小梁细胞，通过脂质体转染的方法，将P65表达质粒转染小梁细胞，24h后通过RT-PCR方法检测MMP-3及TIMP—1 mRNA的表达。结果P65转染后MMP-3 mRNA的表达明显增高，与正常对照组相比差异有显著性（P〈0．05），TIMP—1 mRNA的表达与正常对照组相比无明显改变（P〉0．05）。结论NF—κB的活化可激活MMP-3的表达，提示NF-κB信号通路参与了小梁网外引流通道的调控。     

增生性玻璃体视网膜病变增生膜中基质金属蛋白酶及其抑制剂的表达

目的研究增生性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreoretinopathy，PVR）增生膜中基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）及其抑制剂（tissue inhibitors of matrix metalloproteinases，TIMP）的表达。方法采用免疫组织化学技术的SP法，检测PVR增生膜和正常尸眼神经视网膜标本中MMP-2、MMP-9和TIMP-1的表达，光镜观察染色结果。结果41例PVR增生膜标本HE染色切片光镜下可见视网膜色素上皮（retinal pigment epithelial，RPE）细胞、神经胶质细胞、成纤维细胞、巨噬细胞等细胞成分，它们被大量细胞外基质所包绕。视网膜前膜中以RPE细胞为主要增生细胞，视网膜下膜中以神经胶质细胞为主要增生细胞。免疫组织化学染色结果显示：（1）25例PVR增生膜标本表达MMP-2，11例PVR增生膜标本表达MMP-9，14例PVR增生膜标本表达TIMP-1；（2）22例视网膜前膜标本表达MMP-2，3例视网膜下膜标本表达MMP-2，差异有显著性（P〈0．05）；（3）正常尸眼神经视网膜标本中未检测到MMP-2、MMP-9及TIMP-1的表达。结论细胞外基质与PVR增生膜的形成关系密切，MMP-2、MMP-9及TIMP-1在PVR形成过程中发挥重要作用，通过合理地调控MMP和TIMP的平衡，为预防和治疗PVR提供可能性理论依据。     

翼状胬肉细胞之间的相互作用

目的探讨翼状胬肉中血管内皮细胞和成纤维细胞之间的相互作用。方法收集翼状胬肉标本,采用血管内皮细胞和成纤维细胞单独培养、条件培养和共同培养的方法构建培养体系,采用ELISA和RT—PCR法检测3种体系培养上清液和细胞中血管内皮细胞生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）蛋白及mRNA含量的变化。结果单独培养、条件培养和共同培养各组培养上清液中VEGF和bFGF的质量浓度增加,差异均有统计学意义（P〈0．05）;细胞单独培养、条件培养和共同培养三者相比,VEGF和bFGF的mRNA表达升高,差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论内皮细胞和成纤维细胞有相互上调作用,2种细胞在翼状胬肉的发生发展过程中相互促进。     

NF-κB活性对TNF-α调节小梁细胞表达MMP-3和MMP-9的影响

目的探讨核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）是否参与肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）调节人眼小梁细胞（human trabecular cells，HTCs）表达基质金属蛋白酶-3（matrix metalloproteinases-3，MMP-3）和基质 金属蛋白酶-9（matrixmetalloproteinases-9，MMP-9）的过程。方法采用RT-PCR法和酶谱分析法（zymography）检测体外培养的人眼小梁细胞经0ng／ml（对照组）、lng／ml、10ng／ml、25ng/ml TNF-α处理24h后，细胞表达MMP-3、MMP-9的量；运用NF-κB的特异抑制剂二硫氨基甲酸吡啶（pyrrolidine dithocarba-mate，PDTC）抑制NF-κB的活化，观察TNF-α对体外培养的HTCsMMP-3，MMP-9表达影响的改变。结果运用RT-PCR法和酶谱分析法研究均发现经浓度为1ng／ml、10ng／ml、25ng／ml的TNF-α处理的细胞在mRNA和上清液中活性蛋白水平均能增加MMP-3、MMP-9的表达，各组mRNA／β-actin吸光度比值和条带酶解量与对照组相比差异均有显著性（P〈0．05）。提前30min加入PDTC，MMP-3、MMP-9的表达量分别较未加入PDTC组表达量明显减少．差异有显著性（P〈0．05）。结论TNF-α可上调MMP-3及MMP-9的表达。PDTC能够下调TNF-α对小梁细胞MMP-3及MMP-9的表达，因此推测NF-κB可能参与MMP-3和MMP-9转录的启动．     

美伐他汀对甲状腺相关眼病眶前脂肪细胞分化及炎症反应的抑制作用

背景脂肪增生和炎症反应是甲状腺相关眼病（TAO）活动期的两大主要病理过程,美伐他汀被证明有抑制前脂肪细胞分化的作用。目的观察美伐他汀对TAO来源眼眶前脂肪细胞分化的作用,及对环氧合酶-2（COX-2）与过氧化物酶体增生物激活受体-γ（PPAR-γ）表达的影响,探讨其对脂多糖（LPS）诱导炎症反应及TAO眼眶前脂肪细胞分化的调控作用。方法从4例TAO患者眼眶减压术中获取眼眶球后脂肪组织,用组织块培养法体外培养TAO眼眶成纤维细胞,为观察美伐他汀对TAO炎症反应过程中COX-2的作用,将培养细胞分为5个组,A组用1000μg／L的LPS,B、C、D组采用1000μg／LLPS分别联合5、10、20μmol／L美伐他汀,E组不加任何干预药物作为对照,均作用8h。观察美伐他汀对眶脂肪细胞分化后的作用,将A组再亚分为A1-A6组,1000μg／LLPS作用8h后,加入诱导液诱导各组细胞向脂肪细胞分化,A,组不加任何干预药物,A2、A3、A4组分别在分化全程中加入5、10、20μmol／L美伐他汀,A5、A6组分别在分化的第4天与第8天加入10μmol／L美伐他汀直至分化结束。采用油红O染色法测定分化后脂肪细胞的相对含量,应用Western blot法和逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测成纤维细胞中COX-2和PPAR—v蛋白及其mRNA的表达,用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞培养上清液中前列腺素E2（PGE,）的表达。结果B、C、D组眶成纤维细胞中COX-2蛋白及其mRNA的表达和PGE,的分泌水平均较A组明显降低（P〈0．05）。随着美伐他汀浓度的升高,COX-2蛋白及其mRNA的表达和PGE2的分泌水平均逐渐降低,各组间总体差异均有统计学意义（F=228．380、101．745、1586．881,P〈0．05）。E组COX-2蛋白及其mRNA的表达和PGE,的分泌水平较A、B、C组明显减弱,差异均有统计学意义（P〈0．05）,但与D组比较差异无统计学意义（P〉0．05）。A1、A2、A3、A4组前脂肪细胞分化后吸光度（A492）值逐渐下降,分化后的细胞PPAR-γ蛋白及其mRNA表达均依次下降,组间两两比较差异均有统计学意义（P〈0．05）;A1与A6组间的A492值、PPAR-1蛋白及其mRNA的表达差异均无统计学意义（P〉0．05）;A1、A5、A3组的A492值及PPAR-γ蛋白及其mRNA表达均依次下降,组间比较差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论美伐他汀以剂量依赖的方式抑制LPS激活的TAO眼眶成纤维细胞中COX-2表达、TAO眼眶前脂肪细胞的分化、PPAR-γ的表达和PGE2的分泌,前脂肪细胞分化的早期抑制作用更强。     

白细胞介素-1β对人眼小梁细胞基质金属蛋白酶-3表达的影响

目的观察自细胞介素-1β（IL-1β）对体外培养的人眼小梁细胞基质金属蛋白酶-3（matrix metalloproteinases 3，MMP-3）表达的影响。方法采用组织块培养法对人眼小梁细胞（human trabecular ceils，HTCs）进行体外原代及传代培养，取传3代小梁细胞分别加入含有IL-1β终浓度为0ng／ml（对照组）、5、10、25、50ng／ml的无血清培养液，24h后采用RT-PCR法及ELISA法检测MMP-3量的变化。结果RT-PCR法检测IL-1β终浓度为5、10、25、50ng／ml实验组MMP-3／GAPDH的相对灰度比值分别为0．3437±0．0764、0．8588±0．0443、1．0079±0．0347、1．3466±0．0309，均高于对照组的相对灰度比值0．1037±0．0494，且各实验组与对照组相比差异有统计学意义（P〈0．05）；ELISA法检测IL-1β终浓度为5、10、25、50ng／ml实验组的MMP-33浓度值分别为（2．0325±0．2456）ng／ml、（2．4607±0．350）ng／ml、（2．8532±0．1392）ng／ml、（3．5858±0．1141）ng／ml，均高于对照组的浓度值（1．2437±0．3910）ng／ml，且各实验组与对照组相比差异有统计学意义（P〈0．05）。结论IL-1β在一定范围内促进MMP-3的表达，并且呈现一定的剂量依赖性，推测IL-1β可以通过促进MMP-3的表达来减少小梁网组织细胞外基质（ECM）的堆积，使房水引流通畅，降低眼内压。     

复方血栓通对猴脉络膜一视网膜内皮细胞增生、移行和管腔形成的作用

目的探讨复方血栓通干预猴脉络膜．视网膜内皮细胞（Rr／6A）参与血管生成的作用及机理。方法实验研究。本研究分为四部分：①取对数生长期RF／6A细胞进行培养,设立空白对照组、阳性对照组以及不同浓度的复方血栓通观察组．每组均加入终浓度为10ng／ml的血管内皮生长因子（VEGF）．阳性对照组加入终浓度0．20mg／ml的硫酸鱼精蛋白,复方血栓通观察组设立0．39～50．00mg／ml的多个不同浓度组。培养24h后采用酶联免疫检测仪测定各组吸光度4值,观察不同浓度的复方血栓通对VEGF诱导的RF／6A细胞增殖的影响。②设立空白对照组和终浓度为3．13、6．25、12．50mg／ml的复方血栓通组,培养24h后检测不同浓度复方血栓通对RF／6A细胞移行的影响。⑧设立空白对照组和终浓度为0．39、0．78、1．56mg／ml的复方血栓通组,培养12h后检测不同浓度的复方血栓通对RF／6A细胞管腔形成的影响;④设立空白对照组、终浓度为0．20mg／ml的硫酸鱼精蛋白阳性对照组和终浓度为1．56、3．13、6．25mg／ml的复方血栓通组,培养24h后,运用Western Blot和实时定量逆转录聚合酶链反应（RT．PCR）的方法,分别检测不同浓度的复方血栓通对RF／6A细胞表达VEGF、基质金属蛋白酶2（MMP．2）蛋白和mRNA的影响。对多组计量资料进行单因素方差分析。结果①各组间4值差异有统计学意义（F=158．669,P〈0．01）,同空白对照组比较,0．78～25．00mg／ml浓度的复方血栓通对VEGF诱导的RF／6A细胞增殖具有明显抑制作用（尸均〈0．011;②复方血栓通浓度为0、3．13、6．25和12．50mg／ml时,RF／6A细胞移行数分别为123．3±13．8、114．3±15．5、54．0±6．1和40．3±10．1,组间差异有统计学意义（B36．918,P〈0．01）;与空白对照组比较,6．25和12．50mg／ml浓度的复方血栓通对RF／6A细胞移行具有明显的抑制作用（P均〈0．01）;③复方血栓通浓度为0、0．39、0．78和1．56mg／ml时RF／6A细胞内皮管腔形成数分别为20．3±2．5、12．7±2．1、9．7±1．2和0．7±0．6,组间差异有统计学意义（F=64．324,P〈0．01）;与空白对照组比较,0．39、0．78和1．56mg／mA浓度的复方血栓通对RF／6A细胞内皮管腔形成均具有明显的抑制作用（P均〈0．01）,且抑制作用随浓度增加而增强;④空白对照组、阳性对照组以及1．56、3．13和6．25mg／ml浓度的复方血栓通组VEGF和MMP．2蛋白相对含量组间差异均有统计学意义（F=343．346、1670．505,P均〈0．01）;与空白对照组比较,其余各组均具有显著抑制RF／6A细胞VEGF和MMP-2蛋白表达的作用（P均〈0.01）,复方血栓通的抑制作用随浓度增加而增强;各组VEGF和MMP-2mRNA相对含量的差异也有统计学意义（F=228．130,208．579,P均〈0．01）,与空白对照组比较,其余各组均具有显著抑制RF／6A细胞VEGFmRNA表达的作用（P均〈0．01）,复方血栓通的抑制作用随浓度增加而增强。结论复方血栓通可能通过抑制RF／6A细胞增殖、移行以及管腔形成来抑制其参与新生血管生成．其机理可能与抑制RF／6A细胞VEGF、MMP-2的表达有关。     

转化生长因子-β2对实验性近视眼后极部巩膜成纤维细胞力学特性的影响

背景以往对近视眼巩膜力学特性变化的研究局限于其巩膜整体和条带的力学特性变化方面,目前对近视眼细胞水平力学特性的研究日益受到重视。目的明确TGF-β2对豚鼠镜片诱导型近视眼后极部巩膜成纤维细胞力学特性的影响。方法2周龄豚鼠12只,随机选取一侧眼用镜片诱导方法制备近视动物模型,对侧眼为对照。造模30d后,用组织块培养法培养豚鼠后极部巩膜成纤维细胞并传2代,采用免疫组织化学法以兔抗鼠波形蛋白、结蛋白、角蛋白、S-100抗体进行细胞鉴定。将不同质量浓度的TGF-β2（分别为0、1、10、100mg／L）加入无血清DMEM中作用24h,利用细胞微管吸吮的方法测定各组巩膜成纤维细胞的力学特性。结果模型眼0mg／LTGF—p：组与对照眼0mg／LTGF—p：组比较,模型眼的巩膜成纤维细胞的平衡杨氏模量、黏弹性参数明显升高,二者之间差异有统计学意义（P〈0．05）。模型眼与对照眼在TGF-β2作用下,0mg／L组与1mg／L组、10mg／组比较,细胞的平衡杨氏模量、黏弹性参数差异均有统计学意义（P〈0．05）。模型眼和对照眼培养细胞的平衡杨氏模量、黏弹性参数与TGF-β2的质量浓度均呈正相关（r=0．743、r=0．533;r=0．654、r=0．576）,模型眼和对照眼中的0mg／L组与100mg／L组比较细胞的平衡杨氏模量、黏弹性参数差异均无统计学意义（P〉0．05）,模型眼1mg／L组、10mg／L组与对照眼1mg／L组、10mg／L组比较,巩膜成纤维细胞的平衡杨氏模量、黏弹性参数之间差异有统计学意义（P〈0．05）;模型眼组100mg／LTGF-β2与对照眼的100mg／LTGF-β2组比较,巩膜成纤维细胞的平衡杨氏模量、黏弹性参数差异无统计学意义（P〉0．05）。结论随着TGF—B,质量浓度的增加,近视眼巩膜成纤维细胞的平衡杨氏模量、黏弹性参数值明显升高,1mg／L和10mg／LTGF-β2可以降低正常巩膜成纤维细胞的平衡杨氏模量及黏弹性参数,导致细胞力学特性的更大变化。     

肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β在结膜松弛症发病中的炎性机制及意义

背景 结膜松弛症(CCh)是年龄相关性眼表疾病,研究发现CCh患者结膜组织及泪液中炎性细胞因子表达升高,推测炎性细胞因子可能参与CCh的发病,但其作用机制尚未完全阐明.研究还发现CCh患者结膜组织中基质金属蛋白酶(MMPs)的表达上调,而炎性因子与MMPs在CCh发病中是否有关联尚不清楚. 目的 探讨肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素1β(IL-1β)对CCh患者结膜成纤维细胞中MMP-1、MMP-3及TNF-α刺激产生的肿瘤坏死因子刺激基因6(TSG-6)和穿透素3(PTX3)表达的影响.方法 采用组织块培养法分别对CCh和白内障患者手术中采集的结膜组织进行培养,将培养的2种结膜成纤维组织各分为3个组,分别用含20 ng/ml的PBS、TNF-α或IL-1β的细胞全培养基培养细胞4h,分别采用实时荧光定量PCR法和Western blot法检测细胞中MMP-1、MMP-3、TSG-6和PTX3 mRNA及其蛋白的表达.结果 倒置显微镜下可见第2代细胞的形态和大小一致,为长梭形,呈放射状排列,细胞核呈卵圆形,细胞突起相互交联.CCh组和白内障组间用PBS、TNF-α和IL-1β干预后细胞中MMP-1、MMP-3、TSG-6和PTX3 mRNA相对表达量的总体比较差异均有统计学意义(MMP-1 mRNA:F分组=2.611,P=0.116;F干预=161.564,P=0.000;MMP-3mRNA:F分组=5.201,P=0.029;F干预=211.021,P=0.000;TSG-6 mRNA:F分组=47.209,P=0.000;F干预=119.340,P=0.000;PTX3 mRNA:F分组=40.512,P=0.000;F干预=93.935,P=0.000).与白内障组PBS干预后比较,CCh组PBS干预后MMP-1、MMP-3、TSG-6和PTX3 mRNA的相对表达量均明显升高,差异均有统计学意义(均P＜0.05);与CCh组PBS干预后比较,CCh组TNF-α和IL-1β干预后细胞中MMP-1、MMP-3、TSG-6和PTX3 mRNA的相对表达量明显升高,差异均有统计学意义(均P＜0.05);与白内障组PBS干预后比较,白内障组TNF-α和IL-1β干预后细胞中MMP-1、MMP-3、TSG-6和PTX3 mRNA相对表达量明显增高,差异均有统计学意义(均P＜0.05).CCh组和白内障组间用PBS、TNF-α和IL-1β干预后细胞中MMP-1、MMP-3、TSG-6和PTX3蛋白相对表达量的总体比较差异均有统计学意义(MMP-1:F分组=84.702,P=0.000;F干预=48.900,P=0.000;MMP-3:F分组=112.818,P=0.000;F干预=194.980,P=0.000;TSG-6:F分组=56.867,P=0.000;F干预=70.356,P=0.000;PTX3:F分组=1.488,P=0.231;F干预=89.872,P=0.000).各组细胞用PBS、TNF-α和IL-1β干预后MMP-1、MMP-3、TSG-6和PTX3蛋白相对表达量的组间比较与其基因表达趋势一致. 结论 CCh患者结膜成纤维细胞中MMP-1、MMP-3、TSG-6和PTX3的表达量增加;TNF-α和IL-1β均可上调CCh结膜成纤维细胞中MMP-1、MMP-3、TSG-6和PTX3的表达.     

染料木黄酮对翼状胬肉成纤维细胞增殖的抑制作用

目的 观察染料木黄酮对体外培养的翼状胬肉成纤维细胞（HPF）的抗增殖作用。方法取HPF的第3或4代进行实验；采用免疫组织化学技术检测HPF增殖细胞核抗原的表达；MTT法检测染料木黄酮对HPF增殖的抑制影响。结果当染料木黄酮的质量浓度≥3．125μg／ml时能有效地抑制细胞表达增殖细胞核抗原。MTT试验证实，作用24h，染料木黄酮质量浓度〈12．5μg／ml，抑制率与对照组比较差异无显著统计学意义（P〉0．05），作用48h之后所有用药组抑制率与对照组比较差异均有显著统计学意义（P〈0．05），且与对照组比较生长曲线显著下移。结论染料木黄酮在质量浓度≥6．25μg／ml时可显著抑制体外培养的人HPF的增殖，且与质量浓度呈一定的量效关系。     

羊膜对角膜成纤维细胞CTGF表达及凋亡的影响

目的观察羊膜对在其基质面生长的角膜成纤维细胞结缔组织生长因子（CTGF）表达以及凋亡的影响。方法将传代的家兔角膜成纤维细胞接种于羊膜基质面，培养5d后，用RT-PCR检测角膜成纤维细胞CTGF mRNA表达的变化；用流式细胞仪观察羊膜对IL-1诱导的角膜成纤维细胞凋亡的影响。结果在羊膜基质面培养的角膜成纤维细胞，其CTGF／GAPDH像素比值较对照组低，与对照组比较有明显统计学差异（P〈0．05）；羊膜能降低IL-1诱导的角膜成纤维细胞凋亡率，与对照组比较有明显统计学差异（P〈0．01）。结论羊膜不仅抑制体外培养的角膜成纤维细胞CTGF mRNA的表达，而且能抑制角膜成纤维细胞的凋亡，可能部分解释羊膜减轻角膜基质损伤修复反应和抗眼表瘢痕形成的机制。     

人转化生长因子β诱导基因真核表达载体的构建及其对人角膜上皮细胞增生的影响

背景人转化生长因子-β诱导（TGFBI）基因是第一个被确定的角膜营养不良的致病基因,而TGFBI引起角膜营养不良的机制目前尚不清楚,研究TGFBI的功能对于揭示角膜营养不良的发病机制及了解角膜生理及病理功能都具有重要意义。目的构建人TGFBI基因的真核表达载体并将其转染于人角膜上皮细胞,探讨其对角膜上皮细胞增生及相关基因表达的影响。方法从角膜移植后剩余的供体角膜中提取人正常角膜组织总RNA,经逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）合成TGFBI cDNA,将TGFBI胶回收产物与载体pCMV—N-HA分别进行双酶切,取连接产物10μl转化100μl大肠杆菌感受态DH5α克隆入真核表达载体pCMV—N—HA,以菌落PCR和EcoRV、XhoI双酶切法测序鉴定。设置重组质粒pCMV—N—HA—TGFBI转染组、空质粒pCMV—N—HA转染组、阴性对照组及pGFP—C2转染对照组,以测定重组质粒转染率。重组质粒pCMV-N—HA—TGFBI转染人角膜上皮细胞,激光共焦显微镜下观察转染pGFP—C2后增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的表达,用细胞计数试剂盒8（CCK-8法）检测转染细胞的增生情况,SYBR荧光实时定量PCR和Western blot法检测TGFBI、基质金属蛋白酶（MMPs）、组织金属蛋白酶抑制剂（TIMP）蛋白及其mRNA在转染后角膜上皮细胞的表达。结果pCMV—N-HA—TGFBI阳性克隆质粒进行经EcoRV和XhoI双酶切鉴定测序结果显示,扩增的TGFBI cDNA以正确序列和方式插入载体,pGFP—C2载体转染人角膜上皮细胞后48h共焦显微镜下可见EGFP的表达,转染效率为70％。重组质粒pCMV—N—HA-TGFBI转染组TGFBI mRNA的表达明显高于空质粒pCMV—N—HA转染组和阴性对照组,TGFBI蛋白仅在pCMV—N-HA．TGFBI转染组表达。CCK-8法显示重组质粒pCMV—N-HA-TGFBI转染组、空质粒pCMV—N—HA转染组和阴性对照组间角膜上皮的吸光度（A450）值的差异无统计学意义（F=3．34,P〉0．05）。荧光实时定量PCR结果显示,重组质粒pCMV-N—HA-TGFBI转染组中MMP,mRNA、MMP,mRNA转录水平比空质粒pCMV—N—HA转染组和阴性对照组均升高（P〈0．05）,而TIMP,mRNA则明显下降（P〈0．05）;Western blot结果证实MMP1、MMP3、TIMP1蛋白表达规律相同（P〈0．05）。结论人TGFBI基因真核表达载体可被成功构建并在人角膜上皮细胞中呈过表达。TGFBI可能是通过MMP1、MMP3及TIMP1的表达变化来增加细胞外基质的降解,从而参与角膜的某些生理病理过程。     

胰高血糖素对豚鼠巩膜成纤维细胞增生的影响及其机制

背景胰高血糖素与近视的发生密切相关，在一定浓度范围内可抑制近视的发展，但其确切的作用机制尚不明确。目的研究胰高血糖素对豚鼠巩膜成纤维细胞（GSFCs）生长的影响及作用机制。方法获取出生15d的健康纯种豚鼠的巩膜组织，采用组织块培养法进行GSFCs的培养和传代，采用免疫组织化学法检测培养的细胞中波形蛋白抗体、细胞角蛋白抗体及S-100抗体的表达。用完全随机法将培养的细胞分组，分别在不同组的培养孔中加入5、10、50、100、200μg／L胰高血糖素培养GSFCs24h，不加胰高血糖素培养的为对照组。利用MTT比色法观察各质量浓度胰高血糖素作用后及50btg／L胰高血糖素作用1、2、3、5、7dGSFCs的生长情况，酶联免疫检测仪测量波长490nm处各孔细胞的吸光度（A490）值，并用ELISA法检测培养72h不同质量浓度胰高血糖素对GSFCs中基质金属蛋白酶2／组织金属蛋白酶抑制剂2（MMP-2／TIMP-2）表达水平的影响，以酶标仪测定450nm波长处各孔细胞的A450值。结果GSFCs传代培养后密度较低时呈枝状排列，密度较高时呈束状或漩涡状排列，波形蛋白抗体反应阳性。随着胰高血糖素质量浓度的增加，细胞的A490值逐渐升高，差异有统计学意义（F=32．340，P=0．013），胰高血糖素质量浓度〉10μg／L时，细胞的A490值较对照组明显升高，差异均有统计学意义（t=5．575、6．627、16．074、12．003，P〈0．05）。培养孔中加入50μg／L胰高血糖素后随着培养时间的延长，细胞的A450值升高，差异有统计学意义（F时间=10．610，P=0．024），且与对照组比较细胞的A490值升高，差异有统计学意义（F。=9．068，P=0．039）。胰高血糖素质量浓度在5～200μg／L时，随胰高血糖素质量浓度的增加，MMP-2含量逐渐减少，差异有统计学意义（F=153．639，P=0．036），但TIMP-2含量的变化差异无统计学意义（F=24．770，P=3．250）。结论胰高血糖素可促进体外培养的GSFCs的增生，其作用呈剂量和时间依赖性，其作用机制可能是下调MMP-2在GSFCs中的表达，MMP-2／TIMP-2失衡所致。     

汉防己甲素对翼状胬肉成纤维细胞抑制作用的实验研究

目的观察汉防己甲素对体外培养的翼状胬肉成纤维细胞的抑制作用，寻找治疗翼状胬肉和预防其复发的有效药物。方法用MTT比色法测定不同浓度的汉防己甲素对体外培养的翼状胬肉成纤维细胞增生的抑制作用，并与丝裂霉素C（MMC）进行比较；用荧光定量PCR检测10^-5mol／L的汉防己甲素对翼状胬肉成纤维细胞基质金属蛋白酶（MMP）MMP-3 mRNA的表达的影响。结果不同浓度的汉防己甲素对体外培养的翼状胬肉成纤维细胞的增生均有明显的抑制作用（P〈0．01）；10^-5mol／L的汉防己甲素作用24h其MMP-3 mRNA的表达量下降了27．12％。结论汉防己甲素对翼状胬肉成纤维细胞具有明显的抑制作用，可望用于对翼状胬肉的治疗。     

豚鼠形觉剥夺早期后极部巩膜基质金属蛋白酶2及其抑制剂动态表达

目的探讨豚鼠形觉剥夺性近视（form-deprivation myopia, FDM ）早期后极部巩膜基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2, MMP-2）及基质金属蛋白酶抑制剂2（tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-2,TIMP-2）mRNA的表达。方法4周龄三色豚鼠50只,随机分成实验组和正常对照组各25只,实验组又随机分为5组,单眼形觉剥夺（monocular deprivation, MD）右眼1、4、7、14、21d制备FDM动物模型,未遮盖眼为自身对照组。各组豚鼠进行检影验光和A超测量眼轴长度。提取后极部巩膜总RNA,二步法逆转录聚合酶链反应检测各组后极部巩膜MMP-2及TIMP-2mRNA的表达水平。结果除1d外,各组MD后极部巩膜MMP-2mRNA的表达与正常对照组、自身对照组差异均有统计学意义（P〈0,05）,MD组间差异也有统计学意义（P〈0．01）;而TIMP-2mRNA的表达则逐渐下降。各自身对照组MMP-2、TIMP-2mRNA的表达与MD组变化趋势大致相同。结论MMP-2／TIMP-2之间动态平衡失调可能是启动豚鼠FDM巩膜细胞外基质早期主动重塑的重要因素。（中国跟耳鼻喉科杂志,2010,10：75—78）     

整合素β1、MMP2、MMP9与脉络膜黑色素瘤侵袭转移的关系之探讨

目的 探讨整合素β1（CD29）、MMP2、MMP9在脉络膜黑色素瘤（CM）局部侵袭转移中的作用。方法 流式细胞术、免疫组织化学、原位杂交方法检测CM标本中CD29、MMP2、MMP9的表达，统计学分析其与侵犯巩膜导管间的关系。结果 （1）CD29在CM中高表达（P〈0．05），随恶性程度的增加其表达增强（P〈0．01），巩膜导管受侵犯时表达明显增强（P〈0．05）。（2）MMP2免疫组织化学和原位杂交阳性表达率分别为58．3％、52．8％，MMP9分别为66．7％、55．6％。经统计学分析，MMP2、MMP9在巩膜导管受侵犯时表达增高（P〈0．05）。结论 整合素β1、MMP2、MMP9与CM细胞的侵袭转移密切相关。