JAB1对缺氧环境肺癌A549细胞化疗敏感性调控的研究

目的观察导入pcDNA3.1-HRE-JAB1真核表达质粒的肺癌A549细胞,在低氧环境下对健择(Gemzar)的化疗敏感性,以期找到一种提高肺癌化疗敏感性的方法。方法首先构建缺氧反应元件启动的pcDNA3.1-HRE-JAB1真核表达质粒,鉴定后将该质粒导入肺癌A549细胞。在低氧环境培养过程中加入化疗药物Gemzar,观察空白组(A549)、空载体组(A549+pcD-NA3.1-HRE)和质粒组(A549+pcDNA3.1-HRE-JAB1)肺癌A549细胞对Gemzar的敏感性。采用Real-time PCR和Westernblot分别检测各组肺癌A549细胞中JAB1的mRNA和蛋白表达水平;流式细胞术检测各组肺癌A549细胞周期分布和凋亡情况。结果通过双酶切鉴定,确定构建获得了pcDNA3.1-HRE-JAB1质粒。在有化疗药物Gemzar的情况下,质粒组分别与空白组或空载体组比较,质粒组肺癌A549细胞中JAB1mRNA和蛋白表达水平明显增加(P<0.01),细胞凋亡率明显增加(P<0.01),而细胞周期被明显阻滞于G1期(P<0.01)。结论 JAB1在低氧环境下高表达提高了药物Gemzar化疗的敏感性,这将可能成为一种理想的提高肺癌或其他实体恶性肿瘤化疗敏感性的手段。     

RBM5 基因表达载体构建、稳定转染A549 细胞系的建立及功能的初步研究

目的：通过构建表达载体、建立稳定转染RNA结合基序5(RNA binding motif 5,RBM5)的A549细胞系, 初步研究RBM5基因过表达对A549 细胞增殖以及天冬-谷-丙-组氨酸盒多肽15[DEAH box polypeptide 15,DHX15]表 达的影响。方法：应用分段克隆法构建pcDNA3.1(+)/RBM5真核表达载体;将测序验证后的重组质粒pcDNA3.1(+)/ RBM5转染肺腺癌A549细胞并以G418进行筛选,采用Western印迹鉴定RBM5基因过表达阳性细胞,流式细胞仪分别 检测经pcDNA3.1(+)/RBM5稳定转染的A549细胞[pcDNA3.1(+)/RBM5-A549]及pcDNA3.1(+)空白质粒转染的A549细胞 [pcDNA3.1(+)-A549]的周期分布;运用RT-PCR技术分别检测pcDNA3.1(+)/RBM5-A549和pcDNA3.1(+)-A549细胞中剪 接相关因子DHX15的表达情况。结果：成功构建出pcDNA3.1(+)/RBM5真核表达载体,筛选出RBM5基因稳定转染过 表达阳性细胞株;pcDNA3.1(+)/RBM5-A549较pcDNA3.1(+)-A549细胞处于G1期细胞比例增大、S期细胞比例减小(均 P<0.01);cDNA3.1(+)/RBM5-A549较pcDNA3.1(+)-A549细胞的DHX15表达上调(P<0.01)。结论：成功构建重组质粒 pcDNA3.1(+)/RBM5,并建立了RBM5稳定转染的A549细胞系;初步证实RBM5基因过表达可抑制肺腺癌A549细胞的细 胞周期,并使DHX15表达上调。     

Inhibitory activity of nuclear factor-κB potentiates cisplatin-induced apoptosis in A549 cells

Whether inhibiting the activity of nuclear factor （NF）-κB potentiates cisplatin-induced apoptosis in non-small cell lung cell line A549 cells was investigated. The recombinant plasmid pcDNA3.1（＋）/IκBα expressing IκBα was constructed. The in vitro cultured A549 cells were transfected with pcDNA3.1 （＋）/IκBα alone, or pcDNA3.1（＋）/IκBα combined with cisplatin. The mitochondrial membrane potential （△ψm） was determined by rhodamine 123, the activity of caspase-3 was tested by colorimetric assay, and cell apoptosis was detected by flow cytometry with the annexin V/propidium iodide assay. The results showed that the activity of NF-κB in A549 cells was inhibited by transfecting pcDNA3.1（＋）/IκBα. Transfection of pcDNA3.1（＋）/IκBα alone did not promote apoptosis. Treatment of cisplatin alone had a little effect on cell apoptosis. Transfection of pcDNA3.1（＋）/IκBα combined with cisplatin treatment significantly induced apoptosis of A549 ceils. It was concluded that inhibiting the activity of NF-κB potentiated cisplatin-induced apoptosis of A549 cells.     

Effect of Antisense RNA Targeting Polo-like Kinase 1 on Cell Growth in A549 Lung Cancer Cells

In order to investigate the effect of Polo-like kinase-1 （Plk1） depletion on cell cycle progression and cell growth in lung cancer cells, a recombinant plasmid containing antisense RNA targeting Plk1 （pcDNA3-Plk1） was transfected into A549 cells by lipofectine. RT-PCR and Western-blot were used to detect the Plk1 gene expression. Cell proliferation was evaluated by direct cell counting and bromodeoxyuridine （BrdU） labeling. Cell cycle distribution and apoptosis were examined by flow cytometry, and the inhibition rate （IR） by vinorebline （NVB） was determined by MTF assay. The results showed that after transfection of pcDNA3-Plk1 into A549 cells, the expression levels of Plk1 mRNA and protein were greatly decreased. In pcDNA3-Plk1 transfected groups, abnormal morphological changes of cells and growth inhibition were observed, and the BrdU labeling index was significantly lower than in the control groups （P〈0.05）. Cells in pcDNA3-Plk1 transfected groups were arresed in G2/M phase and apoptosis was detectable 72 h post transfection. IR induced by vinorebline in pcDNA3-Plk1 transfected groups was significantly higher than in other groups. These data suggested that antisense RNA targeting Plk1 could suppress the Plk1 expression, and therefore, significantly inhibit cell proliferation and induce cell cycle arrest and apoptosis. Moreover, it sensitized lung cancer cells to chemotherapy.     

HIF-1对人宫颈癌SiHa细胞增殖和凋亡的影响

目的观察缺氧诱导因子1α(HIF-1α)在缺氧条件下对宫颈癌SiHa细胞的增殖、生长和凋亡的影响,探讨HIF-1α在宫颈癌的发展过程中所起的作用。方法将表达全长HIF-1α的重组质粒pcDNA3.1-full length HIF-1α和空质粒pcDNA3.1转染入SiHa细胞中,分别命名为fLHIF-1α组和pcDNA3.1组,未转染细胞组命名为未转染组。应用Western Blotting和免疫细胞化学法对细胞内的HIF-1α和VEGF表达量进行检测。应用MTT方法检测不同浓度的CoCl2处理后细胞的增殖情况;采用原位缺口末端标记(TUNEL)法检测细胞的凋亡情况。结果免疫细胞化学和Western Blotting结果显示重组质粒pcDNA3.1-full length HIF-1α转染成功,转染细胞内HIF-1α及VEGF表达较未转染细胞和质粒pcDNA3.1转染细胞增高(P<0.05),显示在正常或缺氧条件下,fLHIF-1α组细胞的增殖能力均高于pcDNA3.1组和未转染组(P<0.05),凋亡率小于pcDNA3.1组和未转染组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论HIF-1α在CoCl2诱导的缺氧条件下可以抑制SiHa细胞的凋亡,减少缺氧对细胞的损伤以及促进细胞的增殖,提示HIF-1α在宫颈癌的发生发展中可能起着重要作用。     

HSV-tk基因表达载体的构建及其对A549细胞的杀伤作用

目的构建自杀基因HSV-tk表达质粒,研究自杀基因疗法对人肺癌细胞的杀伤作用,探讨其治疗肺癌的可行性。方法PCR扩增tk基因带EcoRⅠ、XhoⅠ酶切位点,然后构成建到pcDNA3.0载体中成pcDNA3.0-tk;将pcDNA3.0-tk转染A549肺癌细胞,应用细胞生长曲线和MTT法测定前药GCV对A549细胞的杀伤作用。结果成功获得pcDNA3.0-tk克隆,RT-PCR、Western印迹法证明A549细胞转染pcDNA3.0-tk后可表达自杀基因,GCV能特异性地杀伤A549/tk细胞。结论HSV-tk基因表达质粒构建成功;HSV-tK/GCV系统对肺癌A549细胞有一定的杀伤作用。     

Construction of Eukaryotic Expression Vector of Human CC10 Gene and Expression of CC10 Protein in Lung Adenocarcinoma A549 Cell Line

Summary： A mammalian expression plasmid pcDNA3. 1-hCC10 was constructed and identified, then CC10 protein expression in A549 lung cancer cell line was detected. A 273 bp cDNA fragment was amplified from the total RNA of normal lung tissue by using RT-PCR and cloned into expression plasmid cDNA3. 1, and the recombinant plasmid was identified by employing double digestion restriction enzymes HindⅢ and BanH 1 and the cDNA sequence was assayed by the Sanger dideoxymediated chain termination method. The segment was then transfected into the A549 lung cancer cell line. The protein expression of CC10 was detected by immunofluorescence and Western blot. Our results showed that the cDNA fragment included the entire coding region （273 bp）. The re combinant eukaryotic cell expression vector of pcDNA3. 1-hCC10 was successfully constructed, and the sequence of the insert was identical to the published sequence. A549 cells line transfected with the pcDNA3. 1-hCC10 expressed high level of CC10 protein. The recombinant plasmid cDNA3. 1- hCC10 may serve as an effecnve tool for the study of tumorogenesis and tumor treatment.     

原蛋白转变酶2基因表达对肿瘤细胞增殖的影响

目的 探讨原蛋白转变酶2基因(proprotein convertase,PC2)对不同肿瘤细胞增殖的影响,为肿瘤治疗提供新的研究方向.方法 PC2重组质粒pcDNA3.1-PC2单独或与其分子伴侣7B2重组质粒pcDNA3.1-7B2混合转染小鼠乳腺癌细胞4T1、人肝癌细胞HepG2、小鼠黑色素瘤细胞B16、人肺癌细胞A549、人乳腺癌细胞MCF-7和小鼠肥大细胞瘤细胞P815,以pcDNA3.1(+)空载体为对照,通过PC2酶活性测定法、Western blot检测野生型和转染后的4T1细胞的PC2酶活性和表达,MTT法检测肿瘤细胞增殖率的变化.通过DAPI染色检测转基因细胞和TUNEL染色检测荷瘤模型瘤组织中癌细胞的凋亡情况.结果 1:1比例的PC2:7B2共转染显示了在4T1细胞中的最高PC2活性和表达,在荷瘤小鼠瘤组织中显示明显的凋亡现象.该共转染对4T1、HepG2、B16、A549和MCF-7细胞半数抑制剂量分别为128.3、97.8、137.3、51.5、214.3μg/mL,呈剂量依赖性,P815细胞的抑制率与基因剂量之间没有关系.结论 PC2上调可以抑制多种肿瘤细胞的增殖,呈现凋亡现象.     

dn HIF-1对宫颈癌细胞生物学行为的影响

目的研究抑制性缺氧诱导因子-1α(dn HIF-1α)对人宫颈癌SiHa细胞生物学行为的影响,探讨HIF-1α在SiHa细胞的血管生成、缺氧保护、凋亡、增殖过程中的作用。方法将表达dn HIF-1α的重组质粒pcDNA3.1-dn HIF-1α转染入SiHa细胞,采用免疫细胞化学法和Western Blotting检测dn HIF-1α转染SiHa细胞后其HIF-1α与血管内皮生长因子(VEGF)表达水平的变化;CoCl2化学缺氧法处理细胞,MTT法测定细胞增殖情况,原位缺口末端标记法检测细胞凋亡情况,同时与pcDNA3.1组和未转染组进行比较。结果重组质粒pcDNA3.1-dn HIF-1α转染SiHa细胞后,其HIF-1α蛋白表达水平与其它两组相比差异无统计学意义,而VEGF蛋白表达水平有较明显的降低(P<0.05)。转染dn HIF-1α的细胞,常氧培养和CoCl2诱导的化学缺氧条件下其增殖能力均低于其他两组(P<0.05),CoCl2处理后细胞凋亡增加,与其他两组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论dn HIF-1α抑制SiHa细胞的增殖并促进CoCl2化学缺氧引起的细胞凋亡,同时能降低VEGF蛋白的表达。提示dn HIF-1α可望在宫颈癌治疗中发挥作用。     

HIF-1α siRNA对非小细胞肺癌A549细胞TIMP1、MMP1表达的影响

目的 探讨HIF-1α基因沉默对非小细胞肺癌(NSCLC) A549细胞基质金属蛋白酶1(matrix metalloproteinase 1,MMP1)、基质金属蛋白酶抑制剂1(matrix metalloproteinase inhibitor,TIMP1)表达的影响。 方法 将siRNA-HIF-1α质粒载体稳定转染至A549细胞中,于缺氧环境下培养。应用MMT法和Transwell试验分别检测转染细胞的增殖、迁移和侵袭能力。应用qRT-PCR和蛋白免疫印迹分别检测转染细胞内TIMP1、MMP1 mRNA和蛋白表达水平。 结果 与Control组相比,A549组HIF-1α mRNA和蛋白表达显著增加(均P<0.05)。与Blank组和si-NC组相比,si-HIF-1α组HIF-1α mRNA表达水平显著降低(P<0.05)。与Blank组相比,si-HIF-1α组在转染24、48和72 h后细胞增殖率均显著降低(均P<0.05)。与Blank组相比,si-HIF-1α组A549细胞在转染24 h后的迁移和侵袭数量均显著降低(P<0.05)。与Blank组相比,si-HIF-1α组细胞内MMP1表达水平显著降低,而TIMP1表达水平显著增加(均P<0.05)。 结论 在缺氧状态下,HIF-1α siRNA靶向沉默HIF-1α在A549细胞内的表达,并可以通过下调MMP1表达和上调TIMP1的表达而抑制细胞的增殖、迁移和侵袭。      

KL1在人非小细胞肺癌A549细胞中的作用及其相关机制研究

目的:研究人非小细胞肺癌A549细胞中Klotho基因表达的KL1蛋白的相关功能及其机制?方法:分别用表达KL1蛋白和表达KL蛋白(Klotho基因表达的另一种同源蛋白)的质粒转染非小细胞肺癌细胞株A549后,通过Western blot验证转染结果;MTT法检测细胞的生长情况;平板细胞克隆形成实验检测细胞增殖活性;流式细胞术检测细胞凋亡;Western blot检测细胞转染后对碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)信号通路的中下游靶位点蛋白ERK1/2磷酸化水平的影响?结果:转染48 h后细胞显著表达外源性KL(P < 0.01)?KL1蛋白(P < 0.01)?KL1基因过表达后可以抑制A549细胞生长(P < 0.01);同时显著抑制细胞增殖(P < 0.01),促进细胞凋亡(P < 0.01);KL1过表达能够明显降低bFGF通路中ERK1/2的磷酸化水平(P < 0.01);过表达KL1与过表达KL比较,两者在影响细胞生长?增殖?凋亡和对bFGF信号通路的激活中并无明显统计学差异(P > 0.05)?结论:KL1与KL蛋白均能够抑制肿瘤细胞生长增殖,促进肿瘤细胞凋亡,作用效果相当?KL1能够抑制bFGF信号转导通路,可能是KL中发挥抑制肿瘤作用的主要功能片段?     

Effects of Hypoxia on Expression of P-gp and Mutltidrug Resistance Protein in Human Lung Adenocarcinoma A549 Cell Line

Chemotherapy is one of alternatives for trea-ting cancers , but a major obstacle in the develop-ment of effective cancer chemotherapy is MDRphenotype . Overexpression of P-gp and multidrugsresistance-associated protein ( MRP) are generallybelieved to be the mechanismresponsible for MDRof tumor cells . Hypoxia is a common feature ofmany malignant tumors . The physiology and bio-chemistry of tumor cells changes in hypoxia . Hy-poxia inducible factor 1α( HIF-1α) plays a pivotalrole inthe …     

YAP对非小细胞肺癌细胞增殖和迁移能力的影响

目的：探讨长链非编码RNA （lncRNA） MALAT1在YAP调控的非小细胞肺癌（NSCLC）细胞增殖和迁移中的作用,并阐明其作用机制。方法：选择A549和H1299细胞系分为Scramble siRNA组（转染Scramble siRNA）、siYAP-1组（转染siYAP-1）和siYAP-2组（转染siYAP-2）。RT-PCR和Western blotting法检测各组细胞中YAP和MALAT1mRNA及YAP蛋白表达水平;在A549和H1299细胞中分别转染pcDNA3.1-YAP质粒（pcDNA3.1-YAP组）、共转染pcDNA3.1-YAP质粒和siMALAT1-2（pcDNA3.1-YAP+siMALAT1-2组）及对照质粒（pcDNA3.1-YAP+Scramble siRNA组）,CCK-8法检测各组细胞增殖能力,细胞划痕实验检测各组细胞迁移能力。结果：siYAP-1组和siYAP-2组A549和H1299细胞中YAP mRNA及蛋白表达水平均明显低于Scramble siRNA组（P<0.05）,siYAP-1组和siYAP-2组A549和H1299细胞中MALAT1mRNA表达水平低于Scramble siRNA组（P<0.05）;与pcDNA3.1-YAP组比较,pcDNA3.1-YAP+siMALAT1-2组A549和H1299细胞增殖能力降低（P<0.05）,H1299细胞迁移能力降低（P<0.05）。结论：在NSCLC细胞中,YAP通过调控lncRNA MALAT1的表达促进细胞的增殖和迁移。     

人金属硫蛋白1H基因对肺腺癌细胞A549耐药性的影响

目的：探讨金属硫蛋白1H（metallothionein 1H,MT1H）基因对人肺腺癌A549细胞耐药性的影响．方法：构建真核表达载体pcDNA3．1（-）-MT1H,利用脂质体介导将其转染肺腺癌A549细胞,G418筛选阳性克隆．分别以RT—PCR和Western方法检测MTIH mRNA和蛋白表达情况,MTT法检测细胞对顺铂的药物敏感性;流式细胞仪（FCM）检测顺铂诱导细胞凋亡率．结果：转染pcDNA3．1（-）-MT1H的细胞,其MT1H mRNA和蛋白表达水平显著高于亲本细胞及转染空载体细胞,细胞对顺铂药物敏感性明显下降,顺铂诱导的凋亡率明显降低．结论：MT1H能促进A549细胞耐药,可能和降低顺铂诱导细胞凋亡有关．     

RNA干扰技术沉默MDR1基因逆转大肠癌耐药细胞株LoVo/5-Fu的耐药性

目的  探讨多药耐药（MDR1）基因沉默对大肠癌耐药细胞系LoVo/5-Fu耐药性的逆转作用。方法  构建靶向MDR1的短发夹RNA(EASY-shRNA-MDR1)干扰质粒转染LoVo/5 Fu,实时荧光定量PCR（Realtime-PCR）在mRNA水平检测抑制效果,噻唑蓝（MTT）法检测细胞对5-Fu的敏感性,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果  与未转染组相比,EASY-shRNA-MDR1组细胞MDR1mRNA表达明显下调（P<0.05）;细胞对5-Fu的IC50及RI显著降低（P<0.05）,敏感性的相对逆转率为74.7%;凋亡率明显升高(P<0.05)。结论  EASY-shRNA-MDR1可有效抑制大肠癌耐药细胞中MDR1的表达,进而降低了大肠癌耐药株对5-Fu的耐药性。     

An Antisense Plasmid Targeting Survivin Expression Induces Apoptosis and Sensitizes Hepatocarcinoma Cells to Chemotherapy

Regulationofapoptosis (programmedcelldeath)iscriticalfornormalembryonicdevelopmentandforhomeostasisinadulttissues[1] .Dysregulationofthisprocesswithincreasedresistancetocelldeathisacommonfeatureofmalignantcells[2 ] andrepresentsasignificantobstacletotherapyofhumancancer[3] .Theinhibitorofapoptosis (IAP) protein survivinisabsentfrommostadulttissuesbutnotableforitsex pressioninmosthumancancers.Survivinisastruc turallyuniquememberoftheinhibitorofapoptosisfamilyofproteinsthatispotentiallyinvolved…     

圆柱瘤基因（CYLD）的增强表达介入Fas/FasL途径诱导人肺癌细胞株A549/H460坏死的研究

目的探讨圆柱瘤基因（CYLD）在肺癌细胞株A549/H460的表达,及增强其表达对Fas/FasL途径诱导肺癌细胞死亡的影响,并探讨其可能的机制。方法选取5例肺腺癌手术患者癌组织标本作为实验组,自身癌旁正常组织作为对照组,进行CYLD基因实时荧光PCR定量分析;肺癌细胞株A549/H460分别进行CYLD基因增强质粒转染,同样采取实时荧光定量PCR及统计学检验对转染效果进行分析;转染前后的A549/H460细胞株FasL膜蛋白刺激进行培养24 h,通过流式细胞分析细胞死亡情况。结果 5例癌组织和癌旁正常组织均有CYLD表达,且差异有统计学意义（P〈0.05）,对照组为实验组的2.53倍;CYLD基因在A549细胞的表达较转染前高1.40倍,在H469细胞则比转染前高1.83倍;A549/H460细胞的坏死率较转染前增加,尤其是在提前加入zVAD-fmk后进行Fas信号诱导坏死率增加显著。结论肺癌细胞CYLD基因的表达较正常肺组织下调,有效增强肺癌细胞株A549/H460的CYLD基因表达后,FasL膜蛋白可通过Fas信号诱导其显著坏死。     

上调NDRG1基因表达对肺腺癌细胞增殖与凋亡的影响

［摘要］目的: 建立稳定转染N myc下游调节基因1（N-myc downstream regulated gene 1,NDRG1）的A549细胞株,探讨NDRG1对A549细胞增殖与凋亡的影响及其可能的分子机制。方法: 经脂质体介导将含有NDRG1的重组表达质粒转染人肺腺癌A549细胞株,采用G418筛选阳性细胞克隆并进行实时荧光定量PCR（qRT-PCR）、蛋白质印迹鉴定;qRT-PCR和蛋白质印迹检测阳性细胞克隆P21及鼠双微体基因2（murine doubleminute 2,MDM2）的表达;MTT比色法检测阳性细胞克隆的增殖活性;流式细胞仪检测阳性细胞克隆凋亡率。结果: 成功建立高表达NDRG1的阳性A549细胞克隆（N11）;N11细胞P21表达及细胞凋亡率显著增高（P<0.05）,而MDM2表达及细胞增殖显著降低（P<0.05）。结论: 上调A549细胞NDRG1表达后,细胞凋亡增加而细胞增殖降低,其作用机制可能与P21表达增高而MDM2表达降低有关。