川北地区胃癌特异性表达基因的克隆

目的：构建胃低分化腺癌组织cDNA消减文库,筛选胃癌特异表达基因。方法：取胃低分化腺癌组织和癌旁正常黏膜组织,提取总RNA,逆转录cDNA,进行SSH构建消减文库获得序列标签,与载体连接、克隆、筛选、测序及同源性检索。结果：以癌旁正常黏膜组织为driver、胃低分化腺癌组织为tester成功构建cDNA消减文库,测序结果与公共数据库中已知基因和人类EST比较,获得5个特异性序列标签（NBPF1、FAM48A、RXFP2、ACTB和QDPR）。结论：应用SSH法成功构建胃低分化腺癌组织cDNA消减文库,初步筛选胃癌部分表达基因,为寻找川北地区胃癌发生发展的特异性基因奠定基础。     

乳腺癌相关差异表达基因的筛选及分析

目的构建乳腺癌组织与癌旁正常乳腺组织差异表达的cDNA消减文库,筛选乳腺癌相关基因并进行分析。方法应用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术对15对乳腺癌组织及正常癌旁乳腺组织进行差异基因的消减,构建cDNA消减文库,并转化大肠杆菌进行文库扩增,采用数字表法随机挑选克隆经PCR鉴定后,对200个阳性克隆插入片段的序列进行测定及同源性分析。结果建立了乳腺癌差异表达片段cDNA消减文库;通过测序和同源性分析,得到173个差异表达基因,其中26个与肿瘤发生发展相关;26个基因中有15个已被文献明确报道在乳腺癌组织或细胞中有差异表达。结论应用SSH技术成功建立了乳腺癌差异表达基因cDNA消减文库,为乳腺癌的发病机制研究及寻找潜在的治疗靶点提供了有力的支持。     

SSH方法对食管癌相关差异基因cDNA文库的建立及初步分析

目的建立河北省磁县具有家族史的食管癌组织与食管正常黏膜组织差异表达的cDNA消减文库,并初步筛选过度表达的食管癌差异基因。方法应用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH)方法对10对食管癌组织及正常食管黏膜组织进行差异基因的消减、克隆、测序、鉴定。结果建立了食管癌差异表达片段cDNA消减文库;并进一步对初步筛选出的20个食管癌差异表达的基因进行测序和同源性分析,得出与肿瘤密切相关的基因10个,分别为锌指蛋白14、锌指蛋白66、肿瘤相关钙信号转运蛋白1,FMNL2基因、真核细胞转录延长因子1A1、肌小管相关蛋白6、Toll样受体10、次级淋巴趋化因子、细胞色素P450酶4F8、桥粒糖蛋白3。结论应用SSH技术成功建立食管癌差异表达基因cDNA消减文库,并获得10个在食管癌组织中过度表达的基因。     

抑制性消减杂交法构建甲状腺癌差异表达基因文库

目的：筛选并克隆在甲状腺癌组织与正常甲状腺组织之间差异表达的基因。方法：(1)应用抑制性消减杂交(SSH)进行基因差示表达分析,构建人甲状腺癌组织与正常甲状腺组织之间差异表达的cDNA消减文库;(2)克隆、鉴定甲状腺癌组织特异性高／低表达的基因;(3)登录Genbank,运用Blastn程序进行同源性分析。结果：成功构建了高消减效率的人甲状腺癌cDNA消减文库,对其中数个克隆的插入cDNA片段进行测序,经检索Genbank表明,正向SSH产物中有3个片段与来源于结肠上皮腺癌和Lung Epidermoid carcinoma的EST有100％同源性,提示它们来自恶性肿瘤相关基因。反向SSH产物中有5个片段为未知新序列,提示它们可能来自于在甲状腺癌中特异性低表达的新基因。结论：通过抑制性消减杂交技术,构建了人甲状腺癌cDNA消减文库,为下一步筛选鉴定甲状腺癌特异性基因及其全长克隆、功能研究等工作打下了基础。     

人胃印戒细胞癌组织cDNA消减文库的构建

目的 构建人胃印戒细胞癌组织cDNA消减文库。方法 采用抑制性消减杂交技术，以胃印戒细胞癌组织为检测子，正常胃黏膜组织为驱动子，分离胃印戒细胞癌组织特异性表达的基因片段，并与T载体连接，构建人胃印戒细胞癌组织cDNA消减文库。结果 成功构建高消减效率的人胃印戒细胞癌组织cDNA消减文库，获得200多个阳性克隆，随机挑取50个克隆鉴定均有长度为100～750bp插入片段。结论应用抑制性消减杂交技术构建人胃印戒细胞癌组织cDNA消减文库，为进一步筛选和克隆人胃印戒细胞癌组织特异性表达基因奠定基础。     

应用抑制消减杂交和斑点印迹杂交对膀胱癌差异表达基因的研究

目的：研究膀胱移行细胞癌和正常膀胱黏膜的差异表达基因。方法：应用抑制消减杂交技术(Suppression subtractive hybridization SSH)构建人膀胱移行细胞癌和正常粘膜差异表达的cDNA消减文库，进一步利用斑点印迹杂交(Dot blot)从中筛选出TCC差异表达的基因，随机选取部分克隆进行测序，结果在GenBank中作同源性对比分析。结果：成功构建了具有高消减效率的人TCC的cDNA消减文库，从文库的376个阳性克隆中随机选取100个克隆扩增、筛选后得到89条200～900bp的差异表达基因片段，测序后发现5条未知新基因片段和41种已知基因。结论：利用SSJ和Dot blot研究膀胱癌差异表达基因，为大批量筛选和克隆其差异表达的基因提供了行之有效的方法，也为研究基因功能和TCC的发生机制奠定了基础。     

应用显微切割-cDNA PCR-SSH法克隆胃癌前病变相关基因

目的 构建胃异型增生组织cDNA消减文库,初步筛选差异表达基因。方法 手工显微切割取胃异型增生和正常组织,应用cDNAPCR方法对少量组织全转录组扩增后进行双向抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH),消减后片段与载体连接、克隆、筛选、测序及同源性检索,并用斑点杂交方法验证检测结果。结果 正常和异型增生组织互为tester和driver成功构建了2个cDNA消减文库,分别代表在异型增生组织中表达上调和下调基因,测序的26个克隆中15个为已知基因,3个为已知EST,8个为新的EST,GenBank登录号为BQ164614-BQ164616,BQ291516-BQ291520,其中15个片段经证实在胃异型增生阶段有显著表达差异。结论 利用本室创建的显微切割-cDNA PCR-SSH法成功构建胃异型增生组织cDNA消减文库,初步筛选部分基因,为寻找胃癌发生相关基因提供重要线索。     

1个新的胰腺癌相关基因的筛选和初步鉴定

目的 筛选和鉴定胰腺癌相关基因.方法 提取胰腺癌和癌旁正常胰腺组织中的RNA和mRNA,应用抑制消减杂交技术(SSH)构建消减cDNA文库.采用随机数字表法挑选有插入片段的阳性克隆进行测序及同源性分析.应用RT-PCR和Northern blot检测新基因在12例胰腺癌和癌旁正常胰腺组织以及4种胰腺癌细胞株(PaTu8988、SW1990、BxPC-3、AsPC-1)中的表达情况.结果 随机挑取50个直径＞1 mm的白色克隆进行PCR扩增分析,其中47个克隆有插入片段,克隆阳性率为94%.对47个有插入片段的阳性克隆进行测序, 得到42个可用序列.同源性分析发现41个为已知基因,1个为无任何功能线索的未知基因,可能代表了新基因.RT-PCR显示新基因在12例胰腺癌组织和4种胰腺癌细胞株中均表达,而在正常胰腺组织中未见表达.Northern blot分析得到相同的结果.结论 应用SSH技术成功构建了人胰腺癌抑制消减cDNA文库,并筛选出1条新的胰腺癌相关基因.新基因与胰腺癌的发生、发展密切相关,可作为胰腺癌诊断和基因治疗的分子靶标.     

肾癌差异表达基因克隆的研究

目的 克隆并鉴定肾癌与正常肾之间差异表达的基因。方法 应用抑制性消减杂交技术构建人肾癌组织与正常肾组织差异表达的cDNA消减文库,并从中克隆鉴定出肾癌差异表达的基因。结果 构建成功了高消减效率的人肾癌cDNA消减文库,对其中5个克隆插入的cDNA片段进行测序后经Genbank检索表明,5个片段均为未知新序列,其中GYIZ-RCC18为3个拷贝,提示以上5个cDNA征段可能来自3个新基因。Northern杂交分析显示,GYIZ-RCC18在肾癌组织中有明显表达,而在正常肾组织中无表达,这证明GYIZ-RCC18是肾癌相关的新基因。结论 人肾癌cDNA消减文库的建立为进一步筛选,克隆肾癌特异性表达的新基因奠定了基础。     

肺癌诊断基因的初步筛选

目的 筛选肺癌细胞恶性转化不同时期差异表达的基因，以期用于肺癌的诊断。方法 应用抑制消减杂交技术(SSH)、测序、cDNA芯片(cDNA Miemarray)、northern blot。结果 利用SSH建立了永生化人支气管上皮细胞(BEP2D)恶性转化不同时期差异表达基因的cDNA文库，其中，A消减文库(BEP2D细胞的cDNA为tester，α粒子照射BEP2D细胞后35代恶性转化细胞R15Hp35的cDNA为driver)有416个克隆，B消减文库(α粒子照射BEP2D细胞后20代转化细胞R15Hp20的cDNA为tester，BEP2D和R15Hp35细胞的cDNA混合后为driver)有301个克隆，C消减文库(R15Hp35细胞的cDNA为tester，BEP2D细胞的eDNA为driver)有586个克隆。对文库中107个克隆单向测序发现：19个克隆在GenBank中没有查到对应的同源序列，其它88个克隆共代表了76个不同的已知基因。然后，将3个文库中全部克隆的cDNA制作成cDNA芯片，用该芯片筛选了15例肺癌组织、5例肺癌旁组织和其他8种癌组织(肝癌、胃癌、食管癌、乳腺癌、白血病、子宫内膜癌、脑神经角质瘤和结肠癌)中mRNA的表达差异。结果，获得肺癌组织高于肺癌旁组织表达的eDNA26个，肺癌旁组织高于肺癌组织表达的31个，2者高于其他8种癌组织的分别为：肺癌旁组织中63个，肺癌组织中87个。将这208个具较大差异表达的基因重新制作成cDNA芯片，再选用临床上同一鳞癌病人鳞癌和鳞癌癌旁组织各1例与该芯片杂交，发现这些筛选出的基因的确在癌组织和癌旁组织中存在较大差异。结论 这些初步筛选出的差异表达基因有望成为肺癌诊断的侯选基因。     

食管癌消减cDNA文库的构建

目的 :采用消减抑制杂交技术 ,研究正常食管粘膜和食管癌组织之间的基因表达差异状况 ,分离食管癌相关基因片段 ,构建食管癌的消减cDNA文库。方法 :以食管癌癌组织为测试子 (tester) ,以正常食管粘膜组织为驱赶子 (driver) ,用消减抑制杂交方法分离食管癌差异表达片段。将该差异表达片段克隆至T载体 ,经蓝白斑筛选后 ,再用PCR方法插入片段筛选出阳性重组质粒 ,构建食管癌消减cDNA文库。结果 :用消减抑制杂交技术分离食管癌差异表达片段 ,经蓝白斑筛选 ,得到 2 2 0个白色克隆 ;再用PCR方法快速筛选出 10 0个两端分别含连接子Adaptor1及Adaptor2R的阳性重组质粒 10 0个 ,从而成功地构建了中国人食管癌特异的消减cDNA文库。结论 :构建了中国人食管癌特异的消减cDNA文库。消减抑制杂交技术能快速有效地分离差异表达基因 ,方法简便、灵敏度高。使用PCR法快速筛选阳性克隆 ,对于消减文库的构建具有重要意义     

人脐静脉内皮细胞脂多糖刺激后上调基因表达谱的分析

目的 对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)受脂多糖(LPS)刺激后上调基因表达谱进行筛选及分析。方法 以受LPS刺激HUVEC为实验方，末刺激别HUVEC为驱使方，进行抑制消减杂交(SSH)建立消减cDNA文库，经菌落原位斑点杂交筛选文库后将阳性克隆测序和同源性分析，并用RT-PCR验证新的cDNA序列。结果 共获得25条上调表达的基因，分别与炎症反应、细胞骨架重构、细胞生长和凋亡、胞内信号转导相关，并克隆到3条新基因表达序列标签(EST)，RT-PCR验证了这些新EST序列只在LPS刺激的内皮细胞中表达。结论 抑制消减杂交有效地克隆了人脐静脉内皮细胞LPS刺激后上调表达基因，有助于阐明LPS直接激活血管内皮细胞的分子机制。     

家族性急性髓系白血病差异表达基因的筛选与鉴定

目的分离家族性急性髓系白血病患者骨髓中差异表达的基因,在基因水平上探讨急性白血病发生发展的分子机制。方法应用Super SMART和抑制性消减杂交（SSH）技术,构建家族性急性髓系白血病cDNA消减文库;应用差异筛选技术进行差异表达片段的筛选与鉴定;测序结果进行BLAST同源性比对分析。结果成功构建了家族性急性髓系白血病cDNA消减文库;克隆、筛选并鉴定了17条基因片段,与已知基因同源,11条为未知基因片段。结论SSH技术是筛选差异表达基因的有效方法;获得多个与细胞增殖和分化相关的已知基因;获得11条新基因EST片段,并被GenBank收录。     

单仙视觉剥夺后鸽脑两侧视盖基因的差异表达

目的：探讨单侧视觉剥夺后鸽子两侧视盖基因的差异表达情况,方法：建立单眼剥夺动物模型,抽提,纯化左右视盖mRNA,利用SSH方法建立左侧视盖差异表达文库,对其中EST进行克隆,测序,反Northern杂交去除假阳性。结果：共筛选得到12个差异表达片段,经同源性检索,其中11个未发现有发高源性的基因,提示可能为新的EST,另一差异片段与CGI－31蛋白有85％的同源性,结论：视觉相关脑区差异表达序列的分析可能为视觉形成的分子机制或视觉通路的分子构筑提供有益的线索。     

TRAIL诱导的白血病细胞凋亡过程中的基因差异表达

目的分离鉴定重组可溶性肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体(rsTRAIL)在诱导JurkatT淋巴细胞白血病细胞凋亡过程中差异表达的基因。方法采用抑制性差减杂交(suppressionsubtractivehybridization,SSH)及PCR技术筛选差异表达的基因。采用狭缝杂交和Northern印迹技术鉴定差异基因片段;以DNA自动序列分析仪测定所获cDNA核苷酸顺序。结果获得了6个差异表达的基因片段,4个在TRAIL诱导的白血病细胞凋亡过程中被抑制,2个被激活;其中,A14、X1、D1、A23和C5等5个基因片段为新基因,其GeneBank登记号分别为AW731601、AW731602、AW731603、AW731604和BE239235。Northern印迹显示,基因D1在Jurkat和MCF-7中的表达明显高于其它肿瘤细胞,提示该基因可能具有肿瘤特异性。结论TRAIL诱导的细胞凋亡过程,涉及多种基因表达的改变。     

人小细胞肺癌多药耐药细胞差异表达基因的克隆研究

目的 构建小细胞肺癌多药耐药细胞(H446/CDDP)差异表达消减cDNA文库.方法 ①以H446/CDDPcDNA为实验方(Tester),小细胞肺癌细胞H446 cDNA为对照方(Driver),应用抑制消减杂交(SSH)技术结合T/A克隆技术构建小细胞肺癌多药耐药细胞差异表达消减cDNA文库.②通过斑点杂交筛选、测序及同源性分析获取H446/CDDP细胞差异表达cDNA片段.结果 成功构建了小细胞肺癌多药耐药细胞H446/CDDP差异表达消减cDNA文库,获得21个H446/CDDP细胞差异表达cDNA片段,经测序及同源性分析表明它们分别代表6个已知基因(同源性为96%～100%).结论 SSH技术是筛选新的功能基因的有效方法;获取的6个差异表达基因可能参与了小细胞肺癌多药耐药细胞H446/CDDP的耐药形成,进一步的功能研究有利于了解它们在小细胞肺癌多药耐药机制中所发挥的作用.     

青少年特发性脊柱侧凸脊柱关节突骨组织差异基因表达的研究

目的构建青少年特发性脊柱侧凸脊柱小关节突骨组织抑制消减cDNA文库,以研究特发性脊柱侧凸的基因表达变化。方法取特发性脊柱侧凸患者顶椎凸凹侧下关节突骨组织提取mRNA,经反转录后,利用抑制消减杂交（SSH）方法,通过两轮杂交和两次抑制PCR构建了两种组织间差异表达基因的cDNA消减文库。筛选差异表达基因并测序,将结果与核酸数据库进行同源性比较。并进一步收集11例特发性脊柱侧凸患者的顶椎和上下端椎凸凹侧下关节突,采用免疫组织化学方法和原位杂交方法对发现的差异表达基因进行验证,将所得的免疫组化和原位杂交图像输入图像分析系统,进行半定量分析。结果对600个克隆测序结果初步分析,并从蛋白水平和基因水平进行检验,获得2个表达差异明显的基因：微球蛋白基因（B2M）和钙结合蛋白基因（calgranulin A,S100A8）。结论应用消减杂交的方法,经适当地改进,在去除相同遗传背景的条件下,可以建立较特异的特发性脊柱侧凸脊柱小关节突骨组织cDNA消减文库,该文库可进一步批量筛选与特发性脊柱侧凸的发生和发展相关的基因群,并克隆特发性脊柱侧凸相关表达基因,研究其与特发性脊柱侧凸发生的分子机理与生物学特性间的关系。差异表达的基因可能与青少年脊柱侧凸呈密切相关。