兔脂肪干细胞体外构建组织工程软骨：负载胰岛素样生长因子1基因的作用

背景：前期研究证实在二维培养条件下,转染胰岛素样生长因子1基因能够明显促进脂肪间充质干细胞的增殖。 目的：在前期研究基础上,利用壳聚糖明胶复合物为立体培养的载体,观察三维立体培养条件下胰岛素样生长因子1基因转染对兔脂肪间充质干细胞增殖能力的影响,体外初步构建组织工程软骨。 方法：分离、培养成年新西兰大耳白兔脂肪间充质干细胞,构建稳定表达pcDNA3.1-IGF-1的细胞株,鉴定后接种于壳聚糖三维支架材料上,分组培养：空白对照组接种未转染基因的脂肪间充质干细胞,空载体组接种胰岛素样生长因子1诱导条件下培养的脂肪间充质干细胞,基因转染组接种稳定转染胰岛素样生长因子1基因的脂肪间充质干细胞,培养1周。扫描电镜观察各组细胞形态,MTT法绘制细胞增殖曲线,CM-DiL荧光标记后观察细胞增殖比率及细胞分布,DMMB法测定糖胺聚糖含量。 结果与结论：成功构建稳定表达pcDNA3.1-IGF-1的细胞株,转染后的细胞株在mRNA水平上获得胰岛素样生长因子1的表达,并成功翻译为蛋白。扫描电镜示各组细胞在支架上贴附、伸展良好,基因转染组细胞生长最为旺盛。MTT 及GAG检测结果提示,基因转染组增殖能力最强、糖胺聚糖最高(P < 0.01),荧光标记显示细胞分布均匀,存活率高(P < 0.05)。提示胰岛素样生长因子1基因转染联合三维立体培养能够有效促进兔脂肪间充质干细胞的增殖和软骨细胞外基质糖胺聚糖的分泌。     

SOX-9和胰岛素样生长因子1共同转染大鼠骨髓间充质干细胞

背景：单基因诱导虽能对骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化产生积极影响,但作用有限,多种基因共同作用才符合机体真实内环境的需求,并有助于发挥多基因产物之间的协同作用,提高分化效果。 目的：验证应用SOX-9和胰岛素样生长因子1基因转染大鼠骨髓间充质干细胞后,目的基因分泌情况及向软骨细胞的分化效果。 设计、时间及地点：两样本观察,实验于2008-04/2009-02在中国医科大学细胞生物实验室完成。 对象：6周龄健康雄性Wistar大鼠2只用于骨髓间充质干细胞提取。 方法：扩增、提取质粒pcDNA3.1-IGF-1、pcDNA3.1-SOX-9。分离、纯化Wistar大鼠骨髓间充质干细胞。按转染情况分为5 组：①未转染组：仅加入双无(无血清无双抗)L-DMEM。②转染空载体组：双无L-DMEM +pcDNA3.1空载体和脂质体。③转染SOX-9组：双无L-DMEM+pcDNA3.1- SOX-9质粒和脂质体。④转染胰岛素样生长因子1组：双无L-DMEM分别+pcDNA3.1-IGF-1质粒和脂质体。⑤共转染组：双无L-DMEM分别+pcDNA3.1-IGF-1、pcDNA3.1-SOX-9质粒和脂质体,混合。 主要观察指标：对转染后细胞进行筛选,MTT法测定筛选后细胞的增殖活性,反转录-聚合酶链反应和Western blot法检测筛选后细胞目的基因和蛋白的表达。 结果：MTT法检测转染SOX-9组、转染胰岛素样生长因子1组和共转染组骨髓间充质干细胞增殖活性A值显著高于未转染组、转染空载体组(P < 0 01)。反转录-聚合酶链反应和Western blot检测目结果显示,SOX-9表达以转染SOX-9组最多;胰岛素样生长因子1表达以共转染组最多;软骨细胞特异性基质Ⅱ型胶原表达以共转染组最多。 结论：双基因转染在诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞转化的能力和细胞外基质分泌的能力上更明显高于单基质转染;另外结果间接说明胰岛素样生长因子1具有诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的作用,但能力弱于SOX-9。     

胰岛素样生长因子1基因转染骨髓基质干细胞治疗裸鼠骨缺损☆

背景：众多的研究已证实胰岛素样生长因子1在成骨细胞的增殖、分化、基质合成中发挥重要的调控作用，并参与调节骨改建及修复的一系列过程。 目的：观察人胰岛素样生长因子1基因修饰的骨髓基质干细胞对骨损伤修复的促进作用及能否构建出具有良好生物学活性的组织工程人工骨，提高骨缺损修复质量。 设计、时间及地点：对比观察，实验于2004-03/2005-05在苏州大学实验动物中心完成。 材料：体外将胰岛素样生长因子1基因通过反转录病毒转入骨组织工程种子细胞骨髓基质干细胞，并与具有良好生物学活性的脱钙骨基质材料复合。 方法：BalB/C裸鼠15只制备颅骨8 mm缺损模型，随机数字表法分为3组，每组5只。胰岛素样生长因子1转染细胞组和空载体细胞组将两种不同植入物脱钙骨基质/胰岛素样生长因子1转染细胞和脱钙骨基质/空载体细胞分别植入颅骨缺损部位，空白对照组仅造模，不进行任何干预。造模后4周处死动物，取出颅骨进行组织学观察。 主要观察指标：①反转录-聚合酶链反应检测转染细胞胰岛素样生长因子1 mRNA的表达。同时收集转染后细胞上清，用蛋白免疫印迹检测重组胰岛素样生长因子1的表达。②扫描电镜观察细胞/基质材料复合物共培养3，6 d后的生长情况。③颅骨缺损模型大体观察。④苏木精-伊红染色观察造模后4周各组颅骨缺损的修复情况。 结果：①经反转录-聚合酶链反应及蛋白免疫印迹检测，胰岛素样生长因子1 基因修饰的骨髓基质干细胞中有胰岛素样生长因子1 mRNA及蛋白的表达。②扫描电镜观察转染细胞与脱钙骨基质共培养3 d时胰岛素样生长因子1转染细胞组脱钙骨基质材料表面已有大量细胞黏附并向深部空隙长入；6 d时脱钙骨基质表面黏附的细胞处已分泌出大量胶原纤维；而空载体细胞组各时间点黏附细胞数和胶原纤维产生量则均较少。③造模后4周各组植入物周围均无明显炎症反应，胰岛素样生长因子1转染细胞组植入物与颅骨缺损结合紧密；而空载体细胞组植入物可推动；空白对照组骨缺损处无新骨形成。④苏木精-伊红染色可见胰岛素样生长因子1转染细胞组植入物与颅骨缺损结合紧密，骨折缺损区有新骨及血管形成；空载体细胞组骨缺损区新骨形成较少；空白对照组缺损未见修复。 结论：胰岛素样生长因子1转染的骨髓基质干细胞/脱钙骨基质复合物具有较好的骨缺损修复功能。     

纳米载体介导人胰岛素样生长因子1基因转染兔骨髓间充质干细胞及其表达☆

目的：构建增强型绿色荧光蛋白基因（enhanced-green fluorescent protein，EGFP）标记的人胰岛素样生长因子（human insulin-like growth factor, hIGF-1）真核表达载体，转染至兔骨髓间充质干细胞，为组织工程关节软骨的构建提供基因改良的种子细胞。 方法：实验于2005-03/2006-01在重庆医科大学儿科研究所完成。根据GeneBank公布的hIGF-1序列设计PCR引物，从质粒pcDNA3.1-hIGF-1中扩增出截短型hIGF-1，亚克隆至pMD-T18载体，测序鉴定后酶切出目的基因片段并插入pIRES2-EGFP中,构建成真核表达质粒pIRES2-EGFP-hIGF-1，经PCR及双酶切鉴定正确后用非病毒类纳米材料基因转移载体PAMAM-D介导转入兔骨髓间充质干细胞，通过荧光观察、流式细胞仪、RT-PCR等方法从各个水平检测hIGF-1在细胞的表达。 结果：成功构建了增强型绿色荧光蛋白基因标记的真核表达质粒pIRES2-EGFP-hIGF-1，并检测到目的基因hIGF-1在兔骨髓间充质干细胞的理想表达。 结论：新型纳米材料PAMAM-D是高效、简便、表达持久的基因转染方法，经IGF-1基因修饰的骨髓间充质干细胞是软骨组织工程种子细胞的理想选择。     

转化生长因子β1/胰岛素样生长因子1与髓核细胞诱导脂肪间充质干细胞向髓核样软骨细胞分化的比较

背景：以往研究脂肪间充质干细胞培养方式多为单层培养,诱导方式主要集中于细胞因子的方法,而椎间盘体内微环境,除细胞因子对细胞影响外,在其三维环境中细胞间的相互作用还值得进一步研究。目的：在体外分别通过髓核细胞和转化生长因子β1/胰岛素样生长因子1两种条件诱导,观察脂肪间充质干细胞向髓核细胞分化的差异。方法：分别单层培养兔的脂肪间充质干细胞与髓核细胞细胞,脂肪间充质干细胞培养至3代经鉴定后,按5×106个细胞制成微球,置于Transwell培养板中培养,分别通过髓核细胞微球及转化生长因子β1/胰岛素样生长因子1诱导;于诱导前、诱导7,14 d,观察细胞形态变化,并通过RT-PCR对Ⅱ型胶原、蛋白多糖水平进行测定。结果与结论：在体外诱导7,14 d,两组脂肪间充质干细胞微团体积、形态无明显区别。RT-PCR检测结果显示7 d两组与髓核诱导组均有Ⅱ型胶原及蛋白多糖mRNA表达,但转化生长因子β1/胰岛素样生长因子1组表达更强;诱导14 d髓核诱导组Ⅱ型胶原及蛋白多糖mRNA表达明显增高,优于转化生长因子 β1/胰岛素样生长因子1组。结果表明,在体外髓核细胞和转化生长因子β1/胰岛素样生长因子1对脂肪间充质干细胞进行诱导均有促进其向髓核细胞分化作用,而转化生长因子β1、胰岛素样生长因子1为正常髓核细胞分泌重要因子,说明髓核细胞对脂肪间充质干细胞的诱导之间除细胞因子作用外,尚存在相互促进增殖分化作用。     

转化生长因子β1基因转染鼠脂肪间充质干细胞的可行性☆

背景：脂肪间充质干细胞在转化生长因子β1等生长因子的调控下可被诱导分化为软骨细胞。然而,外源性转化生长因子β1存在引起趋化性、激发炎症反应、造成局部损伤、有效成分容易被稀释或丢失、半衰期短、缺少理想的转运蛋白等缺陷。因此,利用基因重组技术,使种子细胞表达转化生长因子β1,对软骨组织工程的进一步发展具有重要的指导意义。 目的：探讨真核表达载体pcDNA3.1-转化生长因子β1质粒的构建方法,并观察其转染脂肪间充质干细胞的可行性。 方法：利用基因重组技术,将大鼠转化生长因子β1全长基因的PCR产物与克隆载体pT7Blue连接,并用大肠杆菌筛选阳性重组体构建真核表达质粒,采用XboⅠ、Hind Ⅲ双酶切及测序方法对质粒进行鉴定;将已经纯化的pcDNA3.1-转化生长因子β1质粒和空载体pcDNA3.1质粒分别采用阳离子脂质体试剂LipofectamineTM2000转染脂肪间充质干细胞,经G418抗性筛选后扩大培养,同时用pcDNA3.1-绿色荧光蛋白观察转染效率。 结果与结论：重组质粒经XboⅠ、Hind Ⅲ双酶切后出现1.35 bp和5.4 kb 2条带,测序结果显示重组质粒所包含的转化生长因子β1全长碱基序列完全正确,绿色荧光蛋白显示其转染脂肪干细胞的转染效率> 80%,且转染细胞后有转化生长因子β1 mRNA和蛋白的表达上调。提示利用基因重组技术可成功构建能转染脂肪间充质干细胞的真核表达载体pcDNA3.1-转化生长因子β1质粒。     

胰岛素样生长因子1在脑梗死大鼠神经干细胞增殖、迁移和分化中的作用*

背景：胰岛素样生长因子1是一种多肽类激素,已证明其对前体细胞增殖有促进作用。 目的：探讨静脉注射胰岛素样生长因子1对大鼠脑缺血后神经干细胞增殖、迁移和分化的影响。 方法：成年雄性SD大鼠80只,随机分为对照组和实验组,40只/组。两组大鼠均采用改良线栓法制备局灶性脑缺血模型,实验组大鼠通过尾静脉注射胰岛素样生长因子1,按100 μg/kg计算,连续注射6 d;对照组给予等剂量的生理盐水。分别于干预后7,14,21,28 d断头去脑,各组分别在处死前1 d腹腔注射BrdU。采用免疫组织化学及其双重染色法检测BrdU阳性细胞、PSA-NCAM阳性细胞、BrdU+PSA-NCAM双阳性细胞、BrdU+MAP2双阳性细胞的表达。 结果与结论：BrdU阳性细胞、PSA-NCAM阳性细胞数均在缺血后7 d最多;BrdU+PSA-NCAM双标阳性细胞在缺血后双侧室管膜下区和海马齿状回区均可以检测到,于7 d计数最多,之后逐渐减少;BrdU+MAP2双阳性细胞却从14 d开始逐渐增多,随BrdU+PSA-NCAM双阳性表达的逐渐降低,BrdU+MAP2双阳性表达逐渐增高,呈现此消彼涨的变化。提示静脉途经给予胰岛素样生长因子1能诱导大鼠缺血性脑损伤后神经干细胞的增殖、分化和迁移。     

碱性成纤维细胞生长因子基因转染兔骨髓间充质干细胞*☆

背景：碱性成纤维细胞生长因子对于创伤修复具有明显的促进作用,但局部应用难以持久地发挥作用。 目的：观察碱性成纤维细胞生长因子基因转染至兔骨髓间充质干细胞后的表达情况。 设计、时间及地点：细胞基因学体外观察,于2009-03/08在云南大学生命科学院完成。 材料：日本大耳白兔1只,购于昆明医学院动物科。pCDNA3.1质粒为美国Invitrogen产品。 方法：抽取兔髂前上棘骨髓,采用贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,待细胞融合至培养瓶底80%时消化传代。参考GeneBank碱性成纤维细胞生长因子cDNA序列设计合成基因,电泳纯化后xholⅠ、BamHⅠ双酶切回收凝胶,以限制性核酸内切酶对PcDNA Vector质粒进行酶切、电泳和凝胶回收,连接碱性成纤维细胞生长因子DNA与PcDNA Vector质粒,构建pCDNA-碱性成纤维细胞生长因子真核表达载体,运用脂质体转染法将重组体转染至兔骨髓间充质干细胞中,并筛选稳定转染株。 主要观察指标：骨髓间充质干细胞表面抗原的表达,Western blot法检测目的蛋白的表达。 结果：流式细胞仪检测结果示所培养细胞表面抗原呈CD90,CD44阳性,CD45呈阴性;免疫组化检测结果示骨髓间充质干细胞血管源性细胞表面抗原CD34呈阴性,而相对特异性标记物CD44呈阳性。转染碱性成纤维细胞生长因子的骨髓间充质干细胞提取的细胞裂解液中,在Mr 23 000处有一条明显阳性杂交带;而转染pCDNA3.1(-)空载体的骨髓间充质干细胞提取蛋白未见阳性条带。 结论：实验成功地将碱性成纤维细胞生长因子基因转染至兔骨髓间充质干细胞,该目的基因可稳定表达。     

腺病毒介导骨形态蛋白9基因转染兔脂肪干细胞

背景：已证实骨形态蛋白9是骨形态蛋白家族最具潜力的促骨分化生长的因子之一,目前国内在成骨方面对骨形态蛋白9的报道非常少。 目的：探讨腺病毒介导的人骨形态蛋白9基因转染兔脂肪干细胞的可行性,及其转染后的成骨作用。 设计、时间及地点：细胞基因学体外观察,于2007-08/2008-06在重庆医科大学附属儿童医院儿研所外科研究室完成。 材料：新西兰大白兔5只,由重庆医科大学实验动物中心提供。携带人全长骨形态蛋白9基因的腺病毒载体由重庆医科大学附属儿童医院罗庆研究员构建并惠赠。 方法：取兔颈后部脂肪组织,体外分离纯化脂肪干细胞。取生长良好的第3代细胞,以1×108 L-1密度接种于6孔板,转染组经感染复数为100的载有人骨形态蛋白9基因的腺病毒转染脂肪干细胞,并设立未转染对照组。 主要观察指标：细胞形态及生长曲线变化,荧光显微镜及RT-PCR检测转染后人骨形态蛋白9基因mRNA的表达,碱性磷酸酶及钙茜素红染色测定转染后成骨活性。 结果：转染1周后细胞汇合呈铺路石状,2周后形成钙化结节;未转染对照组细胞形态较前无明显变化,无明显的钙化结节形成。与未转染对照组比较,转染组细胞停滞期延长,数量轻度下降,倍增时间延长。脂肪干细胞转染骨形态蛋白9基因后12 h后即有荧光表达,转染3,6,9,12 d后人骨形态蛋白9 mRNA均呈阳性表达且逐渐增强,未转染对照组呈阴性。转染组碱性磷酸酶活性随转染时间的延长呈升高趋势,钙茜素红染色可见钙化结节;未转染对照组碱性磷酸酶染色及钙茜素红染色均呈弱阳性表达。 结论：携带人全长骨形态蛋白9基因的腺病毒可成功转染兔脂肪干细胞,转染后脂肪干细胞高表达骨形态蛋白9,且具有明显的成骨作用。     

人半月板纤维软骨细胞对人胰岛素样生长因子Ⅰ的效应反应

背景：人类半月板纤维软骨细胞可能会对有积极生物学效应的生长因子产生反应，例如人胰岛素样生长因子Ⅰ，半月板细胞也可能会成为将来临床基因治疗的有效供体。 目的：拟观察人半月板纤维软骨细胞对人胰岛素样生长因子Ⅰ的效应反应。 设计、时间及地点：开放性实验，于2007-10/2008-04在青岛大学附属医院骨科实验室完成。 材料：收集半月板撕裂和盘状半月板患者关节镜手术中切取的半月板组织用于人半月板纤维软骨细胞培养。 方法：利用聚合酶链式反应从人肝细胞cDNA文库中获得人胰岛素样生长因子Ⅰ基因，将其克隆入双顺反子真核表达载体pIRES2-EGFP中。将关节镜手术中切取的成人半月板组织，体外进行分离培养。利用阳离子脂质体FuGene6将人胰岛素样生长因子Ⅰ转染入人半月板纤维软骨细胞中。 主要观察指标：转染人胰岛素样生长因子Ⅰ后增强型绿色荧光蛋白的表达；检测细胞上清中人胰岛素样生长因子Ⅰ的分泌浓度；流式细胞仪检测细胞转染后的变化。 结果：基因测序及酶切，聚合酶链反应等均证实人胰岛素样生长因子Ⅰ基因的正确克隆，并形成正确的真核表达载体pIRES2-EGFP-hIGF-Ⅰ。人半月板纤维软骨细胞在接种40 h 后贴壁并伸展为成纤维细胞样，三角形或多角形外观。增强型绿色荧光蛋白的表达逐渐增加，在转染后56 h 达到峰值。细胞上清中人胰岛素样生长因子Ⅰ蛋白质的浓度变化趋势类似增强型绿色荧光蛋白的表达，峰值可达22.68 μg/L。蛋白免疫印迹、反转录-聚合酶链反应和免疫组织化学染色均证实人胰岛素样生长因子Ⅰ蛋白质的存在。转染后部分细胞表型发生变化，增殖加速。流式细胞仪检测转染后S期细胞比例增多。 结论：人类半月板纤维软骨细胞可被阳离子脂质体安全有效地转染，转染的人胰岛素样生长因子Ⅰ基因可分泌较高水平的生长因子并加速细胞的增殖。     

茶黄素和转化生长因子β1对兔骨髓间充质干细胞向软骨细胞增殖及

背景：已有大量的实验报道，转化生长因子β1能体外促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞转化，而茶黄素在细胞转化过程中起重要作用。 目的：拟验证在茶黄素和转化生长因子β1的协同作用下，骨髓间充质干细胞向软骨细胞转化是否优于单纯使用转化生长因子β1。 设计、时间及地点：干细胞生物学实验，于2008-05/08在安徽省立医院中心实验室完成。 材料：健康8周龄新西兰大白兔，获取骨髓间充质干细胞进行分离和原代培养。 方法：取第3代骨髓间充质干细胞，分为3组:对照组：完全培养基加地塞米松10-8 mmol/L、维生素C10 mmol/L。转化生长因子组：完全培养基加地塞米松10-8 mmol/L、转化生长因子ß15 µg/L、维生素C10 mmol/L。茶黄素组：完全培养基加地塞米松10-8 mmol/L、转化生长因子β1 5 ng/mL、维生素C10 mmol/L、茶黄素30 mg/L。 主要观察指标：倒置显微镜下观察细胞生长状况及形态变化，甲苯胺蓝染色、阿利新蓝比色法测定各板每孔中葡萄糖氨基聚糖含量、免疫检测仪测定3组的吸光度值。 结果：骨髓中分离获得的骨髓间充质干细胞在体外增殖旺盛，转化生长因子β1和茶黄素诱导后细胞生长明显减缓。加入诱导液后，转化生长因子组和茶黄素组，可见细胞小结形成，茶黄素组细胞小结明显增多并在局部形成多个呈放射状细胞集落，而对照组未见明显变化。免疫组化染色后转化生长因子组细胞呈阳性、茶黄素组细胞呈强阳性，对照组未见阳性细胞。与对照组比较，转化生长因子组、茶黄素组吸光度值明显增（P < 0.01），茶黄素高于转化生长因子组（P < 0.05），差异有统计学意义。 结论：茶黄素在转化生长因子β1存在的条件下能有效促进骨髓间充质干细胞在体外向软骨细胞分化。     

人血管内皮生长因子165基因转染兔骨髓间充质干细胞的蛋白表达

背景：骨髓间充质干细胞是最好的组织工程种子细胞来源,含有血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor 165,VEGF165)不仅对血管再生和启动成骨修复有重要意义,其持续稳定的释放还能够提高新生骨的矿化程度,增强修复组织的力学性能。 目的：观察hVEGF165基因转染的兔骨髓间充质干细胞分泌血管内皮生长因子的蛋白功能。 方法：体外分离、培养兔骨髓间充质干细胞,纯化并鉴定兔骨髓间充质干细胞;免疫荧光法检测细胞表面标志;传代培养后的骨髓间充质干细胞以pcDNA3.1-VEGF165质粒和脂质体1∶3比例的混合液转染,并分为3组：转染组应用pcDNA3.1-VEGF165转染细胞,空载体转染组应用pcDNA3.1-空载体转染,未转染组不处理。通过ELISA和Western-blot检测转染后细胞中外源性血管内皮生长因子的表达。 结果与结论：转染组与其他两组比较,VEGF165蛋白含量显著增高,差异有显著性意义(P < 0.05),但空载体转染组与未转染组之间差异无显著性意义(P > 0.05),转染组不同时间点之间VEGF165蛋白含量差异均有显著性意义(P < 0.05),hVEGF165基因转染的骨髓间充质干细胞能成功分泌VEGF165蛋白。提示采用基因转染技术可将hVEGF165基因转染到骨髓间充质干细胞中并可有效表达具有生物活性的VEGF165。     

腺病毒介导骨形态发生蛋白2基因转染诱导脂肪间充质干细胞向

背景：在众多的骨生长因子中,骨形态发生蛋白2具有显著促进骨缺损修复和骨折愈合的效果。骨修复是一个阶段性过程,不需要转染的目的基因长久表达,因此利用腺病毒载体将目的基因导入脂肪间充质干细胞来促进骨愈合比较理想。 目的：观察腺病毒介导的骨形态发生蛋白2基因转染后大鼠脂肪间充质干细胞的分化情况。 设计、时间及地点：细胞学体外对照观察,于2008-01/10在北京大学第三医院中心实验室完成。 材料：清洁级3周龄雄性Lewis大鼠24只,由北京大学实验动物学部提供。腺病毒载体Ad-BMP2、Ad-GFP由靳小兵博士构建扩增。 方法：胶原酶消化法分离培养大鼠脂肪间充质干细胞,传至第3代分为Ad-BMP2转染组、Ad-GFP转染组和未转染组。各转染组分别向培养液中加入对应的腺病毒液,转染复数MOI=100。 主要观察指标：转染后脂肪间充质干细胞碱性磷酸酶活性,von Kossa染色结果,Western blotting法检测骨桥蛋白和骨形态发生蛋白2的表达。 结果：与未转染组比较,转染后7,14,21d Ad-GFP转染组细胞碱性磷酸酶活性无明显变化;Ad-BMP2转染组细胞碱性磷酸酶活性明显增高（P < 0.01）,且随时间延长碱性磷酸酶活性增加更为显著。Ad-BMP2转染组von Kossa染色出现黑色钙结节,免疫细胞化学染色结果示胞浆内有大量黄染颗粒,骨桥蛋白、骨形态发生蛋白2均呈明显强阳性表达。Western blotting检测结果显示Ad-BMP2转染组脂肪间充质干细胞骨桥蛋白、骨形态发生蛋白2表达水平增高,Ad-GFP转染组中未检测到骨桥蛋白、骨形态发生蛋白2的表达。 结论：大鼠脂肪间充质干细胞经腺病毒介导的骨形态发生蛋白2基因转染后,可定向分化为成骨细胞。     

表皮生长因子干预人羊膜间充质干细胞的增殖和迁移

背景：人羊膜间充质干细胞移植可促进皮肤创伤的愈合。 目的：观察表皮生长因子对体外培养人羊膜间充质干细胞增殖和迁移的影响。 方法：人羊膜间充质干细胞经分离、鉴定并培养至第3代。细胞经过不同浓度的表皮生长因子处理后,用MTT法测量吸光度值从而计算出细胞存活率,通过计数穿过Transwell小室的细胞数测定表皮生长因子对细胞迁移能力的影响;并用表皮生长因子受体的抑制剂AG1478及PI3K的抑制剂LY294002检测其对细胞迁移能力的影响。 结果与结论：表皮生长因子处理后细胞的吸光度值升高1.55倍,穿过膜的数量增高1.5倍;AG1478、LY294002对表皮生长因子引起的迁移有抑制作用。提示表皮生长因子处理后细胞增殖和迁移能力均增强,迁移与EGFR-PI3K信号通路有关。     

血管内皮细胞生长因子对人脐静脉间充质干细胞生长增殖的影响

背景：在体外构建组织工程材料的过程中，快速获得足够数量且纯度高的种子细胞极为重要，但目前人脐静脉间充质干细胞原代培养的增殖率仍较低。 目的：观察血管内皮细胞生长因子对人脐静脉间充质干细胞原代生长、增殖的影响。 设计、时间及地点：细胞学体外观察，于2008-03/07在辽宁医学院解剖学实验室完成。 材料：正常健康产妇顺产或剖宫产的新生儿脐带20条，由锦州市凌河区妇幼保健院及辽宁医学院附属第一医院提供。 方法：采用胶原酶消化法分离人脐静脉间充质干细胞，以1×108 L-1的密度接种于24孔培养板，设立2组，实验组加入150 g/L血管内皮细胞生长因子，对照组不加入任何细胞因子。 主要观察指标：观察细胞形态变化，MTT法检测细胞生长曲线，免疫细胞化学法鉴定细胞CD166的表达。 结果：接种后6 h细胞开始贴壁，48 h后细胞完全贴壁生长，出现呈椭圆形、多角形的内皮细胞，以及呈梭形的成纤维样细胞，有的形成漩涡状生长集落；原代培养1周后细胞以梭形为主；传代后24 h细胞基本完成贴壁，48 h细胞开始分裂增殖，5~7 d可见多核的成纤维样细胞贴壁，呈长杆状、三角形、梭形等。与对照组比较，实验组细胞生长状态较好，增殖较快，单位时间内获得的细胞数量明显增加(t=2.235，P < 0.05)，CD166阳性细胞率显著升高(t=1.638，P < 0.01)。 结论：血管内皮细胞生长因子可促进人脐静脉间充质干细胞贴壁，且更有利于间充质干细胞的增殖和纯化。     

不同分离方法及培养条件对兔骨髓间充质干细胞生长增殖及生物学特性的影响

背景：目前用于分离骨髓间充质干细胞的方法主要有全骨髓贴壁法、密度梯度离心法、流式细胞仪分离法、免疫磁珠法，后两种方法可获得较为纯化的骨髓间充质干细胞，但对细胞活性影响较大，甚至导致细胞完全失去活性。 目的：观察不同分离方法、培养条件下，兔骨髓间充质干细胞生长增殖及生物学特性的变化。 设计、时间及地点：细胞学体外对比观察，于2006-01/2007-06在中国医科大学附属盛京医院感染病实验室完成。 材料：日本雄性大耳白兔3只，由中国医科大学实验动物中心提供。Mesen Cult干细胞培养基为Vancouver BC公司产品，DMEM/F12（1∶1）培养基、LG-DMEM培养基均为Hyclone公司产品。 方法：无菌抽取兔髂前上棘骨髓，采取两种方法分离骨髓间充质干细胞。全骨髓贴壁分离法是将骨髓液注入等体积的Hanks液中，4 ℃ 1 000 r/min离心5 min，弃上清，用Hanks液重复洗涤。Percoll密度梯度分离法是将相当于2倍骨髓液体积的1.073 g/mL Percoll分离液加入15 mL无菌离心管内，再将抗凝的骨髓沿管壁缓慢加至分离液面上，4 ℃ 800 r/min离心 30 min，吸取分离液面上的白色云雾状单个核细胞层，用无血清L-DMEM培养液冲洗。将分离的骨髓间充质干细胞浓度调整为1×106，设立3组，分别加入Mesen Cult干细胞培养基、DMEM/F12培养基、L-DMEM培养基，各组培养基中均含有20%的胎牛血清、100 u/mL青霉素、100 u/mL链霉素，于37 ℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度培养箱中培养。 主要观察指标：不同分离方法、培养条件对细胞形态、生长特征、增殖的影响，细胞超微结构变化，传代后冻存复苏情况。 结果：全骨髓贴壁分离法1周后可见少许贴壁细胞伸出伪足，10~12 d形成散在细胞集落，16~18 d融合成单层；Percoll密 度梯度分离法培养1~2 d后可见部分细胞贴壁，5~7 d形成散在细胞集落，2周后融合成单层并铺满平底。不同培养条件下 的第3代骨髓间充质干细胞，Mesen Cult组细胞增殖能力、贴壁率、BrdU标记指数均略优于DMEM/F12组、LG-DMEM组，但差异无显著性意义（F=0.179，P > 0.05；F=0.098，P > 0.05；χ2=0.39，P > 0.05）。透射电镜下可见核仁，细胞器少，为低分化的幼稚细胞。复苏第9代冻存的细胞，4 h后贴壁率约60%，细胞增长活跃。 结论：Percoll密度梯度法和全骨髓贴壁法分离的兔骨髓间充质干细胞，前者可获得较均匀一致的单核细胞，在细胞增殖、清除造血细胞干扰等方面明显优于后者；Mesen Cult、DMEM/F12、LG-DMEM培养液均适用于兔骨髓间充质干细胞的培养；细胞冻存复苏后生长增殖状况良好。