含人DNA聚合酶β基因启动子萤光素酶报告载体的构建

目的:构建含人DNA聚合酶B(DNA polymerase beta,polβ)基因启动子的萤光素酶报告基因表达载体pGL3polβ/promoter.方法:利用PCR技术扩增人类polβ基因启动子的核心片段,克隆至含新霉素抗性的萤光素酶表达载体pGL3-Neo-enhancer,构建含DNA polβ启动子的萤光素酶表达载体pGLpolβ/promoter,重组子经双酶切、PCR及测序鉴定.将构建的载体用脂质体转染体外培养的食管癌EC-1细胞株,应用萤光素酶测定系统检测萤光素酶的表达活性.结果:测序结果表明,克隆获得的polβ基因启动子序列与GenBank报道的一致,且插入方向正确.pGL3polβ/promoter组萤光素酶的表达活性(2 207 348.000±71 626.763)与空白组(451.670±23.347)和pGL3.Neo-enhancer组(4 884.330±1 623.047)相比,差异有统计学意义(F=5 681.596,P<0.05).结论:成功构建了含人DNA polβ基因启动子的萤光素酶报告基因表达载体pGL3polβ/promoter.     

人类胚胎肌肉细胞体外自发恶性转化抑癌基因的改变

目的:研究人类胚胎肌肉源性自发恶性转化细胞系抑癌基因的改变.方法:运用免疫组化、PCR,PCR产物直接测序研究该类细胞系抑癌基因p16,p15,MTAP(甲硫氨酸磷酸化酶)和p53基因及蛋白的改变.结果:在染色体9021处存在纯合性片段缺失,包括p16,p15及MTAP;对p53基因突变率高发的外显子7,8及内含子7测序发现存在范围较大的突变,外显子突变率高达13%,皆为点突变,而内含子变异更甚,包括小片段缺失、插入、移位及点突变,其几与正常p53序列无明显相似性,在测序的6个细胞系中(含5个不同遗传背景)突变序列具有高度一致性.结论:多种抑癌基因的变异在正常胚胎肌肉细胞自发恶性转化进程中具有重要的作用.     

转染野生型DNA聚合酶β对交链孢霉酚致突变作用的影响

目的:观察转染野生型DNA聚合酶β(polymerase beta,polβ)对交链孢霉酚(alternariol,AOH)致突变作用的影响.方法:用pEGFP-C3(空载体)、pEGFP-C3-polβ(野生型polβ重组表达载体)质粒转染NIH3T3细胞;转染后的细胞分别用1.5 μmol/L、2.0 μmol/L和2.5 μmol/L 3种浓度的AOH诱导48 h,RT-PCR扩增DNA polβ基因,克隆至pEGM-T载体后,转化大肠杆菌JM109,筛选鉴定,进行测序分析.结果:转染pEGFP-C3的NIH3T3细胞DNA polβ基因突变点个数随AOH浓度升高而增多,而转染pEGFP-C3-polβ的NIH3T3细胞DNA polβ基因在1.5 μmol/L和2.0 μmol/L浓度诱导下未见突变发生,当AOH浓度增大到2.5 μmol/L才出现DNA polβ基因突变.结论:高表达野生型DNA polβ能够在一定程度上抵抗霉菌毒素的致突变作用.     

全反式维甲酸诱导的食管癌细胞DNA聚合酶β的表达

目的：了解食管癌细胞分化过程中DNA聚合酶β(polβ)基因的表达。方法：采用全反式维甲酸(ATRA)诱导人食管癌Eca109细胞分化,应用甲基绿-派洛宁染色、原位杂交、免疫组化和Western blot方法分别检测细胞分化和polβ基因的表达。结果：ATRA作用5d后可以诱导Eca109细胞分化。Wt—polβ和mt—polβ(截短的)基因的表达随着Eca109细胞的分化而降低。结论：ATRA可下调Eca109细胞wt-polβ和mt—polβ的表达,促使其分化。     

前列腺癌及良性增生组织中DNA聚合酶β、PTEN及Ha-ras基因mRNA检测

目的:探讨前列腺癌(Pca)及良性前列腺增生(BPH)组织中DNA聚合酶β(polβ)、PTEN及Ha-ras基因mRNA的表达.方法:应用RT-PCR法检测12例Pca组织及20例BPH组织中polβ、PTEN及Ha-ras基因mRNA的表达状况.结果:与BPH组织比较,Pca组织中polβ、Ha-ras基因mRNA表达增高,PTEN基因mRNA表达降低(P均＜0.01).Pca组织中polβ与Ha-ras基因mRNA的表达呈正相关(r=0.67,P＜0.05),PTEN与polβ、Ha-ras基因mRNA的表达呈负相关,r分别为-0.58、-0.71,P均＜0.05,结果:polβ及Ha-ras的表达上调及PTEN的表达下调是Pca发生中的重要分子事件.     

前列腺癌及良性增生组织中DNA聚合酶β、PTEN及Ha-ras基因mRNA检测

目的:探讨前列腺癌(Pca)及良性前列腺增生(BPH)组织中DNA聚合酶β(polβ)、PTEN及Ha-ras基因mRNA的表达。方法:应用RT-PCR法检测12例Pca组织及20例BPH组织中polβ、PTEN及Ha-ras基因mRNA的表达状况。结果:与BPH组织比较,Pca组织中polβ、Ha-ras基因mRNA表达增高,PTEN基因mRNA表达降低(P均<0.01)。Pca组织中polβ与Ha-ras基因mRNA的表达呈正相关(r=0.67,P<0.05),PTEN与polβ、Ha-ras基因mRNA的表达呈负相关,r分别为-0.58、-0.71,P均<0.05,结果:polβ及Ha-ras的表达上调及PTEN的表达下调是Pca发生中的重要分子事件。     

抑制差减杂交方法筛选辐射诱导细胞恶性转化模型中的差异表达基因

目的:筛选辐射诱导的支气管上皮细胞恶性转化模型中的差异表达基因.方法:应用抑制差减杂交方法(SSH)构建辐射诱导的细胞转化模型差异表达基因的cDNA文库.对差减文库进行PCR筛选,对得到的差异片段进行测序及BLAST分析;对部分筛选出来的差异表达基因使用荧光定量PCR方法检测并确认其变化;将新的序列表达标签(EST)登录到GenBank上.结果:在80个进行测序的克隆中,得到确定序列的共73个.在转化细胞中表达下降的序列41条,BLAST比较分析结果:得到已知序列6条;未知基因的EST序列20条;空载体序列7条;8条为重复测定序列.在转化细胞中表达上升的序列32条,BLAST分析:已知序列14条;未知基因的EST序列9条;重复测定的序列9条.对其中的部分基因改变进行荧光定量PCR检测,结果表明辐射转化组中MY06、HACE1、ZNF143、HNRPH1的表达量明显增加(与对照组相比,转化组中的mRNA分别增加了3.49、29.38、12.99、5.00倍);而PCBP2、RPL15、TCERG1的表达量下降(与对照组相比,转化组中的mRNA分别减少了1.89、48.77、11.95倍).将得到的29个未知序列登录到GenBank,序列ID:EB643220～EB643248.结论:利用抑制差减杂交方法成功建立了恶性转化细胞模型差异表达cDNA文库,包含大量功能未知的新基因;ZNF143表达增加,其与细胞的增殖与分裂有关,TCERG1作为转录辅助激活因子在mRNA转录和后期的修饰过程中起到重要的作用,PCBP2是一个Polyc连接蛋白,具有蛋白翻译调节功能,这些基因在辐射致癌中尚无研究报道.     

突变型DNA聚合酶β真核表达载体的构建及其表达

目的构建含食管癌突变型DNA聚合酶β基因(DNA polymeraseβ,polβ)的真核表达载体pcDNA4-C-polβ,使其在polβ基因敲除的EC9706细胞中表达。方法根据食管癌突变型polβ基因序列,设计并合成一对特异性引物(引物1、引物2),通过PCR扩增获得含BamHⅠ和ApaⅠ的基因序列,将其克隆入T载体,PCR及测序鉴定无误后,将其插入真核表达载体pcD-NA4-C,从而构建了含突变型polβ基因的真核表达载体pcDNA4-C-polβ。将重组质粒以脂质体包裹的方式转染入polβ基因敲除的EC 9706细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞株。结果经过PCR筛选及DNA测序鉴定,证实真核表达载体pcDNA4-C-polβ构建成功。筛选后的EC 9706细胞经HislinkTM蛋白纯化试剂盒纯化,仅在39kD位置有一条带,证明蛋白表达及纯化成功。结论成功构建了食管癌突变型polβ基因的真核表达载体pcDNA4-C-polβ,并纯化出polβ蛋白,为进一步研究polβ的功能奠定坚实的基础。     

基于PCR的siRNA表达框的制备

目的 改进目前基于PCR的方法制备siRNA表达框,转染细胞后产生高效的RNA干扰作用。方法从K562细胞中提取基因组DNA,以此为模板,PCR扩增U6启动子序列并克隆至pMD18-T载体中,用载体上的引物进行扩增,所得产物即制成作为扩增siRNA表达框的模板。选择p53为靶基因,扩增制备siRNA表达框,测序验证后,转染SH—SY5Y细胞48h后提取RNA进行RT—PCR,检测RNA干扰的效应。结果测序结果表明所克隆的U6启动子序列正确。细胞转染表达框,在mRNA水平上,p53基因的表达明显受到了抑制。结论本实验所制作的基于PCR的方法制备siRNA表达框可以很好地应用于RNAi作用研究。     

E.Coli中alkA基因启动子点突变对MNNG作用的表达

目的；研究alkA基因启动子点突变N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine(MNNG)诱导，获得高β-半乳糖苷酶活性表达的突变克隆株，用于抗肿瘤的基因治疗。方法；采用人工突变方法制成alkA基因启动子区点突变，经MNNG诱导后测定点突变株β-半乳糖苷酶活性。结果：共获得点突变株46个，其中插入突变1个，置换突变26个，缺失突变8个，双突变11个。在突变株中，3株受MNNG诱导-β半乳糖苷酶活性表达高于野生型。结论：alkA基因启动子点突变克隆株受MNNG诱导β-半乳糖苷酶活性高于野生型。