人骨形成蛋白2，3成熟肽削短／突变体的表达及其诱骨活性

0　引言　骨形成蛋白 [1 ] (bone morphogenetic proteins,BMPs)是属于 TGF-β超家族的成员 ,目前已有 18个 h BMP基因被克隆 .除 BMP- 1外 ,其他 BMPs在胚胎时期骨组织分化发育、成年骨损伤修复、胚胎发育期中胚层的诱导和分化以及神经系统的发育和修复等方面都起着重要作用 [2 - 4 ] ,因而BMPs有十分乐观的临床应用前景 .利用 E.coli表达的不同的长于成熟肽的羧端肽经复性后均具有不同程度诱骨活性 [5 ,6 ] ,但对短于成熟肽的肽段及其氨基酸组成与其生物学活性的关系 ,尚未见报道 .在上述工作的基础上 ,本研究在大肠杆菌中表达削…     

人骨形成蛋白-2成熟肽在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达

目的利用甲醇毕赤酵母表达系统,高效分泌表达人骨形成蛋白-2成熟肽(hBMP-2)。方法利用PCR方法扩增得到hBMP-2基因,构建其毕赤酵母真核表达载体pPICZaC/hBMP2,电转化巴斯德毕氏酵母X-33,于28℃进行甲醇诱导分泌表达,用PCR法、SDS-PAGE、WesternBlot等方法筛选获得高效表达rhBMP-2的工程菌株,并进行了表达产物的纯化和活性测定。结果表达产物分泌至培养上清中,rhBMP-2含量达100mg·L-1。SDS-PAGE初步验证了表达产物的分子量,经WesternBlot和ELISA检测到重组表达产物的特异性结合活性。结论构建了重组hBMP-2的基因工程菌,并在毕赤酵母中实现了高效分泌表达,为进一步研究其活性和功能奠定了基础。     

人骨形成蛋白4成熟肽cDNA的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的：克隆编码人骨形成蛋白4(hBMP4)成熟肽的cDNA基因,并在大肠杆菌中表达．方法：从人胎盘组织中提取总RNA,以其为模板,采用RT—PCR方法得到编码hBMP4的成熟肽段(hBMP4m)cDNA,克隆入表达载体pDH2中,转化大肠杆菌DH5α,温度诱导表达．结果：获得hBMP4m cDNA基因,成功克隆入温度诱导表达载体pDH2,DNA序列分析证实所插入的hBMP4m cDNA序列与设计预期一致;将获得重组表达质粒pDH2-hBMP4m转化大肠杆菌DH5α中,经温度诱导,目的蛋白占细菌总蛋白的41．5％．结论：采用分子克隆的方法得到编码hBMP4成熟肽段的cDNA,克隆入表达载体,在大肠杆菌中成功获得hBMP4成熟肽的高效表达。     

骨形成蛋白研究进展

骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)是一类典型的酸性糖蛋白,是乙型转化生长因子(TGF-β)超家族的成员之一,它们能够诱导促进软骨和骨的形成,并可与多种不同性质的载体复合[1],组成各种类型的有生物诱骨活性的骨修复材料,在矫形外科领域有着广泛的应用前景及重要的应用意义.目前,国内外有多家研究机构对此进行研究,以期对其特质有更深入的了解.为此特将BMPs近年研究进展及其生物调节机制作一综述,以对其有一全面认识.     

重组人骨形态发生蛋白-2在大肠杆菌中的表达及纯化

目的用基因工程技术在大肠杆菌中表达人骨形态发生蛋白-2(hBMP-2)。方法hBMP－2原核表达载体pYR(pBV220－hBMP-2)转化 E coli BL21,SDS－PAGE分析工程菌活化状态以及诱导时间与目的蛋白表达率的关系。离子交换层析 DEAE和分子筛 S－300纯化重组蛋白,自然缓降复性法对其复性。结果SDS－PAGE显示在相对分子质量约为13000时出现明显外源蛋白表达带,而且当工程菌30℃活化至D600约为0．45时,其表达效率较高;在此状态下,温度诱导衣达4h,目的蛋白表达量最高,以后随着时间的延长,表达量稍下降。重组蛋白经纯化后植人小鼠肌肉,组织学观察到肌肉内大量间允质细胞增生以及软骨与骨形成。结论重组hBMP－2具有良好异位成骨活性。     

人骨形成蛋白2和人骨形成蛋白7成熟肽编码区基因克隆和真核表达载体的构建

目的克隆和构建人骨形成蛋白2(BMP-2)和人骨形成蛋白7(BMP-7)成熟肽真核表达载体。方法采用Trizol法从人骨肉瘤细胞中提取制备总RNA,利用RT-PCR、PCR转录、扩增BMP-2和BMP-7获得成熟肽基因,与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接,构建真核表达重组子pcDNA3.1(+)/BMP-2MP和pcDNA3.1(+)/BMP-7MP。结果总RNA提取液电泳可见在28S、18S和5S处出现明显的条带,PCR和酶切可在439bp和364bp出现条带,阳性克隆测序结果与Genebank中登录的序列一致。结论成功克隆出人BMP-2MP和BMP-7MP基因,成熟肽基因已与pcDNA3.1(+)连接,成功构建其真核表达重组子pcDNA3.1/BMP-2MP和pcDNA3.1/BMP-7MP,为进一步研究BMP-2、BMP-7的功能及其成熟肽基因在骨髓间充质细胞(hMSCs)中表达以及在骨组织工程中的应用研究奠定了基础。     

人骨形成蛋白2和7成熟肽编码区基因克隆和真核表达载体的构建

[摘要] 目的 克隆和构建人骨形成蛋白2和人骨形成蛋白7成熟肽真核表达载体。方法 采用Trizol法从人骨肉瘤细胞中提取制备总RNA,利用RT-PCR、PCR转录、扩增BMP-2和BMP-7获得成熟肽基因,与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接,构建真核表达重组子pcDNA3.1(+)/BMP-2MP和pcDNA3.1(+)/BMP-7MP。结果 总RNA提取液电泳可见在28S、18S和5S处出现明显的条带,PCR和酶切可在439bp和364bp出现条带,阳性克隆测序结果与Genebank中登录的序列一致。结论 成功克隆出人BMP-2MP和BMP-7MP基因,成熟肽基因已与pcDNA3.1(+)连接,成功构建其真核表达重组子pcDNA3.1/BMP-2MP和pcDNA3.1/BMP-7MP,为进一步研究BMP-2、BMP-7的功能及其成熟肽基因在骨髓间充质细胞(hMSCs)中表达以及在骨组织工程中的应用研究奠定了基础。     

hBMP7瞬时转染对兔骨髓间充质干细胞生物学行为的影响

[目的]运用人骨形成蛋白hBMP7(human bone morphogenetic protein-7,hBMP-7)基因体外转染兔骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),观察瞬时转染对兔MSCs生物学行为的影响.[方法]密度梯度离心法培养兔MSCs,在体外分别转染pcDNA1.1/AMP-hBMP7和pcDNA1.1/AMP并留置空白对照.检测转染基因的转录和表达,观察细胞形态和生长情况,检测碱性磷酸酶、钙结节和骨钙素等成骨细胞表型.[结果]hBMP-7基因存在于转染后的骨髓间充质干细胞中并表达相应的mRNA.目的基因表达后细胞形态略有变化,生长曲线与未诱导组无明显变化,钙结节形成,碱性磷酸酶增加,骨钙素表达增强.电镜见胞质中有钙质成分.[结论]hBMP-7基因可促进兔MSCs向成骨细胞表型转化.hBMP-7基因转染的MSCs有望成为组织工程化骨理想的种子细胞.     

重组人骨形成蛋白—2成熟肽在大肠杆菌中的高效表达

利用大肠杆菌系统高效表达人骨形成蛋白－２成熟肽。方法；将编码人骨形成蛋白２成熟肽的基因片段克隆到大肠杆菌表达载体ｐＤＨ上，使其受控于ＰＲＰＬ启动子，构建成表达质粒ｐＤＨＢ２ｍ，以大肠杆菌ＤＨ５α为宿主菌。对工程菌进行温度诱导表达，表达产物初步纯化后进行复性处理，用小鼠肌袋模型检测产物诱骨活性。     

BMSCs胶原刮膜对松质骨缺损的修复

目的 研究成骨蛋白-2(hBMP-2)基因转染骨髓间充质千细胞(BMSCs)胶原刮膜对兔股骨髁松质骨缺损的修复能力。方法 应用影像学、组织学、形态计量学和生物力学等方法,观察未经诱导、OS液诱导和hBMP-2基因转染BMSCs胶原刮膜植入兔股骨髁部直径6 mm、深12 mm松质骨缺损后的修复情况。结果 未经处理的兔股骨髁缺损不能自行愈合;细胞刮膜植入对股骨髁松质骨缺损的修复能力,在8和12周时hBMP基因转染BMSCs组>OS液诱导BMSCs组>未诱导BMSCs组(P<0.05),12周时hBMP基因转染BMSCs组的骨缺损区生物力学强度接近正常松质骨。结论 hBMP基因转染BMSCs胶原刮膜是治疗大块松质骨缺损的理想修复材料。     

骨形态发生蛋白的信号传导通路及其拮抗因子

骨形态发生蛋白(BMPs)是一类属于转化生长因子-β超家族的多功能生长因子,具有诱导骨、软骨组织再生的能力.BMPs通过信号传导通路,引起靶基因的转录和表达.BMPs的生物学活性受多个水平的调控.本文着重就BMPs的信号传导通路及相关负性调控的研究进行综述.     

经转染人骨形态发生蛋白7基因后骨髓间充质干细胞mRNA的表达

目的 构建人骨形态发生蛋白（human bone morphogenetic protein7，hBMP－7）逆转录病毒载体并检测经逆转录病毒介导基因转染的兔骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cell,MSCs)mRNA的表达。方法 构建hBMP-7逆转录病毒载体后利用脂质介导的基因转移技术转染包装细胞PT67，制备含目的基因的重组逆转录病毒液并感染兔骨髓间充质干细胞，采用原位杂交、RT－PCR检测hBMP－7mRNA在MSCs中的表达。结果 成功构建了hBMP-7逆转录病毒载体，经hBMP－7基因转染的MSCs可表达外源性BMP－7mRNA。结论 采用逆转录病毒介导的方法可以将hBPM－7转染至MSCs中并表达外源性基因。     

不同降解率β-TCP/rhBMP-2 复合人工骨的研制及骨诱导活性检测

骨缺损修复是骨科领域的重要课题,除使用生物材料外,人工材料也被广泛应用.但目前尚无理想的人工骨材料.为适应临床上不同植骨的需求,我们研制出了不同降解率的β-磷酸三钙(β-TCP),将其与基因重组人骨形成蛋白-2(rhBMP-2)复合制备成不同降解率的β-TCP/rhBMP-2复合人工骨并对其异位诱导成骨活性进行评价.     

hBMP-2真核表达载体的构建及转染兔骨髓间充质干细胞的表达

目的:构建pcDNA3.1-hBMP2真核表达质粒并检测其在兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)中的表达.方法:采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从人骨肉瘤中扩增出人骨形成蛋白-2(hBMP2)基因片段,构建成pcDNA3.1-hBMP2重组质粒.转染兔骨髓间充质干细胞并通过RT-PCR和免疫组化检测其表达.结果:本实验构建的重组质粒目的基因片段为hBMP2-cDNA.经RT-PCR和免疫组化证实,转染pcDNA3.1-hBMP2后的兔骨髓间充质干细胞内有大量hBMP2 mRNA的转录和蛋白的表达.结论:本实验成功构建hBMP2真核表达质粒并在骨髓间充质干细胞中得到表达,为进一步研究用BMP2基因转染的方法来加速牵张成骨新骨形成奠定了基础.     

人骨形态发生蛋白-2基因腺病毒载体异位成骨

目的：评价人骨形态发生蛋白2(hBMP-2)基因腺病毒表达载体(recombinant adenoviral vector carrying the human BMP-2 gene, AdBMP-2)成骨能力并探讨其成骨机制。方法：应用 AdBMP-2体外感染兔骨髓间质干细胞（BMSC），7 d后观察hBMP-2和碱性磷酸酶(ALP)的表达,21 d后观察感染细胞钙结节形成能力。同时将AdBMP-2行裸鼠腓 肠肌组织内注射，术后20 d取材，观察hBMP-2的表达及肌组织内异位成骨情况。结果：AdBMP-2可高效感 染BMSC并获得hBMP-2的有效表达，ALP表达增高并形成钙结节。AdBMP-2在体内同样表达hBMP-2， 并且以软骨化骨的方式启动成骨。结论：感染AdBMP-2的BMSC向成骨细胞分化，AdBMP-2在体内有着良好的成骨能力。     

重组人骨形成蛋白-7成熟肽的表达、纯化及活性的研究

目的:研究重组人骨形成蛋白-7(rhBMP-7m)羧基端140个氨基酸成熟肽的大肠杆菌表达、纯化及活性,为其实际应用打下基础.方法:将编码此成熟肽的cDNA亚克隆入含PL启动子的表达质粒pDH2中,构建表达质粒pDH2-B7m,转化大肠杆菌DH5α,温度诱导表达;通过包涵体洗涤、离子交换层析纯化目的蛋白;用Western blot验证透析复性后表达蛋白的抗原性,用含荧光素酶报告基因专门用于检测BMP活性的细胞株C2C12-K4检测其活性.结果:成功构建了PL启动子控制的原核表达载体pDH2-B7m;42℃诱导5 h后表达量达到最高水平,约占菌体总蛋白40.3%,表达产物以包涵体形式存在.包涵体经洗涤、离子交换层析纯化,目的蛋白纯度至少在96.0%以上.Western blot实验证实其抗原性,细胞株C2C12-K4反应的检测表明透析复性后的rhBMP-7m有较强的活性.结论:成功地在E.coli中表达了hBMP-7m重组蛋白并证明其有较强的生物活性.     

BMPs与wnt-3a促进C3T3-E1细胞成骨作用的研究

【目的】 在促进MSCs骨形成的众多调节因子中,骨形成蛋白(BMPs)家族在胚胎发育及骨骼形成中扮演重要的角色。目前发现的BMPs家族成员骨诱导活性中,具有成骨活性的有 BMP2、7、9 亚型。除了BMP通路外,wnt通路在骨形成中也起到了重要的作用。本实验旨在进行BMP-2/wnt-3a、BMP-7/wnt-3a、BMP-9/wnt-3a三种联合转染,观察感染后细胞各基因和蛋白的干扰效率及细胞体外成骨分化的影响,评价三种转染的成骨分化能力的强弱,并与单独转染效果进行比较。 【方法】 以cDNA文库为模版,应用PCR方法获得BMP2、BMP7、BMP9、wnt-3a基因的编码序列,经大肠杆菌转化后抽取质粒,构建基因表达质粒载体,酶切鉴定重组体并且经测序进一步确定。然后用pLP/VSVG、pLP2、pLP1质粒与BMP2、BMP7、BMP9、wnt-3a共转染293FT细胞。包装pELNS-BMP2、BMP7、BMP9、wnt-3a后转染小鼠间充质干细胞MC3T3-E1细胞,GFP荧光证实转染效果。茜素红染色检测钙结节,蛋白质印迹和real-time PCR检测成骨相关基因(Runx2)的表达水平,鉴定各成骨诱导因子的单独转染效能。最后用双基因联合转染(BMP-2/wnt-3a,BMP-7/wnt-3a,BMP-9/wnt-3a三组)MC3T3-E1细胞,GFP荧光证实转染效果;应用ELISA检测MC3T3-E1细胞培养上清中BGP和ALP的表达水平;应用real-time PCR检测Runx2 mRNA的表达水平;应用蛋白质印迹法检测蛋白的表达水平,鉴定双基因联合转染的成骨分化效能。 【结果】 pELNS-BMP2、pELNS-BMP7、pELNS-BMP9、pELNS-wnt3a表达质粒构建成功。重组慢病毒pELNS-BMP2、pELNS-BMP7、pELNS-BMP9、pELNS-wnt3a构建成功,成功转染MC3T3-E1细胞;Runx2表达水平:BMP2>BMP9>BMP7;茜素红染色显示BMP-2钙结节数量最多。双基因联合转染MC3T3-E1细胞,GFP荧光证实转染成功;蛋白质印迹与real-time PCR法显示三组联合转染Runx2表达水平比单独转染明显上升,且联合转染Runx2表达水平:BMP-2/wnt-3a>BMP-9/wnt-3a>BMP-7/wnt-3a; BGP表达与 ALP表达亦然。 【结论】 BMPs能促进间充质干细胞向成骨细胞分化, 其中BMP2成骨效果最好。而BMPs与wnt-3a的联合转染成骨效果高于单独转染,说明BMP通路与wnt通路有协同作用。其中BMP-2/wnt-3a双基因联合转染比另两种转染(BMP-7/wnt-3a和BMP-9/wnt-3a)成骨效能更高。这为组织工程骨重建研究提供了重要的理论依据和技术支持。     

hBMP-2真核正反义表达载体的构建及鉴定

0 引言人骨形成蛋白-2(human Bone Morphogenetic Protein-2,hBMP-2)具有显著的诱骨功能,此外有研究[1]表明,它在胚胎发育、神经胶质细胞发育及诱导细胞凋亡方面也起着重要作用. 最新研究[2～4]证明它对生物体的抗辐射及造血功能也有重要意义. 国外许多学者对BMP诱骨作用机理进行了初步探讨,而hBMP-2在造血作用机理方面的研究较少,鉴于此,我们以pcDNA3为载体,构建了hBMP-2的真核表达载体pcD-B2. 同时我们还得到了hBMP-2反义表达载体pcD-AnB2,为进一步研究hBMP-2的作用机理,尤其是其在造血以及抗放射病方面的作用机理创造了条件.     

hBMP2和hVEGF165双基因修饰组织工程骨的构建及检测

目的 构建hBMP2和hVEGF165双基因修饰的组织工程骨并检测其表达情况.方法 构建hVEGF165和hBMP2真核表达质粒,并转染至兔成骨细胞,以DPB为支架,构建双基因修饰的组织工程骨,同时采用RT-PCR和Western blot对两种基因表达情况进行检测.结果 转染hBMP2和hVEGF165的成骨细胞可以在DPB上贴附生长,并且体外表达时间可持续7 d.结论 成功构建双基因修饰组织工程骨,且能有效表达,为其用于大段骨缺损修复奠定了实验基础.     

骨形态发生蛋白与肝脏关系研究进展

骨形态发生蛋白(BMPs)属于转化生长因子超家族,其在骨的再生和修复中起重要作用。许多的研究还发现,BMP不但调节胚胎肝的形成与发育,还调节成年肝组织的再生和修复,其过程涉及基因表达、生长因子的产生及形态结构塑造等方面的变化,其作用主要通过BMPs受体与Smad蛋白磷酸化等信号转导途径而完成。这说明BMPs与肝脏之间可能存在某些关系,文章就此问题及近年来的研究进展予以综述。