鱼藤酮对多巴胺能神经元的神经毒性作用

目的　探讨鱼藤酮 (rotenone)对多巴胺能神经元的神经毒性作用的机制。方法　用神经生长因子 (NGF)将PC12细胞诱导分化成多巴胺能神经元的细胞模型 ,经不同浓度的鱼藤酮处理 ,观察细胞形态改变 ,四甲基偶氮唑盐 (MTT)法检测细胞活性及代谢状态 ,磷脂酰丝氨酸外翻法(Annexin V)检测细胞凋亡 ,流式细胞术检测细胞凋亡率 ,α synuclein、硫磺素T(thioflavinT)染色研究细胞内蛋白聚集情况。结果　经鱼藤酮处理 2 4h后PC12细胞突起样结构消失 ,细胞体积变小、形态变圆 ;随着鱼藤酮浓度或作用时间增加 ,细胞活性进一步下降 ,呈量效和时效依赖性。与对照组比较 ,细胞活力在浓度为 10nmol/L鱼藤酮作用 2 4h时即出现明显下降 ,吸光度A570 值为 0 4 15± 0 0 13(P <0 0 5 ) ;可见Annexin V呈阳性的早期凋亡细胞 ;凋亡率在 5nmol/L为 7 35 %± 0 5 2 % (P <0 0 5 ) ,在 10nmol/L为 13 30 %± 1 80 % (P <0 0 1) ;细胞内出现α synuclein和硫磺素T双标染色呈阳性的蛋白聚集。结论　鱼藤酮在体外对多巴胺能神经元有毒性作用 ,可诱导出现细胞凋亡并出现类包涵体 ,表明鱼藤酮可能通过影响α synuclein的代谢而在帕金森病发病机制中起作用。     

鱼藤酮诱导细胞内泛素化α-synuclein聚集选择性损伤多巴胺神经元

目的探讨鱼藤酮对多巴胺能神经元内泛素化-αsynuclein聚集的影响及其细胞损伤作用。方法应用鱼藤酮处理经NGF诱导的神经元样分化的PC12细胞株(多巴胺能神经元)与N2a细胞株(非多巴胺能神经元)4、8、16、24 h以及用利血平预处理PC12细胞4 h再加入鱼藤酮处理16 h;采用免疫荧光双标记方法在共聚焦显微镜下观察细胞内泛素化-αsynuclein聚集,以MTT法和流式细胞术分别检测PC12细胞活力及凋亡率。结果单用鱼藤酮处理16 h后,PC12细胞株与N2a细胞株相比较,免疫荧光双标记显示PC12细胞内泛素化-αsynu-clein发生明显聚集,并且鱼藤酮对PC12细胞株的作用具有时间依赖性,而N2a细胞内泛素化-αsynuclein聚集不明显。利血平耗竭PC12细胞内多巴胺后再经鱼藤酮处理,PC12细胞内泛素化-αsynuclein聚集不明显;经不同浓度鱼藤酮处理后,细胞活力呈剂量依赖性下降;与对照组相比,经20 nmol/L鱼藤酮处理4、16、24 h后细胞存活率分别为(81.6±12.3)%、(59.8±6.7)%和(52.2±7.4)%(P<0.01)。鱼藤酮处理后出现早期凋亡细胞,随着处理时间的延长细胞凋亡率逐渐上升(P<0.01)。结论鱼藤酮选择性作用于多巴胺能神经元,使细胞内泛素化-αsynuclein发生聚集,而且这种变化具有时间依赖性,最终导致细胞发生凋亡,然而鱼藤酮对非多巴胺能神经元作用不明显。同时,鱼藤酮诱导泛素化-αsynuclein发生聚集的作用与神经元的特性存在密切关系。     

热休克蛋白对多巴胺能神经细胞的保护作用研究

目的探讨热休克蛋白(HSP)对蛋白酶体抑制剂处理的多巴胺能神经细胞的活力以及细胞内包涵体形成的影响。方法将PC12细胞进行热处理,免疫印迹法鉴定热休克蛋白表达,并确定最佳热处理条件;再应用高选择性的蛋白酶体抑制剂Lactacystin处理PC12细胞。MTT方法检测细胞活力,免疫荧光细胞化学染色观察细胞内包涵体形成的变化。结果免疫印迹法证实PC12细胞热处理2h后HSP70水平即开始迅速升高,一直持续至24h,其中4h的HSP70水平表达较高,故选其为最佳观察条件。未经热处理的对照组经5μM、10μM、15μM和20μMLactacystin处理24h后,PC12细胞的活力显著降低,呈剂量依赖性;热处理组的细胞活力比对照组显著升高,两者有显著性差异(P<0.01)。免疫荧光染色显示对照组细胞的胞浆内包涵体明显增多,而热处理组胞浆内包涵体明显减少。结论热休克蛋白能显著增强细胞活力,减少细胞内包涵体形成,对多巴胺能神经元可能有一定的保护作用。     

过氧化氢对多巴胺神经元的选择性损伤作用

目的探讨过氧化氢(H2O2)对多巴胺能神经元的选择性损伤作用。方法用神经生长因子将PC12细胞诱导分化成多巴胺能神经元模型,以N2a细胞作为对照,2组细胞共同经H2O2处理后,在激光扫描共聚焦显微镜下观察细胞内α-synuclein异常修饰和聚集以及细胞形态改变;PC12细胞经利血平耗竭多巴胺后用H2O2处理,并观察α-synuclein异常修饰和聚集及细胞形态变化。结果H2O2处理的PC12细胞胞浆内逐渐出现泛素化的α-synuclein聚集,细胞轴突回缩消失,胞体变圆、变小,胞核变大,N2a细胞及利血平耗竭多巴胺的PC12细胞经H2O2处理后细胞胞浆内无α-synuclein聚集。结论H2O2能选择性引起多巴胺能神经元胞浆内泛素化α-synuclein蛋白的异常聚集,并导致细胞退行性变,该现象可能与神经元内源性多巴胺有关。     

姜黄素通过清除小胶质细胞内活性氧类物质保护多巴胺能细胞

目的探讨小胶质细胞在多巴胺能细胞损伤中的作用,以及姜黄素通过抑制小胶质细胞反应保护多巴胺能细胞的机制。方法选用大鼠嗜铬细胞瘤株PC12细胞,利用鱼藤酮诱导其损伤建立帕金森病细胞模型,用姜黄素预处理4 h的小胶质细胞(BV-2)再经鱼藤酮处理4 h后的细胞上清作为条件培养液(microglia conditioned medium with curcumin,MCMC)处理PC12细胞,并设空白对照组。应用四甲基偶氮唑盐法(MTT法)检测细胞活力;DCFH-DA染色检测BV-2细胞内活性氧类物质(ROS)水平;磷脂结合蛋白(annexinⅤ)-碘化丙啶(PI)双染色流式细胞仪检测PC12细胞凋亡。结果 5nM鱼藤酮单独作用于PC12细胞,其存活率及凋亡率与空白组相比无明显差别(P>0.05);与对照组相比,姜黄素预处理的BV-2细胞,其ROS水平降低(P<0.01);受MCMC处理的PC12细胞,与对照组比较,细胞活力增加,细胞凋亡率降低(P<0.01)。结论鱼藤酮通过激活小胶质细胞产生ROS,损伤多巴胺能细胞。姜黄素通过抑制小胶质细胞反应,清除小胶质细胞内ROS,从而保护多巴胺能细胞。     

α-触核蛋白在帕金森病发病机制中作用的研究

目的　探讨α 触核蛋白的异常聚集在帕金森病发病机制中的作用。方法　以PC12细胞为多巴胺能神经元的细胞模型 ,应用Hoechst 332 5 8核染色法、流式细胞术 (FCM)、TdT末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)等方法 ,检测α 触核蛋白片段 (NAC ,thenon β amyloidcomponent)聚合物对PC12细胞凋亡的影响。 结果　NAC聚合物 10、15、2 0 μmol/L浓度组 ,Hoechst332 5 8核染色法可见染色质浓聚、核固缩和凋亡小体 ;FCM显示凋亡峰出现 ,3个组的凋亡率分别为 (19 75± 1 87) % ,(30 37± 2 35 ) % ,(4 3 1± 5 4 1) % ,较对照组 (3 5 2± 0 4 6 ) %显著增高 (P均小于 0 0 5 ) ,3个组两两之间也存在差异 (F =6 4 2 9,P <0 0 1) ;TUNEL可检测到凋亡细胞DNA发生双链断裂。对照组和 2 5 μmol/L浓度组未发现凋亡。 结论　一定浓度的NAC聚集物可以诱导PC12细胞发生凋亡 ,提示体内发现的α 触核蛋白异常聚集可能通过诱导多巴胺能神经元发生凋亡这一机制参与该病的发病。     

线粒体KATP通道开放剂对多巴胺能神经细胞的保护作用研究

目的研究线粒体KATP通道的开放对于鱼藤酮诱导的细胞凋亡的保护作用并初步探讨其机制。方法用神经生长因子(NGF)将PC12细胞诱导分化成多巴胺能神经元模型,经鱼藤酮和线粒体KATP通道的开放剂二氮嗪及选择性线粒体KATP通道拮抗剂5-羟葵酸(5-HD)处理,用台盼蓝染色和四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞活力,磷脂酰丝氨酸外翻法(Annexin V)检测细胞的凋亡,JC-1检测线粒体膜电位的变化。结果经鱼藤酮处理24h后PC12细胞突起结构消失,细胞体积变小,形态变圆,台盼蓝染色阳性细胞增多,细胞活力下降,可见An-nexin V阳性的早期凋亡细胞,凋亡率为31.1%±2.65%(P<0.01);同时加入二氮嗪能减少PC12细胞的凋亡,凋亡率为17.9%±0.71%(P<0.05);JC-1染色法证实二氮嗪可稳定线粒体膜电位。而同时加入5-HD的PC12细胞活力及线粒体膜电位与鱼藤酮处理组相比无变化。结论鱼藤酮可引起多巴胺神经元的凋亡,线粒体KATP通道的开放剂二氮嗪能够拮抗鱼藤酮的毒性作用,其机制可能是通过在线粒体膜电位降低时稳定线粒体膜电位而起到对多巴胺能细胞的保护作用。     

多巴胺对鱼藤酮细胞毒性介导作用研究

目的探讨多巴胺在鱼藤酮细胞毒性损伤中的作用。方法采用鱼藤酮(1μmol/L)处理PC12细胞,噻唑蓝比色法检测细胞活性,流式细胞术检测DHR123荧光强度;并采用多巴胺耗竭剂-利血平预处理3小时,观察上述指标。结果 1μmol/L鱼藤酮处理PC12细胞24小时,导致细胞活力较正常组显著下降(P<0.05),吸光度为0.730±0.01(正常组为1.112±0.025);利血平(1μmol/L和5μmol/L)预处理后再给予鱼藤酮,孵育24小时后,吸光度分别为0.945±0.02和1.06±0.03,细胞活力较鱼藤酮组显著升高(P<0.05)。鱼藤酮处理24小时,过氧化物水平升高至正常组的281%,而利血平(1μmol/L和5μmol/L)预处理后,分别降至正常组的248%和232%,与鱼藤酮组比较有显著差异(P<0.05)。结论多巴胺介导了鱼藤酮对多巴胺能细胞的毒性作用。     

溶酶体自噬途径降解α-synuclein蛋白作用研究

目的 探讨α-synuclein蛋白细胞内溶酶体途径降解机制.方法 用神经生长因子NGF诱导分化PC12细胞作为研究多巴胺能神经元的细胞载体,应用鱼藤酮处理PC12细胞建立α-synuclein蛋白细胞模型.使用溶酶体途径降解抑制剂E64处理神经元样分化的PC12细胞,应用免疫荧光双标方法观察PC12细胞内硫黄素S、α-synuclein蛋白阳性聚集包涵体形成情况,比较各组的差异.结果 用E64处理鱼藤酮预处理过的PC12细胞后α-synuclein蛋白聚集且较多包涵体形成(15.36±0.85)%,与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05).结论 溶酶体自噬途径可能在α-synuclein蛋白降解、聚集和多巴胺神经元死亡过程中发挥重要作用.     

丙炔苯丙胺对鱼藤酮致多巴胺能神经细胞损伤的保护机制研究

目的:探讨丙炔苯丙胺对多巴胺能神经细胞保护机制的研究。方法:用神经生长因子(NGF)将PC12细胞诱导分化成多巴胺能神经元的细胞模型,经鱼藤酮处理后给予不同浓度的丙炔苯丙胺,观察细胞形态改变,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞活性及代谢状态,磷脂酰丝氨酸外翻法(Annexin-V)检测细胞凋亡,JC-1检测线粒体膜功能及DCFH-DA检测细胞内ROS。结果:经鱼藤酮处理24h后PC12细胞突起样结构消失,应用丙炔苯丙胺后细胞形态逐渐变大,突起也有恢复,细胞贴壁能力增强,与鱼藤酮组比较,在丙炔苯丙胺50μmol·L-1作用24h时即出现细胞活力恢复,A570值为0.39±0.01(P<0.01);Annexin-V检测凋亡细胞明显减少;JC-1检测丙炔苯丙胺处理组的线粒体膜电位较鱼藤酮处理组有明显恢复,DCFH-DA检测鱼藤酮组ROS水平升高,丙炔苯丙胺组ROS降低。结论:鱼藤酮在体外对多巴胺能神经元有毒性作用,丙炔苯丙胺能够明显减少鱼藤酮诱导的PC12细胞的死亡。其机制可能是抑制氧化应激及拮抗细胞凋亡。     

泛素-蛋白酶体抑制剂诱导细胞内泛素化α-synuclein聚集选择性损伤多巴胺神经元

目的 探讨多巴胺(DA)神经元诱变剂对细胞内泛素化α-synuclein聚集的影响及其细胞损伤作用.方法 应用MPP+、特异性泛素-蛋白酶体系统(UPS)抑制剂lactacystin及H2O2处理神经生长因子(NGF)诱导的PC12细胞株与N2a细胞株16 h后,采用免疫荧光双标记的方法在共聚焦显微镜下观察细胞内泛素化α-synuclein聚集,比较三种诱变剂对这两种细胞株作用的差异.在PC12细胞中加入不同终浓度的lactacystin处理24 h,MTT方法检测PC12细胞活力.10μmol/Llactacystin处理PC12细胞不同时间,流式细胞术检测PC12细胞的早期凋亡率.结果 经三种诱变剂处理后,MPP+和lactacystin选择性地诱发PC12细胞内泛素化α-synuclein聚集且以lactacystin的作用更为显著,N2a细胞则无明显的泛素化α-synuclein聚集.H2O2作用于PC12细胞的效应与MPP+相近,但仅引起N2a细胞内少量泛素化α-synuclein聚集.经lactacystin处理后的PC12细胞活力呈剂量依赖性下降;5 μmol/L、10μmol/L和20 μmol/L lactacystin处理24 h后细胞存活率分别为79.5%±2.1%、49.3%±3.2%和31.2%±2.8%(与对照组相比,均P＜0.01).流式细胞术显示lactacystin处理后PC12细胞早期出现凋亡细胞,并且随着处理时间的延长,细胞凋亡率逐渐增加.结论 特异性UPS和线粒体呼吸链抑制剂选择性作用于DA神经元,诱导细胞内泛素化α-synuclein聚集,终使细胞发生凋亡,而以氧化应激为主要损伤途径的诱变剂的作用则不具有选择性.     

姜黄素对多巴胺能细胞的保护作用研究

目的探讨姜黄素对多巴胺能细胞的保护作用及机制。方法采用神经毒素鱼藤酮(1μmol/L)处理经神经生长因子(NGF)(50 ng/ml×7)诱导分化过的PC12细胞,并在处理前6 h加入1μmol/L的姜黄素进行干预,MTT法检测细胞活力,荧光分光光度法检测细胞内活性氧水平,比色法检测还原型谷胱甘肽(GSH)含量。结果 NGF诱导后的PC12细胞经1μmol/L鱼藤酮处理24 h后,细胞活力下降至对照组的57.1%,细胞内活性氧水平为对照组的189%,而GSH水平显著下降(P<0.05);姜黄素干预后,与鱼藤酮组相比,细胞活力和GSH含量显著提高,活性氧水平显著降低(P<0.05)。结论姜黄素对多巴胺细胞具有保护作用,其机制与抗氧化活性有关。     

Lactacystin诱导PC12细胞致帕金森病的实验研究

目的应用蛋白酶体抑制剂Lactacystin构建帕金森病细胞模型,从泛素-蛋白酶体功能角度探讨帕金森病的发病机制。方法Lactacystin(0、5、10、15和20μmol/L)分别处理PC12细胞24h,MTT法检测细胞活力;HE染色观察包涵体生成;免疫组织化学法观察α-synuclein在胞内聚集情况;AO/EB双染及电镜检测细胞凋亡。结果10μmol/L Lactacystin作用24h后细胞活力开始显著低于对照组(P<0.01),随着浓度大,细胞活力进一步下降,呈浓度依赖性(P<0.01);HE染色显示胞浆核周出现圆形或椭圆形嗜伊红的包涵体;免疫组化显示包涵体α-synuclein染色呈强阳性;10μmol/L Lactacystin作用细胞24h后AO/EB双染提示细胞早期凋亡;电镜显示细胞核变小偏位,部分胞核固缩、趋边、凝聚。结论Lactacystin对多巴胺能神经元有毒性作用,可形成胞浆内包涵体并诱导细胞凋亡。蛋白酶体功能异常可能在帕金森病发病机制中发挥重要作用。     

N-乙酰半胱氨酸对PC12细胞的保护作用研究

目的探讨N-乙酰半胱氨酸（NAC）对PC12细胞的保护作用及其机制。方法采用神经毒素1μmol/L鱼藤酮处理PC12细胞24h,并在处理前30min加入500μmol/L的NAC进行干预,流式细胞术检测PC12细胞的凋亡率和活性氧水平,比色法检测还原型谷胱甘肽（GSH）水平。结果PC12细胞经1μmol/L鱼藤酮处理24h后,细胞凋亡率达41.9%,细胞内活性氧水平较对照组显著提高,而GSH水平显著下降（P〈0.05）;NAC干预后,能够明显抑制鱼藤酮的细胞毒性作用,与鱼藤酮组相比,细胞凋亡率和活性氧水平显著降低,GSH含量明显增加（P〈0.05）。结论在帕金森病（PD）的细胞模型中,通过NAC的干预,能够明显保护PC12细胞,其保护机制与抗氧化能力有关。     

西酞普兰、氟西汀对NGF诱导的PC12细胞活性以及TH和pERK1／2表达的影响

目的观察西酞普兰和氟西汀两种药物对PC12细胞活力及酪氨酸羟化酶（TH）和磷酸化细胞外信号调节激酶（pERK1／2）表达的影响。方法以NGF诱导后的PC12细胞作为细胞模型,给予5,10,20,50gm不同剂量西酞普兰和氟西汀,分别进行直接作用和保护作用处理24或48h（直接作用为直接给予不同剂量齐拉西酮,保护作用为直接作用后再进行12h的去血清损伤）。采用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测细胞活性,免疫组织化学检测TH和pERK1／2的表达水平的变化。结果分别处理24h后,两种药物在剂量为20μm时均可促进PC12细胞的活性（与对照组相比较,P〈0．01）,而且相同浓度的两种药物对细胞活力的作用没有统计学差异（P〉0．05）。药物作用48h后,西酞普兰10μm组对PC12细胞活力具有保护作用（与对照组相比较,P〈0．05）,西酞普兰20μm组对PC12细胞活力的促进作用和保护作用均高于氟西汀20μm组（P〈0．05）,而且氟西汀在作用48h后对细胞表现出毒性作用（与对照组相比较P〈0．01）;PC12细胞TH和pERK1／2的表达随着药物浓度5μm到20μm逐渐升高,但是在药物浓度为50μm时表达下降,其中氟西汀50μm时TH和pERK1／2的表达低于对照组（P〈0．01）;西酞普兰20μm组TH和pERK1／2的表达均高于氟西汀20μm组（P〈0．05）。结论中剂量的西酞普兰和氟西汀两种药物对PC12细胞活力都有促进作用,都可促进TH的表达,而且这种作用可能是通过ERK途径产生的;西酞普兰对PC12细胞的保护作用优于氟西汀,而且高剂量的氟西汀表现出细胞毒性作用。     

溶血磷脂酸诱导PC12细胞凋亡的机制研究

目的 探究溶血磷脂酸诱导PC12细胞凋亡的机制并提出干预措施。方法 实验1:不同浓度LPA(0 μM 、10 μM、20 μM、40 μM)处理PC12细胞24 h; 实验2:LPA(40 μM)分别处理PC12细胞不同时间(0 h、6 h、12 h、24 h); 实验3:正常组(0 μM LPA)、LPA组(40 μM LPA)和干预组(5 μM SP600125预处理2 h+40 μM LPA)培养24 h; CCK-8检测细胞活力; TUNEL染色检测细胞凋亡比例; WesternBlot检测Bcl2、caspase 3、磷酸化JNK水平。结果 LPA以时间依赖和浓度依赖的方式使PC12细胞的细胞活力和Bcl2水平降低,而使PC12细胞的凋亡指数和caspase 3水平增高; SP600125(5 μM)预处理不仅明显阻断LPA诱导的PC12细胞活力下降、细胞凋亡,并且极大地抑制了LPA诱导的JNK通路的激活、Bcl2水平的下调和caspase 3水平的上调。结论 JNK特异性抑制剂SP600125预处理能够明显阻断LPA诱导的PC12细胞损伤。     

细胞外信号调节激酶参与调节鱼藤酮介导的嗜铬细胞瘤细胞损伤

目的 探讨细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)1/2在鱼藤酮介导的多巴胺能细胞损伤中的信号调节机制.方法 鱼藤酮处理体外培养的大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(PC12)细胞株,建立帕金森病细胞模型.采用二甲基噻唑二苯基四唑溴盐(MTT)比色法检测鱼藤酮对PC12细胞活力的影响,免疫组织化学方法观察鱼藤酮对磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)表达的影响,免疫印迹法研究p-ERK1/2蛋白表达随时间变化的趋势,并检测ERK1/2上游激酶抑制剂PD98059对鱼藤酮诱导ERK1/2磷酸化及细胞活力的影响.结果 PC12细胞随鱼藤酮(5 μmol/L)作用时间的增加,细胞吸光度(%)出现下降,1 h降至对照组的75.46±5.47,2、4、8 h分别降至70.42±1.94、65.23±0.96、59.04±2.85,24 h降至29.64±1.63,各时间点差异有统计学意义(F=143.014,P=0.000);与对照组(100.00±2.89)比较,q值分别为17.07、20.58、24.19、28.50、48.95,均P<0.01.镜下观察显示鱼藤酮处理的细胞中有明显p-ERK1/2聚集;免疫印迹实验结果显示,随鱼藤酮作用时间的增加,p-ERK1/2出现双相表达升高,30 min开始升高,1～2 h达高峰,4 h转而降低,8 h又重新升高,16 h后基本消失;PD98059明显抑制鱼藤酮导致的ERK1/2磷酸化,明显减低了细胞损伤的程度.结论 在鱼藤酮介导的多巴胺神经元损伤中呈现ERK1/2双相活化,该过程可能在调控PD多巴胺能细胞损伤中起重要作用.     

泛素蛋白酶体抑制剂诱发多巴胺能神经元内质网应激反应及其凋亡的作用

目的 探讨泛素蛋白酶体(ubiquitin proteasome,UP)功能失调诱发的内质网应激反应(endoplasmic reticulum stress response,ERS)机制在多巴胺(dopamine,DA)能神经元变性死亡中的作用.方法 通过MTT及流式细胞仪检测UPS抑制剂Lactacystin对NGF诱导的PC12细胞的神经毒性作用,应用RT-PCR和Western blot技术观察Lactacystin处理后ERS通路中XBP1、Grp78、CHOP表达水平的变化及利血平耗竭胞内DA水平后的影响.结果 不同浓度的Lactacystin 5～20μmol/L处理PC12细胞后,细胞活力呈浓度依赖性下降,其中Lactacystin 10μmo1/L作用24h使细胞活力下降51%.在相同浓度条件下(10μmol/L)流式细胞仪显示的细胞凋亡率在4h、8h、1 6h、24h内逐渐增高(6.1%、14.1%、24.9%、30.9%)(P＜0.01).RT-PCR及免疫印迹检测显示UPS抑制剂处理后XBP1、Grp78和CHOP的基因及蛋白表达水平明显增加,分别在8h、16～24h达到高峰(P＜0.05).Caspase-12基因水平也在Lactacystin诱导后16h显著升高(P＜0.05).利血平预处理则使CHOP、caspase-12基因表达减弱(P＜0.05).结论 UPS功能抑制诱发的内质网应激和相关凋亡途径机制是DA能神经元选择性变性死亡的内在环节之一.     

泛素羧基末端水解酶-1抑制剂对多巴胺能神经元的神经毒性作用

目的 利用人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞观察泛素羧基末端水解酶-1(OCH-L1)抑制剂对多巴胺能神经元的毒性作用并探讨其可能的毒性机制. 方法 用不同浓度(5、10、25、50、75、100 μmol/L)的UCH-L1抑制剂作用SK-N-SH细胞24h,MTT法检测细胞活力、Hoechst染色检测凋亡的细胞核及Western blot检测UCH-L1蛋白、单个泛素分子及多聚化泛素蛋白的表达、荧光检测泛素蛋白酶体系统(UPS)的功能. 结果经UCH-L1抑制剂处理24 h后SK-N-SH细胞突起样结构消失,细胞体积变小、形态变圆;随着UCH-L1抑制剂浓度的增加,细胞活性进一步下降;与对照组比较,细胞活力在抑制剂浓度为50μmol/L时.作用24h后即出现明显下降,差异有统计学意义(P<0.05);Hoechst染色可见凋亡细胞碎裂的细胞核;Western blot检测到细胞内UCH-L1蛋白表达没有变化、单个泛素分子水平下降、多聚泛素化蛋白增加;荧光检测显示UPS功能下降.结论 UCH-L1抑制剂在体外对多巴胺能神经元有毒性作用,可诱导细胞凋亡.在凋亡过程中,UPS功能下降、细胞内多聚泛素化蛋白堆积可能发挥了作用.     

6-OHDA诱导PC12细胞凋亡及作用机制

目的 探讨6-羟基多巴胺(6-OHDA)诱导PC12细胞损伤的可能作用机制.方法 不同剂量6-OHDA加入培养的大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(pheochromocytoma cell,PC12)24h后,用四甲基偶氮唑盐法(MTT法)检测细胞的活力,流式细胞仪检测细胞凋亡率以及Bax、Bcl-2的蛋白表达.结果 在加入不同浓度的6-OHDA时PC12细胞活力显著下降,细胞凋亡百分率对照组为8.73±1.09,不同浓度的6-OHDA处理组显著上升,分别为10.97±1.52、25.77±0.95、57.94±1.23,较对照组有显著性差异(P<0.01),并且Bcl-2蛋白表达下降,Bax蛋白表达上升,Bcl-2/Bax比值和正常组比较有显著性差异(P<0.01).结论 6-OHDA能显著诱导PC12细胞损伤,并呈剂量依赖性,其作用机制涉及到促进细胞内bax,以及抑制Bcl-2的表达.