疟原虫感染小鼠血清对L929细胞的毒性作用

采用Ｌ９２９细胞作为靶细胞，对约氏疟原虫感染小鼠血清的细胞毒活性进行了测定。结果：持续疟原虫感染鼠血清在感染后第３ｄ即出现轻度的ＣＡ、至感染后第８－１５ｄＣＡ达到较高水平，以后逐渐下降，１个月时仍有２０％的ＣＡ。仅感染疟原虫７ｄ的鼠血清，高水平ＣＡ维持时间较短，感染后１５ｄＣＡ尚存留１７．８％，１个月后仅有６％。     

小鼠ERA蛋白在大肠杆菌中的表达及其纯化

目的:对小鼠ERA蛋白(mERA)进行表达、纯化,为真核生物ERA功能研究奠定基础.方法:构建MBP-mERA融合表达载体.在大肠杆菌中诱导表达融合的小鼠ERA蛋白,经直链淀粉亲和层析纯化,Western Blotting鉴定所表达纯化的蛋白.结果:表达的MBP-mERA融合蛋白占菌体总蛋白的18 %;纯化后的融合蛋白纯度为70 %;Western Blotting证实了mERA蛋白的表达.结论:利用基因重组技术,在大肠杆菌中高表达了mera基因,并对融合蛋白进行了初步纯化.     

WIP1对小鼠B细胞及T细胞发育的影响

目的研究WIP1基因对小鼠骨髓B细胞发育及胸腺T细胞发育的影响。方法流式细胞术测定小鼠骨髓B细胞及胸腺T细胞发育中各阶段的细胞比例。结果虽然WIP1缺失小鼠骨髓B细胞发育各阶段比例正常,但骨髓总体B细胞比例下降;WIP1基因敲除小鼠胸腺发育障碍,CD8/CD4双阴性细胞比例增高,CD8/CD4双阳性细胞比例降低。结论 WIP1基因在小鼠骨髓B细胞及胸腺T细胞的发育过程中起重要作用。     

不同培养基对小鼠小脑浦肯野细胞发育的影响

目的　研究小鼠小脑浦肯野细胞的体外培养条件。方法　分别用有血清和无血清培养基培养小鼠小脑浦肯野细胞 ,应用免疫荧光染色和ABC法染色观察细胞形态 ,测定树突面积和胞体直径。结果　用无血清添加N3 的DMEM /F1 2培养基比有血清培养基培养的浦肯野细胞发育出的树突更多 ;在DMEM/F1 2培养基中加入T3 后浦肯野细胞的树突面积和胞体直径较大。结论　无血清培养基更有利于浦肯野细胞的维持培养 ;添加T3 的DMEM /F1 2 /N3 培养基有利于浦肯野细胞的发育。     

高密度壳聚糖对L-929细胞的毒性研究

目的:研究高密度壳聚糖(high density chitosan,HDC)对小鼠L-929细胞的毒性,以期为其临床安全应用提供依据.方法:观察不同浓度HDC浸提液对体外培养L-929细胞形态的影响,四甲基偶氮唑蓝(methlthiazolyl tetrazolium,MTT)实验评价HDC对L-929细胞生长和增殖的影响,流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测HDC浸提液对L-929细胞凋亡的影响,单细胞凝胶电泳(single cell gel electrophoresis,SCGE)检测不同浓度HDC浸提液对培养的L-929细胞DNA分子损伤的影响.结果:HDC浸提液对体外培养的L-929细胞形态无明显影响,对细胞生长和增殖无明显抑制作用,不同浓度材料浸提液的细胞毒性均为0-1级;FCM示凋亡率随浸提液浓度升高而升高,但不明显;SCGE结果显示HDC对L-929细胞的DNA无明显损伤作用.结论:HDC具有良好的细胞相容性和分子相容性,可为临床的安全应用提供依据.     

疟原虫感染小鼠血清对L_(929)细胞的毒性作用

采用Ｌ９２９细胞作为靶细胞，对约氏疟原虫感染小鼠血清的细胞毒活性（ＣＡ）进行了测定。结果：持续疟原虫感染鼠血清在感染后第３ｄ即出现轻度的ＣＡ，至感染后第８～１５ｄＣＡ达到较高水平（３５％～４０％），以后逐渐下降，１个月时仍有２０％的ＣＡ。仅感染疟原虫７ｄ的鼠血清，高水平ＣＡ维持时间较短，感染后１５ｄＣＡ尚存留１７．８％，１个月后仅有６％。在小鼠感染疟原虫后第８ｄ注射大肠杆菌内毒素（ＬＰＳ），可迅速增强感染鼠血清的ＣＡ，此活性在注射ＬＰＳ后６０ｍｉｎ达高峰，１５０ｍｉｎ后下降至未注射ＬＰＳ的持续感染鼠水平。提示：疟原虫感染鼠血清具有一定的抗肿瘤细胞活性，此活性可以被ＬＰＳ协同增强。     

骨髓间充质干细胞对小鼠肉瘤细胞S180生长的影响

目的: 研究骨髓间充质干细胞(BMSCs)对小鼠肉瘤细胞S180生长的影响,并探讨其可能的机制.方法:采用密度梯度离心法结合贴壁培养法分离、纯化、扩增小鼠BMSCs,流式细胞术检测其细胞表面分子的表达.收集小鼠BMSCs上清液,采用MTT法检测其对小鼠S180细胞的生长抑制效应;流式细胞术检测细胞凋亡率;RT-PCR检测p53、bcl-2 mRNA的表达情况.结果:密度梯度离心法结合贴壁培养法能有效分离、纯化小鼠BMSCs,流式细胞术分析结果显示培养的小鼠BMSCs阳性表达CD44(86.53%)、CD29(95.27%),阴性表达CD34(3.57%).MTT法结果显示,小鼠BMSCs上清液可明显抑制S180细胞的生长,呈时间-剂量依赖性;经40%、80%上清液作用48 h后的凋亡率分别为14.17%、29.77%,明显高于对照组的4.23%(均P<0.01);p53及bcl-2 mRNA均表达,小鼠BMSCs上清液可上调p53 mRNA表达,下调bcl-2 mRNA表达.结论:小鼠BMSCs上清液可抑制小鼠S180细胞的生长并诱导细胞凋亡,其机制可能与上调p53、下调bcl-2基因表达有关.     

不同氨基酸对小鼠血糖影响的研究

目的观察不同氨基酸对昆明（KM）小鼠餐后血糖水平的影响。方法将KM小鼠按空腹血糖随机分为对照组和不同氨基酸组,每组15只;氨基酸组给予氨基酸（2g/kg）和葡萄糖（2g/kg）混合液灌胃,对照组仅给予葡萄糖（2g/kg）灌胃,测定灌胃后0.5h、1h、2h的血糖水平。结果 1）摄入D-亮氨酸或L-亮氨酸后0.5h、1h、2h血糖和血糖曲线下面积（AUC）明显低于对照组;与D-亮氨酸组相比,摄入L-亮氨酸后0.5h、1h和2h血糖及AUC降低,并具有显著性差异;摄入D-苯丙氨酸或L-苯丙氨酸后0.5h血糖和AUC明显低于对照组;与D-苯丙氨酸组相比,摄入L-苯丙氨酸后0.5h血糖水平有所降低,但无统计学差异。2）摄入苯丙氨酸0.5h血糖和AUC明显低于对照组（P〈0.01）;摄入缬氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、赖氨酸后0.5h、1h血糖和AUC明显低于对照组（P〈0.01）;摄入亮氨酸、色氨酸后0.5h、1h、2h血糖和AUC明显低于对照组（P〈0.01）。3）摄入谷氨酰胺和丝氨酸后0.5h血糖水平显著低于对照组;摄入甘氨酸、精氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、脯氨酸后0.5h、1h血糖和AUC显著低于对照组（P〈0.01）,而摄入天冬氨酸、酪氨酸、谷氨酸、组氨酸及天冬酰胺组0.5h血糖水平与其对照组相比无显著性差异（P〉0.05）。结论氨基酸可明显降低KM小鼠餐后血糖水平,其中亮氨酸降糖作用较强。     

Modification of Alternative Splicing of Bcl-x Pre-mRNA in Bladder Cancer Cells

The development , progression, and mainte-nance of cancer involve deregulation of apoptosis .Genetic and biochemical studies have revealed thatPCDis under complex and delicate regulation. Ani mportant level of such regulation may be pre-mR-NAsplicing. Many apoptotic regulatory genes un-dergo alternative splicing to control the gene ex-pressionlevel .Forinstance ,Bcl-x has two alterna-tive 5' splice sites and produces two distinct pro-teins :Bcl-xL and Bcl-xS.Bcl-xL,like Bcl-2 ,is a-ble t…     

表达工程化剪接因子腺病毒的构建及其在调控乳鼠心肌细胞中的YAP1可变剪接中的应用

目的 构建人工剪接因子,实现调控心肌细胞YAP1的可变剪接。方法 本研究根据Pumilio1的序列特异性,针对YAP1的Exon6构建不同序列的剪接因子。实验分为3组：野生型PUF-SR作为阴性对照组、人工化的PUF-SR腺病毒转染组、质粒转染组。实验流程：使用同源重组的方法构建腺病毒,将人工化的PUF-SR的PCR片段克隆到pAd-Track质粒中,再将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中进行质粒扩增。扩增后的质粒经PacⅠ酶切后,转染到293A细胞,进行腺病毒包装。将得到的腺病毒载体转染到培育的乳鼠心肌细胞中。选用Ad-Track质粒用于对照转染组,通过载体转染法将其转染到乳鼠心肌细胞中。定量和半定量PCR法检测YAP1的可变剪接,Western blot法检测融合蛋白Flag的信号,并使用GAPDH抗体检测GAPDH作为加载对照。结果 腺病毒转染组对心肌细胞的转染效率接近100%,质粒转染组中并没有发现荧光蛋白。在Western blot实验中,阴性对照和靶向YAPExon6XULIE 序列的Flag-SR-NLS-PUF都能够检测到融合Flag的蛋白的表达。在反转录PCR和PCR检测YAP1的可变剪接实验中,结果都显示YAP1的第4个target序列所构建的人工剪接因子能够有效调控YAP1 Exon 6的剪入（P<0.05）。结论 本实验成功构建出能够调控YAP1可变剪接的腺病毒,并且在SD大鼠的心肌细胞中得到了验证。     

肝癌相关基因的分子克隆和可变剪切分析

目的: 获取肝癌相关基因(hepatoma associated gene,HTA)的mRNA分子全长序列并对其可变剪接进行分析,检测其转录本在各肝癌细胞系中的表达,为进一步研究该基因在肝癌发生、发展中的作用奠定基础。方法: 用3'RACE 和5'RACE方法扩增HTA基因的全长序列并对其序列信息和可变剪接进行扩增和测序分析,用Northern印迹检测该基因转录本在不同肝癌和正常肝细胞系中的表达。结果: HTA基因全长序列为1414 bp,经分析该序列包含3个外显子,2个内含子,其中2号内含子在可变剪接中被作为外显子表达。Northern印迹显示HTA基因1.7 kb转录本和1.4 kb转录本均表达于恶性肝癌细胞系,而不表达于正常细胞系。结论: 成功获得了HTA基因的全长序列并对其可变剪接进行了分析,2个大小不同的转录本均在肝癌细胞系中特异性表达,作为一个肝癌相关基因值得进一步深入研究。     

DNA重新甲基化酶3b在成年及新生小鼠部分组织中的选择性？…

目的 探讨哺乳动物ＤＮＡ重新甲基转移酶３ｂ（Ｄｎｍｔ３ｂ）在新生及成年小鼠多种组织中的选择性剪接表达。方法 采用ＲＴ－ＰＣＲ结合毛细管电泳分析新生及成年小鼠主要器官中Ｄｎｍｔ３ｂ的选择性剪接表达产物,并通过计算机分析Ｄｎｍｔ３ｂ外显子１０和外显子２１、２２选择性剪接对该基因功能可能产生的影响。结果 成年小鼠肝组织中大部分Ｄｎｈｍｔ３ｂ转录本保留外显子１０,而其它组织的大部分转录本中此序列被剪切掉。     

两个新的人Flt3配体差异剪接体的克隆

目的:寻找新的人Flt3配体(hFL)的差异剪接体.方法:从健康志愿者外周血中分离单个核细胞,一步法提取总RNA,逆转录成cDNA,应用胞外区特异性引物PCR扩增hFL的胞外区并克隆至真核表达质粒,进行序列测定分析.结果:序列分析发现了两个新的hFL的差异剪接体,均发生在重要的第5外显子功能域,分别在434 bp处有一个胞嘧啶的插入和在426～478 bp之间缺失了53个bp.结论:hFL存在两个新的差异剪接体,此项发现为进一步的功能研究提供了基础.     

大鼠磷脂酶C-γ1前体mRNA剪接的初步鉴定

目的 探讨在大鼠中是否存在磷脂酶C-γ1(PLC-γ1)选择性剪接变异体的表达及其可能意义.方法 针对在人中已发现的选择性剪接位点(即第30内含子的3'末端与第31外显子交界处)自行设计引物,将大鼠RNA逆转录为cDNA后,再用该对引物进行PCR扩增及序列测定.用此方法初步筛查了大鼠包括胚胎时期、出生早期、成年时期6种脏器组织心、肝、肺、肾、脑和眼球样品共21份.结果 在大鼠中未发现与人相似的第一种剪接方式PLC-γ1aNM 002660).结论 (1)由于不同物种之间的差异,在大鼠中可能不存在与在人类中已发现的PLC-γ1前体mRNA相似的选择性剪接方式,在大鼠中PLC-γ1转录后的剪接主要以与人类相似的第二种剪接方式(PLC-γ1b)为主.(2)在大鼠中PLC-γ1的选择性剪接位点可能与人不同而位于其他位点.     

一个新的NPCEDRG基因mRNA剪接变异体的克隆及鉴定

目的:克隆并鉴定NPCEDRG基因mRNA剪接变异体.方法:利用5’-RACE、3’-RACE在CNE2细胞中对NPCEDRG基因mRNA剪接变异体进行扩增,T/A克隆入pMD20载体,所获得的阳性重组子经测序证实.结果:成功克隆得到一种新的NPCEDRG基因的mRNA剪接变异体V2,其TSS位于-23 nt处,其CD...     

lmbr1基因剪接方式分析

目的：探讨lmbr1基因的剪接方式。方法：采用序列比对blast方法,结合基因常见的GU—AG剪切方式,对人和鼠c7orf2／lmbr1基因的内含子-外显子边界进行分析;将从GenBank筛选到的lmbr1 cDNA序列及其预测蛋白与其常见转录产物的序列及预测蛋白序列比较,进行lmbr1基因可变剪接的分析。结果：获得了lmbr1基因各个外显子的边界和大小,表明c7orf2／1mbrl基因有多种转录体,分别预测编码不同长度的蛋白质,其剪接方式包括转录起始位点的改变、外显子丢失、内含子驻留和polyA位点的改变等。结论：lmbr1有多种可变剪接方式,且在不同物种其同源基因有相似的转录产物。     

Fkbp51基因敲除对小鼠肝脏转录组基因可变剪接的影响

目的通过分析Fkbp51基因敲除(knock out,KO)与野生型(wild type,WT)小鼠肝脏表达谱,研究Fkbp51基因敲除对肝脏组织基因可变剪接的影响。方法利用二代测序对Fkbp51 KO与WT小鼠肝脏进行表达谱测序,用Top Hat对RNA测序结果进行可变剪接分析,筛选出KO与WT小鼠肝组织中差异的内含子保留(intron retetion,RI)和外显子跳跃(exon skipping,SE)。通过在线工具DAVID对这些差异可变剪接体进行基因功能(gene ontology,GO)和代谢通路(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析,同时用NCBI基因数据库对这些基因进行注释。结果 (1)Fkbp51缺失可导致小鼠肝脏mRNA可变剪接发生变化;(2)Fkbp51基因敲除造成小鼠肝脏mRNA可变剪接表达量的变化;(3)通过GO与KEGG分析,我们发现这些发生差异可变剪切的基因主要与脂肪相关衍生物的代谢、免疫、胆汁酸分泌等通路相关。(4)与差异内含子保留相关的基因主要与肌动蛋白细胞骨架调控,氨基酸及其衍生物代谢相关。结论 Fkbp51基因敲除能够改变基因组中mRNA的可变剪切,进而影响小鼠肝脏的代谢功能。