人巨细胞病毒短时培养快速诊断改良技术的建立及其应用

目的 建立人巨细胞病毒（HCMV）短时培养快速诊断改良技术；检验临床样本，与病毒分离比较。方法 （1）用含细胞飞片培养板离心吸附AD169株，设时间梯度培养后用SABC法检测培养物中HCMV即刻早期抗原（IEA）；（2）用改良法检测156例患儿尿样本（7例留取脑脊液），其中54例与病毒分离对照；147例检测血清特异性IgM；（3）9例更昔洛韦（GCV）治疗后随访尿排毒和特异性IgM变化。结果 （1）标准毒株培养16－24h，能100％检出培养物中HCMV IEA。（2）快速法检测尿样本178份，阳性率46.6%。与病毒分离比较，敏感性和特异性分别达100％和91.7%。（3）147例检测血清HCMV IgM，50例阳性（34.0%），其中49例和另25例特异性IgM阴性者尿快速培养阳性，后25例中，年龄＜1岁22例；2例免疫抑制者快速培养阳性。（4）2例先天感染儿脑脊液快速培养阳性伴蛋白增高。（5）9例GCV治疗后随访2－4次，2例无效，1例尿排毒减少；6例尿排毒停止。结论 改良快速培养法敏感性高、特异性强，操作更为简便，是快速诊断活动性HCMV感染和评估抗HCMV疗效的可靠方法。     

荧光定量PCR方法检测婴儿尿液中人类巨细胞病毒基因的含量

目的探讨FQ-PCR方法检测婴儿尿液中HCMV-DNA含量对于临床症状性HCMV感染的诊断价值,同时,比较FQ-PCR方法与定性PCR方法的敏感性.方法应用双标探针水解的FQ-PCR方法检测89例临床怀疑有巨细胞病毒感染患儿(病例组)尿液中的HCMV-DNA拷贝数,并以82例同年龄组健康婴儿做对照,比较两组阳性标本中HCMV-DNA含量.同时,在两组中随机选取94例(其中疑诊为HCMV感染的56例,健康儿38例),用FQ-PCR方法与普通定性PCR方法共同检测进行比较.结果病例组阳性52例,称为症状性感染组,对照组阳性30例,称为无症状性感染组.症状性感染组52例,尿液HCMV-DNA拷贝数对数值(log10X)在3.81-9.93,平均为5.30;无症状性感染组30例,尿液中HCMV-DNA拷贝数对数值在2.70-4.60,平均为3.46,两组均值差异有显著性(T=8.09,P＜0.01),拷贝数大于105拷贝/mL高度预示症状性HCMV感染.FQ-PCR方法阳性率为60.64%(57/94),定性PCR方法阳性率32.98%(31/94),两方法一致率70.21%(χ2=25.30>6.63,P＜0.01),FQ-PCR方法优于定性PCR方法(χ2=23.32>6.63,P＜0.01).结论婴儿尿液中HCMV-DNA拷贝数与临床症状性HCMV感染密切相关,FQ-PCR方法检测婴儿尿液中HCMV-DNA量可以作为临床诊断HCMV症状性感染的一种快速、有效的实验室方法.     

人博卡病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立人博卡病毒(human Bocavirus,HBoV)的实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quanti-tative PCR,FQ-PCR)检测方法,检测呼吸道感染患儿标本的HBoV。方法设计HBoV NP1基因的引物和Taqman探针,扩增NP1基因片段,并将其克隆到pGEM-T Easy载体上,构建质粒标准品,建立FQ-PCR检测方法,进行敏感性、特异性试验,检测195份临床标本。结果所建立的FQ-PCR方法对临床其他呼吸道病毒不出现特异性扩增曲线,特异性好,线性范围为10～108copies/μl。195份临床标本中HBoV阳性12份,阳性率为6.2%。结论成功建立了HBoV实时荧光定量PCR检测方法并检测临床标本,为人博卡病毒感染的临床治疗提供快速、可靠的诊断依据。     

尿巨细胞病毒定量检测在巨细胞病毒感染诊断中的意义

目的探讨尿巨细胞病毒(CMV)定量检测在儿科CMV感染诊断中的意义。方法应用荧光定量聚合酶链反应 (FQ-PCR)方法检测110例确诊或疑诊CMV感染和81例对照患儿尿CMV-DNA,并与血清抗体检测、pp65抗原检测比较,对更昔洛韦治疗的17例病人进行治疗后尿CMV-DNA;拷贝监测。结果 1．确诊或疑诊为CMV活动性感染患儿110例,其中82例尿中检测到CMV-DNA;对照11例检测到尿CMV-DNA,其中10例为正常健康儿童;且不同年龄组CMV-DNA的阳性率不同。17 例更昔洛韦治疗后,尿CMV-DNA的平均拷贝数明显下降(P<0．001)。2．FQ-PCR、pp65、IgM检测方法敏感性分别为87％、 74％、59％,特异性分别为97％、86％、69％;与其他两种方法比较,FQ-PCR方法敏感性和特异性均明显高(P均<0.001)。结论 FQ-PCR检测尿CMV-DNA对诊断活动性CMV感染有一定意义,量化结果便于治疗过程中进行连续的监测。     

荧光定量PCR在婴儿巨细胞病毒感染诊断和治疗监测中的价值

巨细胞病毒(CMV)感染在人群中广泛流行,免疫功能异常的个体易受到感染,在新生儿和小婴儿中发病率很高。小婴儿受到CMV感染后易引起神经系统异常,因此及时诊断和治疗尤为重要。目前用于诊断CMV感染以及治疗监测中最常用的方法为荧光定量PCR法,该法敏感性和特异性较高,且操作简便不易受其他物质污染,是目前临床应用的一线方法。     

应用实时定量PCR检测儿童急性髓系白血病AML1-ETO融合基因

目的应用实时定量聚合酶链式反应方法,分析儿童急性髓系白血病中AML1ETO融合基因的表达水平,探讨AML1ETO表达水平的变化规律。方法采用实时定量PCR方法,以AML1ETO融合基因为靶分子,定量检测了28例急性髓系白血病患儿初诊时融合基因的表达量,分析了表达量与初诊临床特征的相关性,并对17例患者进行微小残留病定量分析。结果患者AML1ETO融合基因的表达范围在未治疗前达到17094～187800拷贝/106GAPDH拷贝;长期缓解的患者表达量降到0～46拷贝/106GAPDH拷贝;复发患者融合基因表达范围为62633.8～246000拷贝/106GAPDH拷贝。初诊时患者AML1ETO融合基因的表达量与临床特征无相关性(P均>0.05)。结论应用实时定量PCR技术对AML1ETO的定量检测是判断和追踪该类白血病疗效的有力指标,可以较好地反映患者的微小残留病的动态变化。     

荧光定量聚合酶链式反应法检测婴儿尿液人巨细胞病毒DNA对人巨细胞病毒感染的诊断意义

目的探讨荧光定量聚合酶链式反应（FQ-PCR）方法检测婴儿尿液人巨细胞病毒（HCMV）DNA水平对婴儿HCMV感染的诊断价值。方法采用FQ-PCR检测348例临床疑似HCMV感染婴儿尿液中HCMVDNA水平。同时采用化学发光免疫分析法（CLIA）检测婴儿血清HCMV-IgM抗体。在尿液HCMVDNA检测阳性患儿中比较血清HCMV-IgM抗体检测阳性与阴性患儿尿液中HCMVDNA拷贝数差异。结果FQ-PCR检测尿液HCMVDNA的阳性率为41.74%,CLIA检测婴儿血清HCMV-IgM抗体的阳性率为19.83%。2种方法对HCMV感染诊断的符合率为76.7%。前者诊断阳性率显著高于后者（χ^2=69.44P〈0.01）。在尿液HCMVDNA检测阳性患儿中,IgM抗体阳性组尿液HCMVDNA拷贝数显著高于阴性组（P〈0.01）。结论FQ-PCR检测尿液HCMVDNA是早期诊断婴儿HCMV感染的敏感有效的方法。HCMV感染婴儿尿液中高HCMVDNA拷贝数与活动性HCMV感染密切相关;FQ-PCR方法检测尿液HCMVDNA水平对于判断是否为HCMV活动性感染具有一定意义。     

实时荧光定量RT-PCR法检测手足口病患儿大便标本中肠道病毒71型

目的 了解2008年手足口病流行期间住院手足口病患儿是否存在EV71病毒感染,并探讨实时荧光定量RT-PCR法对手足口病患儿大便标本中EV71病毒载最进行定量检测的可行性.方法 采用RT-PCR荧光探针体外扩增法对47例住院的手足口病患儿大便标本中抽提的RNA进行抽样检测.结果 22例(46.81%)手足口病患儿大便标本中EV71的病毒载量大于103 copies/ml,最高者达1.03 × 107copies/ml.实时荧光定量RT-PCR法其标准曲线显示,Ct值与病毒拷贝数的对数(log10)之间的相关系数为1.000,相关性较好.结论 2008年手足口病流行期间入住儿科医院的手足口病患儿近半数为EV71病毒感染.实时荧光定量RT-PCR法对大便标本中的EV71 RNA定量检测较方便快捷,结果直观,为进一步研究病毒载量与临床表现之间的关系打下了基础.     

荧光定量PCR检测手足口病患儿肠道病毒RNA

近年手足口病(hand-foot-mouth disease)在儿童中流行情况较为严重,由肠道病毒感染引起,可经消化道、呼吸道传播,易造成流行[1].主要表现为口腔黏膜溃疡性疱疹及四肢末端水疱样皮疹,主要病原为柯萨奇病毒A组16型(Cox A16)和肠道病毒71型(EV71)[2].     

定量检测婴儿尿液巨细胞病毒DNA的临床意义

目的 探讨荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测尿液巨细胞病毒(CMV)在儿科CMV感染诊断治疗中的意义.方法 应用FQ-PCR方法检测婴儿尿液CMV DNA量.结果 (1)280例疑似CMV感染儿有126例尿液中CMVDNA呈阳性,阳性率是45.0%,为症状性CMV感染儿;同年龄组的70例健康儿童尿液中CMV DNA阳性5例,阳性率是7.1%,为无症状性CMV感染儿.症状性感染儿尿液中CMVDNA拷贝数对数值(4.78±0.85)与无症状性感染儿(4.45±1.02)之间差异无显著性(P＞0.05).(2)90例症状性CMV感染儿应用更昔洛韦诱导治疗结束时尿液CMV DNA拷贝数对数值(3.74±0.58)较治疗前(4.64±0.90)明显减少(P＜0.01),临床症状改善.(3)45例症状性CMV感染儿在治疗后3个月CMVDNA拷贝数对数值(4.41±0.74)较治疗结束时(3.67±0.58)升高(P＜0.01).临床症状明显改善.结论 FQPCR方法检测婴儿尿液中CMVDNA量可以诊断CMV感染,但是不能区分CMV感染是症状性感染还是无症状性感染;应避免盲目反复应用更昔洛韦治疗CMV感染.     

荧光定量PCR检测卡他莫拉杆菌感染的实验室诊断方法学建立及应用

目的 建立荧光定量PCR检验卡他莫拉杆菌的实验室诊断方法并检验临床样本.方法 针对卡他莫拉杆菌外膜蛋白COPB设计引物及探针;构建含卡他莫拉杆菌目的基因片段的质粒,梯度稀释后作为标准品,绘制标准曲线;验证实验方法的敏感性;通过检测7种病原体标准株验证该方法的特异性.用新建荧光定量PCR检测321例诊断为哮喘的儿童患者咽拭子标本.结果 绘制新建荧光定量PCRTaqman探针法检测质粒标准品的标准曲线,新建实验室诊断方法的敏感性可达10拷贝/反应,研究方法可成功区分卡他莫拉杆菌与其他6种病原体DNA.检测321例临床咽拭子样本,卡他莫拉杆菌阳性25例,阳性检出率为7.79%.结论 新建荧光定量PCR法具有较高的灵敏度、特异性,能简单、快速、准确、灵敏地检测卡他莫拉杆菌,可以应用于临床样本的检测.     

Increased urinary excretion of human cytomegalovirus in children with malignancy: Detection by polymerase chain reaction

Human cytomegalovirus (HCMV) is one of the most important agents causing opportunistic infections in immunocompromised hosts. In this study, we examined the urinary excretion of HCMV in children with malignancy using polymerase chain reaction (PCR). Urine samples were collected from on-therapy, off-therapy patients with malignancy, and healthy controls. A simple DNA extraction method using glass powder was employed, and inhibitory effect of urine on PCR was prevented. For PCR, a pair of primers from the HCMV major immediate early gene sequence was used. Among patients who received intensive chemotherapy, 52.0% had urinary HCMV excretion after the chemotherapy course. In contrast, off-therapy patients and healthy controls showed a lower incidence of urinary HCMV excretion (20.4 and 8.7%, respectively). The incidence of HCMV urinary excretion in the on-therapy group was significantly higher than healthy controls (P < 0.05). In the on-therapy group, the total white blood cell count of the virus excreters was lower than that of non-excreters. The incidence of HCMV excretion was high in on-therapy patients. Most of the virus excreters were seropositive, so their viruria was thought to be caused by reactivation. Repeated monitoring of virus excretion by this rapid and simple method may be useful to detect HCMV infection early and to control it in such patients.     

Clinical applications of real-time PCR for diagnosis and treatment of human cytomegalovirus infection in children

There are many methods of detecting human cytomegalovirus (HCMV) infection. So far, the quantitative polymerase chain reaction (PCR) has been very useful not only in aiding in the diagnosis of HCMV but also in determining the severity and predicting HCMV infection. However, it is time-consuming and labor intensive. Real-time PCR (RT-PCR) is an exception, for it allows rapid quantification of HCMV DNA load. Our group used this method for detecting and monitoring HCMV and compared it with the diagnostic criterion recommended by the Pediatric Branch of Chinese Medical Association, in 45 children suspected of having HCMV infection. The response to two types of antiviral treatment on HCMV DNA load was also monitored in HCMV hepatitis cases. RT-PCR was positive in 30 cases while the diagnostic criterion, which includes enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and/or conventional PCR, was positive in 32 cases. The decrease in the HCMV DNA load was achieved earlier in the modified treatment group compared with the conventional treatment group. A 10(3) copies/ml of HCMV DNA load of is a useful cut-off value in predicting patients who will have symptoms of the disease. RT-PCR can be used not only in detecting HCMV but also in monitoring response to antiviral treatment and risk of having symptoms of the disease.     

儿童急性白血病WT1基因表达的临床意义

目的 构建WT1质粒,建立实时定量聚合酶链反应(RQ-PCR)监测儿童白血病骨髓样本WT1基因的实验方法,初步研究WT1基因在儿童白血病中的表达特点及临床意义.方法 设计合成WT1基囚引物探针,利用分子克隆方法构建含有目的 基因WT1片段的质粒,并以此作为阳性对照检测儿童白血病骨髓样本.通过Taqman荧光探针RQ-PCR方法分别对WT1目的 基因及GAPDH内参基因进行检测,利用双标准曲线法对WT1基因的表达水平进行绝对定量,检测结果用WT1与GAPDH基因拷贝数比值(WT1/104·GAPDH)表示.实验结果应用SPSS 13.0软件进行统计学处理.结果 经酶切电泳和测序分析证实构建的质粒中成功插入了WT1基囚片段,作为RQ-PCR方法中的阳性对照;成功建立了WTl摹因的RQ-PCR检测方法.对儿童白血病标本的检测结果显示:初发AML患儿WT1基因表达水平(9.2331±37.6228)明显高于正常对照组(0.0482±0.0348),其次为BCR-ABL阳性的CML患儿(0.1080±0.0616),初发ALL患儿WT1基因表达水平(0.0605±1.6124)与正常组的差异无统计学意义.缓解中的AML患儿WT1基因表达水平(0.3150±0.7216)较初发时明显下降(P=0.000).结论 实验构建的WT1质粒及建立的RQ-PCR方法可用于儿美童白血病WT1基因检测.WT1基囚的表达水平在一定意义上可作为儿童AML治疗过程中肿瘤负荷的动态监测指标.     

小儿巨细胞病毒活动性感染的两种诊断方法比较

目的　通过血清人巨细胞病毒 (HCMV)IgM和尿快速培养HCMV检测临床标本的比较 ,进一步评价血清特异性IgM诊断活动性HCMV感染的价值。 方法　①ELISA法检测患儿血抗HCMV IgG、IgM。②通过检测尿培养物中HCMV即刻早期抗原 (IEA)快速诊断活动性HCMV感染。结果　① 119例尿培养阳性者 ,血抗HCMV IgG均为阳性。②与尿快速培养法相比 ,血IgM的特异性和敏感性分别达到 97 7%和 6 9 7% ;血IgM阳性数与尿快速培养阳性数比率在≤ 1个月、～ 1岁和～ 3岁组分别为 4 5 8%、75 75和 82 4 % ,表明IgM检测结果在各年龄组均有假阴性 ,其中尤以 1个月以下婴儿多见。③ 2例 3个月左右患儿血IgM阳性而尿培养阴性。 11例随访患儿中 ,9例在结束更昔洛韦治疗后 1个月复查 ,3例IgM迟于尿培养转阴 ,2例尿培养阴性而血IgM仍为阳性 ,表明IgM检测结果可有假阳性。 结论　血清特异性IgM检测可用于诊断活动性CMV感染 ,但其意义有一定局限性 ,应结合其他指标综合判断     

Comparison between microscopical examination of unstained deposits of urine and quantitative culture.

Side-room examination of fresh samples of urine was compared with the results of surface viable bacterial counts. Examination of centrifuged deposits of urine for bacterial content was shown to compare very well with subsequent culture results. 87% of infected urines were detected, and only 6% of noninfected urines were wrongly identified. Evaluation of the uncentrifuged samples was less easy. There was poor agreement between the naked eye appearance, the presence of protein, and the pus cell count and the ultimate laboratory bacterial count. Microscopy of urinary sediments after centrifuging is recommended to assist in the rapid diagnosis of urinary tract infections particularly in young children.