HSP_(70BCG)-Daudi肿瘤肽复合物对γδT细胞的活化作用

用固相抗体法[1] 体外扩增人PBMC的γδT细胞 ,静息化处理后用HSP70BCG Daudi肿瘤肽复合物再次刺激研究HSP70BCG Daudi肿瘤肽复合物对γδT细胞的活化作用。MTT检测γδT细胞的细胞毒作用及TNF α生物学活性。3 H TdR掺入法测定细胞增殖。HSP70BCG Daudi肿瘤肽复合物活化的γδT细胞在效靶比为 10∶1及 5∶1时对靶细胞Daudi的杀伤活性分别为 88 36 %±8 2 1%及 75 2 3%± 16 36 % ,与对照组有显著性差别。 2 4及 4 8h增殖结果各组间无差别 ;未检测出各刺激组的上清中TNF α生物学活性有何差别。结论表明HSP70BCG Daudi肿瘤肽复合物活化的γδT细胞对Daudi有较高的杀伤活性     

一种经济简单的方法扩增Vγ9Vδ2T细胞

目的体外以仲丁胺刺激健康人外周血PBMC中Vγ9Vδ2T细胞的增殖,为γδT细胞的过继免疫治疗建立效应细胞制备平台。方法淋巴细胞分离液分离健康人外周血的PBMC,以10~6/孔接种于24孔板,用含10%胎牛血清、1mmol/L仲丁烷和200U IL-2的1640完全培基连续培养2周。结果有效地扩增出了Vγ9Vδ2T细胞,其组成高达85%以上,所扩增出的Vγ9Vδ2T细胞能有效地杀伤Daudi细胞。结论使用小分子的胺基抗原能有效地扩增出有功能的Vγ9Vδ2T细胞,为γδT细胞的过继免疫治疗建立了效应细胞制备平台。     

一种体外扩增γδT细胞的新方法

目的:建立一种新的γδT细胞扩增方法。方法:从健康人外周血中分离外周血单个核细胞(PBMCs),与用唑来膦酸预处理过的未成熟DCs按10:1混合,在含IL-2 400 U/ml和10%小牛血清的RPMI1640培养基中培养,用MTT法测定细胞增殖倍数。用流式细胞仪对γδT细胞进行表型分析并检测其细胞内的颗粒酶B、穿孔素和CD107a含量。用乳酸脱氢酶释放法(LDH)检测细胞杀伤活性。结果:经唑来膦酸预处理的树突状细胞与自身外周血单个核细胞共培养,到11天时γδT细胞增殖倍数达到(120±15)倍,第8天和11天γδT细胞百分率分别达到70.26%±3.56%、90.11%±4.67%。γδT细胞细胞内颗粒酶B、穿孔素及CD107a在第8天时分别为81.66%±4.32%、86.62%±5.21%和80.12%±3.78%,均高于对照组。培养的γδT细胞对SGC-7901、SW-1990、SW-480肿瘤细胞株杀伤活性至第8天时达到峰值。结论:此法能有效诱导γδT细胞体外扩增,培养的γδT细胞颗粒酶B、穿孔素及CD107a均显著高于对照组,并有较强的抗肿瘤活性。     

一种体外扩增人γδT细胞的新方法

目的:建立一种简单快速的体外扩增人外周血γδT细胞的方法, 以便进一步对γδT细胞生物学特性和肿瘤免疫治疗的研究.方法:取健康人外周血100 mL, 分离单个核细胞, 置于含100 mL/L小牛血清, 50 mL/L人AB血清, 异戊烯焦磷酸(2 μg/L)和IL-2(100 IU/mL)RPMI1640 培养液中培养, 进行细胞毒杀伤活性测定和流式细胞术分析.结果:细胞培养10 d时γδT细胞从扩增前4.21%增加到70.35%, 增殖倍数可达80倍, 悬浮生长γδT细胞CD44表达为86.39%、贴壁生长γδT细胞为94.0%.效靶细胞比为40: 1时, 对K562细胞和SGC-7901胃腺癌细胞的杀伤活性分别为75%和61%.结论:用一种简单、快速和特异性的体外扩增人外周血中γδT细胞新方法, 培养的γδT细胞具有较强的抗肿瘤活性.     

唑来膦酸刺激健康人和骨肉瘤PBMCs体外扩增γδT细胞

目的:探讨唑来膦酸(Zol)联合IL-2对健康人和骨肉瘤患者末梢血γδT细胞的扩增和细胞毒性作用的影响。方法:取健康人和骨肉瘤患者外周血来源的单个核细胞,分别使用IL-2和Zol联合IL-2刺激体外扩增,流式细胞技术检测γδT细胞的纯度,并计算其扩增倍数。以Daudi细胞作为阳性对照、Raji细胞为阴性对照,并以人成骨细胞系hFOB细胞作为正常对照,用LDH法检测扩增后γδT细胞的细胞毒活性的变化。结果:健康人和骨肉瘤患者外周血单核细胞经过体外14 d的培养,Zol联合IL-2组可高度选择性扩增γδT细胞,并且扩增后γδT细胞具有杀伤活性,而对正常细胞无杀伤活性。结论:健康人和骨肉瘤患者PBMCs经唑来膦酸联合IL-2刺激后,可获得高纯度具有较强的杀伤作用的γδT细胞。     

急性髓细胞白血病患者外周血淋巴细胞亚群的特征及临床意义

目的通过检测急性髓细胞白血病患者外周血各淋巴细胞亚群的分布,探讨该类患者免疫功能状况。方法通过流式细胞术检测健康对照组(n=20)、急性髓细胞白血病初发患者(n=31)及完全缓解期患者(n=31)外周血中CD4+T细胞、CD8+T细胞、TCRγδ+T细胞、CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)、CD16+CD56+NK细胞比例;通过细胞杀伤实验分析NK细胞和γδT细胞的杀伤活性以及与Treg的关系。结果与对照组相比,初发白血病患者和完全缓解患者外周血中CD4+T细胞、CD8+T细胞比例无明显差异,但CD4+CD25+Treg比例明显增高,TCRγδ+T细胞和CD16+CD56+NK细胞比例明显下降。初发病患者NK细胞和γδT细胞具有杀伤活性,但Treg能明显抑制其杀伤活性。结论急性髓细胞白血病患者外周血γδT和NK细胞虽具有杀伤功能,但比例明显下降,Treg对其杀伤功能具有抑制作用。     

IL-2或IL-15协同结核分枝杆菌抗原诱导人外周血单个核细胞体外扩增细胞的特性比较北大核心CSCD

目的分析白细胞介素2(IL-2)或IL-15协同结核分枝杆菌抗原(MTB-Ag)诱导人外周血单个核细胞(PBMC)扩增细胞的生物学特性。方法采用MTB-Ag联合IL-2或MTB-Ag联合IL-15体外分别刺激正常人PBMC,培养至第12天时,经流式细胞术检测扩增细胞中γδT细胞、自然杀伤(NK)细胞和CD4+T细胞所占的比例,以及分析3种淋巴细胞扩增的绝对数量。同时用MTT法检测两组扩增细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。结果与MTB-Ag联合IL-2刺激组相比,MTB-Ag联合IL-15刺激组扩增细胞中γδT细胞所占比例明显高于前者,NK细胞所占比例明显低于前者;而两组扩增细胞中CD4^+T细胞所占比例并无显著性差异。与2个刺激组中3种淋巴细胞数量的分析结果一致。并且MTB-Ag联合IL-15刺激组扩增细胞对不同肿瘤细胞均具有显著的杀伤活性,但与MTB-Ag联合IL-2刺激组相比,并无显著性差异。结论 IL-15协同MTB-Ag可高效诱导人PBMC产生以γδT细胞增殖为主的效应细胞,该扩增细胞在体外对肿瘤细胞具有显著的杀伤活性。     

γδΤ细胞、NK细胞及LAK的生物特性比较

目的通过体外分离、增殖培养获取 γδΤ细胞、NK细胞和 L AK细胞 ,并比较 3种细胞的抗肿瘤的生物学特性。方法收集用不同单抗分别包被粘附的细胞 ,通过 MACS细胞分选仪的分选 ,获取的细胞进行细胞增殖动力学、细胞表型、细胞杀伤活性的测定以及单抗阻断效应的分析。结果经 MACS分离得到的 γδΤ细胞 ,培养 2周后细胞数扩增 6 0 0～ 80 0倍 ,CD3、CD8和 γδ细胞表达阳性率分别是 72 .2 9%、5 8.0 2 %和 6 5 .98%。γδΤ细胞对 NK敏感细胞 K5 6 2以及 NK不敏感细胞 Raji和 XG- 7这 3种不同靶细胞均有较高的杀伤率 ,分别为 35 .98%、5 2 .2 7%和 6 9.0 8;NK细胞对此 3种细胞的杀伤率分别是45 .2 1%、12 .34%和 2 9.2 7% ;L AK细胞的杀伤率分别为 44 .0 1%、2 9.2 7%和 2 5 .6 8%。γδΤ细胞对经 MHC- 类单抗阻断前后的 K5 6 2、Raji和 XG- 73种靶细胞的杀伤率无明显改变。结论γδΤ细胞、NK细胞和 L AK细胞都具有一定非特异性杀伤肿瘤细胞的作用 ;γδΤ细胞对 MHC- 类单抗阻断后的肿瘤细胞的杀伤无明显变化。提示 γδΤ细胞较 NK细胞和 L AK细胞有更广泛的抗瘤谱     

抗CD94单抗与NK细胞、γδ^＋T细胞及CTL功能的关联

目的：探讨抗CD94单抗与NK细胞、γδ^ T细胞及CTL的相关性。方法,采用荧光检测法,分别分析NK细胞、γδ^ 细胞和CTL上CD94分子的表达,采用^3H TdR掺入法和MTT释放法,分析抗94单抗对这3种细胞的杀伤活性和细胞增殖的影响。结果NK细胞和γδ^ T细胞上CD94分子的表达,明显高于PBL和CTL。抗CD94单抗能激活NK细胞、γδ^ T细胞和CTL的增殖,并能提高γδ^ T细胞和CTL的杀伤活性。结论CD94分子在NK细胞和γδ^ T细胞表面呈高表达。抗CD94单抗对NK细胞、γδ^ T细胞及CTL的增殖具有上调节作用,对它们的杀伤活性具有正向调节作用。     

IL-2或IL-15协同结核分枝杆菌抗原诱导人外周血单个核细胞体外扩增细胞的特性比较

目的 分析白细胞介素2(IL-2)或IL-15协同结核分枝杆菌抗原(MTB-Ag)诱导人外周血单个核细胞(PBMC)扩增细胞的生物学特性。方法 采用MTB-Ag联合IL-2或MTB-Ag联合IL-15体外分别刺激正常人PBMC,培养至第12天时,经流式细胞术检测扩增细胞中γδT细胞、自然杀伤(NK)细胞和CD4+T细胞所占的比例,以及分析3种淋巴细胞扩增的绝对数量。同时用MTT法检测两组扩增细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。结果 与MTB-Ag联合IL-2刺激组相比,MTB-Ag联合IL-15刺激组扩增细胞中γδT细胞所占比例明显高于前者,NK细胞所占比例明显低于前者;而两组扩增细胞中CD4~+T细胞所占比例并无显著性差异。与2个刺激组中3种淋巴细胞数量的分析结果一致。并且MTB-Ag联合IL-15刺激组扩增细胞对不同肿瘤细胞均具有显著的杀伤活性,但与MTB-Ag联合IL-2刺激组相比,并无显著性差异。结论 IL-15协同MTB-Ag可高效诱导人PBMC产生以γδT细胞增殖为主的效应细胞,该扩增细胞在体外对肿瘤细胞具有显著的杀伤活性。     

K652重组表达IL-6基因对NK细胞表型和功能的影响

目的:为了研究表达IL-6的重组K562细胞对自然杀伤细胞(NK)细胞的扩增数量、表型和功能的影响。方法:根据人类IL-6 c DNA的5'端序列,设计PCR引物以K562细胞c DNA文库的DNA为模板进行扩增,表达,转染,在K562细胞上表达IL-6基因,构建重组的K562工程细胞作为刺激细胞,以人外周血单个核细胞(PBMC)为扩增培养对象,使NK细胞在体外培养条件下得到大量的扩增。流式细胞仪分析NK细胞表型。将NK细胞作用到K562细胞,对其杀伤性进行功能分析,51Cr释放实验检测NK细胞对K562细胞杀伤水平的影响。结果:成功构建了表达IL-6的重组K562细胞,和PBMC共同孵育后,培养体系经过21 d的刺激后,IL-6重组K562细胞诱导PBMC扩增,CD56+CD16+CD3-细胞数量比诱导前扩增了(760±18)倍,CD56+CD16+CD3-细胞的纯度从培养前占PBMC的6%±0.4%,扩增后第3组结果比未扩增的多了91%±2%。细胞毒实验表明,在NK效应细胞∶K562靶细胞为5∶1时,扩增的NK细胞的杀伤率达到了92%±2%。结论:本方法以重组K562为刺激细胞,能够实现NK细胞体外的大规模制备,建立了优化的NK细胞体外扩增方法,且扩增的细胞杀伤K562细胞的活性较好。对于NK的大量扩增和应用于临床具有重要的指导意义。     

2-脱氧葡萄糖对体外培养人γδT细胞CCR5表达及杀伤功能影响

目的:观察糖基化抑制剂2-脱氧葡萄糖(2-deoxy-D-glucose,2-DG)对γδT细胞增殖、趋化因子受体CCR5和杀伤功能的影响。方法:从健康人外周血中分离单个核细胞,加入到γδT细胞完全培养基培养获得γδT细胞。用不同浓度的2-DG诱导培养γδT细胞48 h后,用CCK-8法测定不同浓度2-DG组的γδT细胞增殖和杀伤能力;用流式细胞术检测γδT细胞CCR5的表达和杀伤功能指标的影响。结果:培养10 d后的γδT细胞纯度达到(88.18±3.41)%。2-DG浓度在0~1.0 mmol/L时对γδT细胞的增殖影响不明显,而当浓度大于1.0 mmol/L后能显著抑制γδT细胞的增殖。2-DG浓度在0~2.0 mmol/L范围内能促进CCR5的表达,且在0.5和1.0 mmol/L时能促进杀伤指标CD107a和穿孔素的表达及对结肠癌HCT116细胞的杀伤能力。结论:2-DG能促进γδT细胞表面趋化因子受体CCR5的表达,且在一定浓度范围内能提高γδT细胞的体外杀伤功能。     

IL-21增强γδT细胞体外抗肿瘤活性的实验研究

探讨IL-21对人外周血γδT细胞抗肿瘤活性的影响。分离健康人外周血单个核细胞(PBMC),分别在有或无IL-21参与的条件下,加入到含异戊烯焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate,IPP)、IL-2或IL-15的RPMI 1640完全培养基中诱导培养γδT细胞。在培养的第10天用台盼蓝染色计数细胞;采用流式细胞术检测各组γδT细胞的纯度及γδT细胞穿孔素、颗粒酶B和CD107a的表达;用CCK-8试剂盒检测γδT细胞对K562细胞的体外杀伤效应。结果显示,不同细胞因子组诱导10d后γδT细胞纯度均达到70%以上,IL-2+IL-21、IL-15+IL-21和IL-2+IL-15+IL-21组与IL-2、IL-15组相比,细胞纯度和扩增倍数没有显著性变化;IL-2+IL-21、IL-15+IL-21和IL-2+IL-15+IL-21组γδT细胞穿孔素、颗粒酶B和CD107a的表达及对K562细胞的杀伤活性均显著高于IL-2、IL-15单独组。以上结果表明,IL-21可通过上调γδT细胞穿孔素和颗粒酶B的表达增强其抗肿瘤活性。     

HLA-E的表达对RSA及PIH患者外周血γδT细胞细胞毒效应的影响

探索HLA-E分子的表达对习惯性流产(recurrent spontaneous abortion,RSA)及妊高症(pregnancy-induced hypertension,PIH)患者外周血γδT细胞细胞毒效应的影响。通过固相抗体法体外分离并扩增外周γδT血细胞作为效应细胞,以HLA-E转染的LcL721.221细胞(.221E)及滋养层细胞JAR作为靶细胞,采用4 h乳酸脱氢酶(LDH)释放试验观察NK细胞对靶细胞的细胞毒效应。结果显示,来自RSA、PIH及正常对照组的γδ细胞均不能有效杀伤HLA-E转染的.221E细胞及JAR细胞,但未经HLA-E转染的LcL721.221细胞则被溶解;抗HLA-E单抗3D12及抗CD94单抗HP-3B1的阻断可以分别部分恢复效应细胞对靶细胞LcL721.221E的杀伤,但对JAR细胞没有影响;与正常对照组相比,RSA及PIH患者外周血γδT细胞对.221、.221E及JAR细胞的细胞毒活性没有显著性差异(P>0.05)。这说明HLA-E分子的体外表达可以保护靶细胞防止γδT细胞的杀伤,该保护机制主要是通过γδT细胞受体CD94/NKG2对靶细胞表面HLA-E分子的识别来实现的;滋养层细胞对γδT细胞杀伤的抵抗可能存在MHC I类非依赖的机制。     

多发性骨髓瘤细胞XG-7诱导CD8和TCRαβ阳性的T细胞增殖分化成为细胞毒效应细胞

采用经密度梯度离心获得的正常健康人外周血淋巴细胞 (PBL )与多发性骨髓瘤细胞XG 7进行混合肿瘤淋巴细胞培养。3 H TdR掺入实验证实XG 7细胞可刺激PBL增殖 ;间接免疫荧光检测显示增殖的PBL中 ,CD4+ /CD8+ 细胞比例偏移 ,CD8+ T细胞增加。激活的CD8+ T细胞在含IL 2的培养体系中得到迅速扩增 ,占细胞总数的 96 %以上。流式细胞仪检测显示 ,扩增的T细胞表达CD3,CD8和TCRαβ ,而不表达CD4,CD16和CD5 6。细胞毒实验结果表明 ,扩增的CD8+ T细胞不仅杀伤原刺激细胞XG 7,也可杀伤其它肿瘤细胞如RPMI82 2 6 ,U2 6 6和Daudi。上述结果说明了经XG 7细胞所刺激PBL中的CD8+ T细胞可增殖分化成为抗肿瘤细胞的细胞毒效应细胞 ,这使得它们有可能在临床上用于肿瘤病人的治疗。     

协同刺激分子CD28在结核杆菌抗原体外激活人外周血γδT细胞中的作用

目的 :为了探讨CD2 8协同刺激分子在结核杆菌 (Mtb)低分子多肽抗原体外激活人外周血γδ T细胞中的作用。方法 :采用激发型抗CD2 8单抗模拟第二信号 ,Mtb低分子多肽抗原作为刺激原 ,对纯化的人外周血T细胞进行体外刺激和培养 ;用流式细胞仪检测γδ T细胞上CD2 8分子的表达、γδ T细胞的增殖效应及活化的γδ T细胞上CD6 9分子的表达。结果 :人外周血γδ T细胞中有 5 0 %左右表达CD2 8分子 ;抗CD2 8单抗协同Mtb抗原可刺激γδ T细胞的活化和增殖 ;但抗CD2 8单抗或Mtb抗原单独刺激则无作用。活化的γδ T细胞表面表达CD6 9分子。结论 :Mtb抗原在选择性活化人外周血γδ T细胞时需要第二信号的参与 ;CD2 8在Mtb抗原激活γδ T细胞时可提供协同刺激信号 ;CD6 9可作为γδ T细胞的早期活化标志。     

人γδT细胞识别肿瘤抗原的分子机理研究

作者在自建体外扩增人γδT细胞的基础上,分析了γδT细胞识别肿瘤细胞的分子机理.主要结果:(1)γδT细胞能够杀伤K562、Daudi、XG-7等肿瘤细胞,杀伤率分别高达62±7.2%,73±8.7%和84±6.1%;(2)γδT细胞对正常淋巴母细胞(自体和异体)的细胞毒活性均低于20%;(3)抗热休克蛋白70(HSP-70)单克隆抗体可阻断γδT细胞对XG-7细胞的杀伤作用,但对Daudi,K562肿瘤细胞却无明显的阻断作用.提示γδT细胞可通过识别肿瘤细胞表面的HSP或相关分子,并以MHC非限制性方式杀伤肿瘤细胞.     

AR-A014418对γδT细胞增殖、凋亡及杀伤功能的影响

目的:观察糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)选择性抑制剂AR-A014418对体外扩增的γδT细胞的细胞活性包括增殖、凋亡和杀伤功能的影响。方法:采用人淋巴细胞分离液分离健康人外周血中单个核细胞,在γδT细胞完全培养基中培养获得γδT细胞。用不同浓度的AR-A014418诱导培养γδT细胞72 h后,用流式细胞术检测各诱导处理组γδT细胞的增殖、凋亡和杀伤能力;用Western blot检测γδT细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和Caspase-3表达情况。结果:AR-A014418浓度在0. 3～10μmol/L时能促进γδT细胞的增殖并抑制其凋亡。同时促凋亡蛋白Cleaved caspase-3和Bax表达逐渐减弱,而抗凋亡蛋白Bcl-2表达逐渐增强。尤其是在3μmol/L时,γδT细胞增殖活性最强,而且体外杀伤人肝癌HepG2细胞和人胃癌SGC-7901细胞活性也显著提高。结论:GSK-3β抑制剂AR-A014418在3μmol/L浓度时,可以抑制体外扩增γδT细胞的凋亡,并能增强其体外增殖和杀伤肿瘤活性,提示AR-A014418具有一定的免疫调节功能,为今后用于体外扩增γδT细胞提供实验依据。     

糖原合酶激酶-3β抑制剂TWS119联合细胞因子促进CD45RA~+CD62L~+γδT细胞分化及功能

目的体外研究糖原合酶激酶-3β抑制剂TWS119联合细胞因子IL-7、IL-15和IL-21对CD45RA~+CD62L~+γδT细胞分化、凋亡及其功能的影响。方法采用帕米磷酸二钠和IL-2体外扩增健康人外周血单个核细胞中的γδT细胞或联合加入IL-7、IL-15、IL-21和TWS119进行诱导培养。采用细胞计数仪和流式细胞仪检测各培养组中γδT细胞的增殖、分化、凋亡、细胞因子分泌及其杀伤肿瘤活性。结果 IL-7、IL-15和IL-21联合TWS119可以促进γδT细胞分化、增殖和抗凋亡能力,尤其在TWS119+IL-7/15/21联合组中,CD45RA~+CD62L~+γδT细胞的比例与数量最高,且该群细胞在体外具有持续的增殖、IFN-γ分泌和杀伤人肝癌HepG2细胞活性。结论在帕米磷酸二钠和IL-2的培养条件下,TWS119体外联合细胞因子IL-7、IL-15和IL-21可以有效扩增CD45RA~+CD62L~+γδT细胞,为后期该群细胞体内抗肿瘤活性研究和临床应用提供依据。     

双氢青蒿素对γδT细胞杀伤SW1990细胞的增强作用

目的 探讨双氢青蒿素(dihydroartemisinin,DHA)对人外周血γδT细胞体外增殖及抗肿瘤活性的影响.方法 分离健康人外周血单个核细胞(PBMC),加入到含异戊烯焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate,IPP)和IL-2的RPMI 1640完全培养基中诱导培养γδT细胞.不同浓度的DHA作用于γδT细胞4δ h后,MTT法检测各药物浓度组γδT细胞的增殖能力,采用流式细胞术检测各组γδT细胞穿孔素、颗粒酶B和CD107a的表达,用CCK-8试剂盒检测各组γδT细胞对SW1990细胞的体外杀伤效应.结果 培养8d时各组γδT细胞纯度达到了75.46％ ±5.32％.浓度为50～100μmol/ml的DHA能显著促进γδT细胞的增殖.DHA处理后γδT细胞杀伤胰腺癌SW1990细胞能力及其穿孔素、颗粒酶B和CD107a的表达均显著高于对照组.结论 DHA可增强γδT细胞抗肿瘤活性,其机制可能与其促进γδT细胞穿孔素和颗粒酶B的表达上调有关.