富血小板血浆诱导犬骨髓间充质干细胞的体外成骨*

背景：富血小板血浆中含有大量骨再生所需的生长因子,且各生长因子的比例是机体自身形成的,具有良好的协同作用。 目的：探讨富血小板血浆体外诱导犬骨髓间充质干细胞成骨的效果。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2007-06/2008-02在中南大学湘雅医院中心实验室完成。 材料：健康12月龄雄性比格犬,由中南大学湘雅医学院实验动物部提供。 方法：收集第3代犬骨髓间充质干细胞,分为4组：对照组加入标准培养基;成骨诱导培养基组向培养板孔内加入含胎牛血清、地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C的高糖DMEM培养基;富血小板血浆组根据预实验结果,向培养板内加入含体积分数为6.25%富血小板血浆的低糖DMEM培养基;联合组向培养板内加入含地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C、体积分数为6.25%富血小板血浆的高糖DMEM培养基。 主要观察指标：细胞内碱性磷酸酶活性,免疫细胞化学染色检测Ⅰ型胶原的表达,改进Von Kossa染色标记钙结节形成情况,RT-PCR检测诱导后骨钙素mRNA的表达。 结果：各组碱性磷酸酶活性均随诱导时间的延长而逐渐增高,联合组升高幅度最为明显(P < 0.05)。诱导7,14 d后,成骨诱导培养基组、联合组Ⅰ型胶原均呈阳性表达,富血小板血浆组、对照组Ⅰ型胶原始终呈阴性表达。诱导14 d后,成骨诱导培养基组、联合组可见卵圆形钙结节。诱导7,14 d后,对照组与富血小板血浆组之间骨钙素mRNA表达水平无明显差异(P > 0.05),此2组骨钙素mRNA表达水平均明显低于成骨诱导培养基组、联合组(P < 0.05);成骨诱导培养基组骨钙素mRNA表达水平明显低于联合组(P < 0.05)。 结论：经成骨条件培养基诱导培养的骨髓基质干细胞,富血小板血浆能在体外显著诱导其成骨指标的表达。     

富血小板血浆诱导人骨髓基质干细胞的体内异位成骨**☆

背景：近年来的研究发现,结合组织工程技术利用经诱导转化的骨髓基质干细胞能成功地在动物体内再生出骨组织,并在大型哺乳动物负重骨缺损的修复实验中取得了较好的修复效果。 目的：观察富血小板血浆诱导培养人骨髓基质干细胞在体内的成骨特性,探讨采用富血小板血浆诱导培养的人骨髓基质干细胞与珊瑚羟基磷灰石材料体内异位成骨的可行性。 设计、时间及地点：配对样本观察,于2007-10/2008-04在中山大学组织工程实验室完成。 材料：4周龄BALB/C裸鼠14只,体质量22~24 g,麻醉后将裸鼠两侧股部切开,于股部肌间隙内制成肌袋模型。 方法：14只裸鼠左侧肌袋内植入珊瑚羟基磷灰石复合富血小板血诱导培养的人骨髓基质干细胞,作为实验组;右侧背部肌袋内植入单纯珊瑚羟基磷灰石材料为对照组。 主要观察指标：分别于植入后4,8,12周对比观察两组裸鼠活动及进食情况;X射线平片观察阻射率;苏木精-伊红染色观察骨形成情况。 结果：14只裸鼠均进入结果分析。①植入材料后裸鼠活动及进食均正常,伤口愈合良好。材料随植入时间的延长无明显吸收,而材料周围的肌肉组织等软组织由外向内逐渐长入材料孔隙内有所增多。②随时间延长两组X射线平片阻射影像密度逐步增加。植入材料后4,8,12周实验组与对照组相比,差异有非常显著性意义(P < 0.01)。③植入材料后4周,实验组可见珊瑚羟基磷灰石表面有细胞生长,孔隙内有结缔组织长入;对照组仅见珊瑚羟基磷灰石表面有细胞生长。8周时珊瑚羟基磷灰石表面有新生骨形成,孔隙内和孔隙边缘可见骨样组织沉积和少量软骨样组织形成;对照组仅见少量纤维结缔组织长入。12周时珊瑚羟基磷灰石材料表面有较多成熟编织骨形成,部分区域可见髓腔样结构形成,并有血管长入;对照组仍未见新骨及骨样组织形成。 结论：富血小板血浆诱导培养人骨髓基质干细胞与珊瑚羟基磷灰石材料在裸鼠体内能够良好的成骨,随时间的延长,成骨特性越明显;体内采用肌袋包裹的方法能有效增加血运及促进组织工程骨血管化生成,促进成骨。     

自体富血小板血浆促进兔上颌缝的牵张成骨

背景：富血小板血浆内含多种高浓度的生长因子，具有促进新骨生成，加速愈合的作用，对牵张成骨的作用尚无公识性结论。 目的：观察自体富血小板血浆对兔上颌骨牵张成骨的影响。 设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2007-07/08在中山大学北校区何母实验楼生理实验室完成。 材料：3~5月龄健康家兔16只，雌雄各半，体质量1.4~1.7 kg，随机分为实验组和对照组，每组8只。自制上切牙带环、外置式前牵引面具、牵引橡皮圈。凝结剂由1 000 U牛凝血酶溶于1 mL 100 g/L 氯化钙制成。 方法：分别在家兔左侧前颌缝的两侧置入钛钉(直径1.5 mm)，戴自制前牵引装置,试验组在牵张开始时，注射V(富血小板血浆)∶V(凝结剂)＝ 9∶1混合的凝胶样物质至左侧前颌缝内。两组分别持续牵引1周和3周，每个时间点4只家兔。 主要观察指标：牵引结束后测量骨缝两侧钛钉间距离的增加值以及组织学观察结果。 结果：对照组和试验组家兔上颌均向前移位。同对照组相比，实验组骨缝标志钉间距离增加值较大，新骨生成与矿化较快，血管分布较多，牵张间隙中骨小梁较为粗壮和成熟。 结论：富血小板血浆有助于骨组织再生，对兔上颌牵张成骨具有促进作用。     

富血小板血浆体外培养骨髓间充质干细胞的增殖与胶原产生

间充质干细胞是可大量获取的肌腱组织工程种子细胞,但体外如何诱导其分化为功能化腱样细胞成为此项技术的关键。 目的：观察富血小板血浆对体外培养骨髓间充质干细胞分裂增殖和胶原产生的影响。 方法：分离培养兔骨髓间充质干细胞,并采用自体富血小板血浆对骨髓间充质干细胞进行干预(设立高、中、低剂量富血小板血浆组,并设空白对照组),每日计数细胞并绘制细胞生长曲线,用MTT比色法分析各组骨髓间充质干细胞的存活和增殖能力。以ELISA定量检测细胞的胶原产生,通过RT-PCR反应测定富血小板血浆干预前后细胞Ⅰ型胶原基因的表达。 结果与结论：高、中、低浓度富血小板血浆组骨髓间充质干细胞均保持较高的增殖活性,呈快速生长,曲线上升幅度大,与空白对照组比较差异有显著性意义(P < 0.05)。培养时间越长作用越明显,培养一定时间后其作用具有剂量依赖性,较高剂量的富血小板血浆对细胞的增殖作用较为明显。富血小板血浆能明显促进骨髓间充质干细胞的Ⅰ和Ⅲ型胶原合成,剂量越大,刺激胶原产生的作用越明显。说明骨髓间充质干细胞具备组织工程化肌腱种子细胞的基本条件,富血小板血浆具有促进间充质干细胞向肌腱细胞转化的作用。     

富血小板血浆对人骨髓间充质干细胞成骨诱导的影响*

背景：富血小板血浆是经过特殊方法提取的血小板含量丰富的血浆,相较普通血清含有更丰富的细胞因子,如血小板衍生因子、转化生长因子β、血管内皮生长因子等。 目的：观察富血小板血浆对成骨诱导人骨髓间充质干细胞生物学特性的影响,拟探讨促进人骨髓间充质干细胞的增殖与诱导成骨细胞的培养方法。 设计、时间及地点：配对样本对比观察,于2007-03/2008-03在中山大学组织工程实验室完成。 对象：18名健康志愿者,男12名,女6名,平均年龄27.5岁。随机分为3组：富血小板血浆组、胎牛血清组、无血清对照组,每组6人。 方法：抽取18名健康志愿者自体外周静脉血获取富血小板血浆。采用密度梯度离心法获取健康志愿者骨髓间充质干细胞,常规原代培养,传代诱导培养时根据分组情况,分别采用10%AB型血清、10%自体富血小板血浆与无血清,配比高糖DMEM培养基、50 mg/L抗坏血酸、10-8 mol/L地塞米松、10-3 mol/L β-甘油磷酸钠。 主要观察指标：倒置相差显微镜、扫描电镜观察各组细胞形态,MTT法检测细胞增殖情况,细胞碱性磷酸酶活性、骨钙素水平。 结果：3组细胞均在接种后12~24 h开始贴壁,并由圆形逐步变化为梭型、多角形、有多个突起的不规则形状等。细胞传代诱导培养后,富血小板血浆组与胎牛血清组细胞生长迅速,明显快于无血清对照组（P < 0.05）。从传代培养第2、4、6代的细胞生长看,随着培养时间的延长富血小板血浆组细胞增殖明显快于胎牛血清组。３组细胞碱性磷酸酶活性与骨钙素随诱导时间的延长而增高,培养第3,6,9,12天胎牛血清组碱性磷酸酶活性较富血小板血浆组低,培养第15天两组无明显差异。培养第3,6,9天富血小板血浆组细胞内骨钙素含量与胎牛血清组无明显差别,12 d后明显高于胎牛血清组。无血清对照组碱性磷酸酶活性及骨钙素含量较富血小板血浆组变化程度明显减小,并且各时间点碱性磷酸酶活性与骨钙素含量均低于富血小板血浆组（P < 0.01）。 结论：自体富血小板血浆能够有效加快人骨髓间充质干细胞的增殖,并能有效促进诱导培养的人骨髓间充质干细胞成骨特性表达。     

不同体积分数富血小板血浆对犬骨髓间充质干细胞增殖的影响*

背景：间充质干细胞的增殖和分化与富血小板血浆中的血小板浓度密切相关,浓集倍数过小可能达不到应有效应,太大则对骨再生产生抑制作用。 目的：观察不同体积分数的富血小板血浆对犬骨髓间充质干细胞增殖的影响。 设计：细胞学体外观察。 材料：健康12月龄雄性比格犬,由中南大学湘雅医学院实验动物部提供。 方法：取生长良好的第5代犬骨髓间充质干细胞,调整细胞浓度至3×108 L-1,以200 μL/孔接种于96孔板,常规培养24 h后,弃原培养液及未贴附的细胞。取制备好的富血小板血浆凝胶,加入含青霉素、链霉素的无血清低糖DMEM培养基分别稀释成5%,6.25%,7.5%,8.75%,10%共5个体积分数,向上述96孔板中每孔加入200 μL,放入培养箱内,并设立空白对照。 主要观察指标：MTT法观察不同体积分数富血小板血浆对犬骨髓间充质干细胞增殖活性的影响。 结果：与空白对照组比较,干预早期各体积分数的富血小板血浆组均可促进犬骨髓间充质干细胞增殖。随干预时间的延长,体积分数为8.75%,10%富血小板血浆组在第6天增殖速度开始呈缓慢上升,进入平台期;体积分数为5%,6.25%富血小板血浆组细胞数量呈快速增殖,尤以体积分数为6.25%富血小板血浆组为甚。 结论：富血小板血浆可在干预早期显著促进犬骨髓间充质干细胞增殖,其增殖强度与富血小板血浆体积分数相关,低体积分数条件下普遍取得较佳的增殖效应。     

富血小板血浆促进脂肪间充质干细胞的体内外成骨****☆

背景：添加富血小板血浆可促进细胞体外成骨表型的快速转化,从而有效成骨。 目的：观察富血小板血浆对脂肪间充质干细胞体内和体外成骨能力的影响。 方法：第3代兔脂肪间充质干细胞进行成骨诱导培养,分为对照组和富血小板血浆组。细胞接种到钙磷陶瓷支架上后,体内外观察细胞/载体复合物的成骨情况。 结果与结论：两组细胞随着诱导时间的延长碱性磷酸酶活性增高,达到高峰值后随后逐渐下降,诱导后14 d时,富血小板血浆组即达到高峰值,对照组18 d达到高峰值。细胞/载体复合体切片Von Kossa染色显示两组载体的孔隙内衬面呈多层黑染状,有大量钙盐沉积。甲苯胺蓝染色显示载体的孔隙中可见成熟的骨质存在,周边区域较中心多。体外钙盐沉积对照组多,体内成骨面积富血小板血浆组多(P < 0.05)。说明,富血小板血浆可有效诱导脂肪间充质干细胞体内和体外成骨。     

自体富血小板血浆对人骨髓来源内皮祖细胞功能活性的影响*

背景：富血小板血浆是经过特殊方法提取的血小板含量丰富的血浆,相较普通血清含有更丰富的细胞因子,如血小板衍生因子、转化生长因子β、血管内皮生长因子等。 目的：观察富血小板血浆对人骨髓血来源的内皮祖细胞生物学特性的影响,拟探讨富血小板血浆在骨创伤修复血管化中的作用。 方法：抽取16名健康志愿者自体外周静脉血获取富血小板血浆。采用密度梯度离心法获取骨髓血内皮祖细胞,将培养8 d的内皮祖细胞随机分为对照组和富血小板血浆组,胎牛血清组采用培养基为体积分数为10%胎牛血清配比高糖DMEM培养基加青霉素、链霉素各100 U/mL;无血清对照组采用高糖DMEM培养基加青霉素、链霉素各100 U/mL。相差显微镜观察细胞生长情况,激光共聚焦显微镜鉴定,AC133和vWF双染阳性细胞为正在分化的内皮祖细胞,MTT法检测细胞培养6,12,48 h增殖情况,Transwell小室检测迁移,Matrigel管腔形成实验检测管腔形成能力。 结果与结论：①各组细胞均在接种后12~24 h开始贴壁,并由圆形逐步变化为梭型、多角形、不规则形状等。②富血小板血浆作用于内皮祖细胞6 h后,A490值明显高于对照组(P < 0.05);12 h时其促进作用更强(P < 0.01)。在0~48 h,随时间延长,富血小板血浆促进内皮祖细胞增殖的作用相应增强。③富血小板血浆可提高内皮祖细胞的迁移能力,6 h开始明显增强(P < 0.05),于12 h达高峰(P < 0.01),48 h有所下降,但仍明显高于对照组(P < 0.01)。④富血小板血浆显著增强内皮祖细胞体外管腔形成能力,在作用时间为48 h最为显著,并且形成的管腔样结构也较对照组复杂。     

复合骨髓间充质干细胞和富血小板血浆煅烧骨在大鼠下颌骨缺损修复中的

背景：用于修复骨缺损的方法有直接植入、复合细胞植入以及加入生长因子植入。近年来,复合细胞植入和加入生长因子植入的研究受到比较广泛的关注。 目的：观察复合骨髓间充质干细胞和富血小板血浆的煅烧骨修复颌骨缺损的作用。 设计、时间及地点：随机对照动物实验,于2008-04在青岛大学医学院附属医院中心实验室及口腔研究室完成。 材料：取成年牛长骨骨骺端,经脱脂、脱蛋白、煅烧处理后制得煅烧骨。将第3代的骨髓间充质干细胞悬液加到煅烧骨上制备煅烧骨-骨髓间充质干细胞复合体。将富血小板血浆因子滴加到将要植入的煅烧骨-骨髓间充质干细胞复合体上,制得含富血小板血浆因子的煅烧骨-骨髓间充质干细胞复合体。 方法：用牙钻在Wistar大鼠左侧下颌骨下缘备出1.0 cm×0.8 cm大小缺损,将30只大鼠随机分为3组,每组10只。对照组：将煅烧骨直接植入大鼠下颌骨缺损中。复合骨髓间充质干细胞组：将煅烧骨-骨髓间充质干细胞复合体植入大鼠下颌骨缺损中。复合骨髓间充质干细胞+富血小板血浆组：将含富血小板血浆因子的煅烧骨-骨髓间充质干细胞复合体植入大鼠下颌骨缺损中。 主要观察指标：观察各组煅烧骨在4,8,12周的成骨情况。 结果：复合骨髓间充质干细胞+富血小板血浆组煅烧骨在4,8,12周3个时间点的成骨情况明显优于对照组煅烧骨及复合骨髓间充质干细胞组煅烧骨(P < 0.01),对照组和复合骨髓间充质干细胞组之间的成骨情况差异无显著性意义(P > 0.05)。 结论：复合骨髓间充质干细胞和富血小板血浆的煅烧骨可以促进下颌骨缺损修复,增加血管化与骨化。     

富血小板血浆在骨愈合治疗中的作用

背景：富血小板血浆可明显促进各种组织的修复和愈合。临床上运用其治疗骨软骨以及软组织缺损等骨科疾病方面已取得了很多成果。 目的：简要综述近年来富血小板血浆相关研究,总结其在骨科基础研究与临床应用中的进展。 方法：以platelet-rich plasma, bone formation, tissue engineering为检索词,检索Pubmed数据库(1999-01/2011-01),以富血小板血浆,骨缺损,组织工程为检索词,检索中国期刊全文数据库(1999-01/2011-01)。纳入与干细胞以及干细胞在骨科应用方面的基础和临床研究,排除不相关及重复研究。计算机初检得到301 篇文献,根据纳入排除标准,最终纳入30篇。 结果与结论：尽管目前还存在争论,但富血小板血浆仍是一种非常有潜力的技术,尤其是作为细胞支架在组织工程中的应用如能被进一步研究证实有效,将对骨组织工程乃至其他各种组织工程研究产生重大的影响。因此除了规范研究在循证医学方面的要求之外,这应该是PRP今后研究的有一个重要方向。     

Evaluation of in vitro proliferative activity of human fetal neural stem/progenitor cells using indirect measurements of viable cells based on cellular metabolic activity

To scale up human neural stem/progenitor cell (NSPC) cultures for clinical use, we need to know how long these cells can live ex vivo without losing their ability to proliferate and differentiate; thus, a convenient method is needed to estimate the proliferative activity of human NSPCs grown in neurosphere cultures, as direct cell counting is laborious and potentially inaccurate. Here, we isolated NSPCs from human fetal forebrain and prepared neurosphere cultures. We determined the number of viable cells and estimated their proliferative activity in long-term culture using two methods that measure viable cell numbers indirectly, based on their metabolic activity: the WST-8 assay, in which a formazan dye is produced upon reduction of the water-soluble tetrazolium salt WST-8 by dehydrogenase activity, and the ATP assay, which measures the ATP content of the total cell plasma. We compared the results of these assays with the proliferative activity estimated by DNA synthesis using the 5-bromo-2'-deoxyuridine incorporation assay. We found the numbers of viable human NSPCs to be directly proportional to the metabolic reaction products obtained in the WST-8 and ATP assays. Both methods yielded identical cell growth curves, showing an exponentially proliferative phase and a change in the population doubling time in long-term culture. They also showed that human NSPCs could be expanded for up to 200 days ex vivo without losing their ability to proliferate and differentiate. Our findings indicated that indirect measurements of viable cells based on metabolic activity, especially the ATP assay, are very effective and reproducible ways to determine the numbers of viable human NSPCs in intact neurospheres.     

Denervation-induced proliferative changes of triads in rabbit skeletal muscle

Protein compositional and functional differences exist between longitudinal and junctional sarcoplasmic reticulum (SR) in relation to Ca transport and to Ca release. In light of this knowledge, we have reinvestigated the effects of denervation on SR of rabbit gastrocnemius, a predominantly fast muscle. Electron microscopy of 2-weeks denervated muscle showed proliferation of transverse tubules (TT), forming junctional contacts with SR terminal cisternae (TC). At coincident periods, the yield of muscle microsomes was increased, and their fractionation by sucrose-density centrifugation demonstrated a relative increase of heavy vesicles. Thin-section electron microscopy of heavy SR from denervated muscle showed an increased number of vesicles containing calsequestrin (CS) as compared with control muscle. Electrophoretic analysis confirmed the relative decrease of Ca-ATPase protein and the striking increase of CS both in total microsomes and in heavy SR vesicles. Calcium loading and Ca-ATPase activity as well as the density of Ca-ATPase protein were decreased to a similar extent (20-30%) in denervated muscle microsomes. Stimulation of Ca-ATPase activity by Ca-ionophore A23187 showed that the vesicles were tightly sealed. When probed by competitive ELISA with antibody to SR Ca-ATPase from pure fast muscle, the Ca-ATPase of denervated microsomes was found to be highly cross reactive. Cleveland's peptide maps of the Ca-ATPase protein after partial digestion with S. aureus V8 protease also showed no significant change after denervation. Changes in cholesterol content and in the ratio of Mg-ATPase to Ca-ATPase activity of denervated muscle microsomes indicated a 4-fold increase of TT protein, i.e., from about 3% to not more than 12% of total protein, at 2 weeks after denervation. All these changes were totally reversed upon reinnervation of muscle fibers, and the consequent muscle recovery, as obtained by nerve crushing instead of nerve sectioning. From these results, we conclude that denervated adult fast muscle, similarly to immature fast muscle, contains more junctional SR. However, the molecular and catalytic properties of the Ca-ATPase are unaffected by denervation.     

当归多糖对体外造血微环境中肌卫星细胞增殖的影响

背景：肌卫星细胞是造血功能重建最有希望的种子细胞来源。当归多糖对造血干细胞和造血祖细胞的增殖分化存在显著的促进作用,也可以有效改变肌卫星细胞的生长特性。 目的：观察当归多糖对不同培养条件下乳鼠骨骼肌卫星细胞增殖的影响。 方法：分离小鼠肌卫星细胞,培养5 d后采用α-肌动蛋白免疫细胞化学鉴定。将细胞接种于96孔板培养24 h,使细胞同步化;将细胞分为空白对照组,骨髓基质细胞培养上清组,加入含50,100,200,300,400 mg/L当归多糖的DMEM/F12培养基实验组及经50,100,200,300,400 mg/L当归多糖干预后骨髓基质细胞条件培养基组。经实验处理后采用MTT法检测各组细胞的增殖活性。 结果与结论：分离培养的骨骼肌卫星细胞呈α-肌动蛋白染色阳性,通过MTT法检测发现,经不同浓度当归多糖干预后的骨髓基质细胞条件培养基培养的各组肌卫星细胞增殖显著。且经当归多糖干预的骨髓基质细胞条件培养基可以有效改变肌卫星细胞的生长特性,并呈剂量依赖性。     

脑肿瘤干细胞的增殖活性与病理级别的相关性研究

目的检测增殖细胞核标记物Ki-67与脑肿瘤干细胞（BTSCs）标记物CD133、Nestin在60例脑胶质瘤组织中的表达,探讨BTSCs的增殖活性与病理级别的相关性。方法采用免疫组织化学SP法检测CD133、Nestin和Ki-67在60例胶质瘤组织中的表达;采用免疫荧光双染法检测Ki-67、CD133和Nestin之间的共表达情况。计算两种方法中CD133＋细胞、Nestin＋细胞和Ki-67＋细胞所占的百分率,并将Ki-67＋细胞与CD133＋细胞、Nestin＋细胞和肿瘤病理分级分别进行相关性分析。结果按照WHO 2000的神经系统肿瘤分类分级标准所有标本分为Ⅱ级18例,Ⅲ级23例,Ⅳ级19例,在不同的病理级别组中,CD133＋、Nestin＋和Ki-67＋细胞的表达有明显差异,并且免疫荧光双染相比免疫组化单染更能代表BTSCs的增殖活性研究。在免疫荧光共表达中,随着病理级别的升高,CD133＋/Ki-67＋细胞（F=30.668,P=0.000）或Nestin＋/Ki-67＋细胞（F=15.316,P=0.000）的百分比差异都有显著性,并且同时均与CD133＋/Nestin＋BTSCs的表达成正相关。结论Ki-67＋指标与肿瘤级别成正相关,可以作为预后判断的指标,同时与BTSCs标记物CD133、Nestin的表达之间也有明显的相关性,并且,免疫荧光双染得出的BTSCs的增殖活性与病理级别的相关性研究更有统计学意义。