细胞周期蛋白激酶抑制剂flavopiridol对尤文肉瘤耐药细胞增殖抑制的实验研究

目的:探讨细胞周期蛋白激酶抑制剂(flavopiridol)在体内外抑制尤文肉瘤阿霉素耐药细胞株WE-68/ADR增殖的作用及其机制。方法:四甲基偶氮唑蓝法(MTT法)测定细胞增殖抑制率。流式细胞计数法测量flavopiridol给药后WE-68/ADR细胞周期的变化及凋亡率。免疫印迹法(Western-blot)检测细胞中Bax、Bcl-2、p53及活化型多聚ADP核糖多聚酶(PARP-85)蛋白的表达。皮下注射WE-68/ADR细胞建立荷瘤裸鼠模型,17flavopiridol腹腔内给药,测量肿瘤体积及裸鼠体重变化,计算肿瘤抑制率。结果:Flavopiridol可抑制尤文肉瘤阿霉素耐药细胞株WE-68/ADR的细胞增殖,其效果呈时间及浓度相关性(P<0.05)。Flavopiridol给药后,耐药细胞株WE-68/ADR的细胞凋亡比明显高于对照组(P<0.05)。同时,耐药细胞株中的Bax、p53及PARP-85的表达增加,而Bcl-2的表达被下调。Flavopiridol可有效抑制荷瘤小鼠体内耐药细胞株的生长。结论:细胞周期蛋白激酶抑制剂flavopiridol可在体内外有效抑制尤文肉瘤阿霉素耐药细胞株的增殖,其机制可能与p53介导的线粒体凋亡信号传导途径有关。     

Flavopiridol诱导耐阿霉素尤文肉瘤细胞株VH-64/ADR 凋亡及作用机制的研究

目的:探讨细胞周期蛋白酶抑制剂flavopiridol(FP)对耐阿霉素尤文肉瘤细胞增殖抑制及凋亡诱导的作用机制.方法:采用MTT法测定阿霉素(ADM)及falvopiridol对VH-64/ADR细胞的半数抑制浓度(IC50),计算耐药倍数;流式细胞计数仪(FCM)检测falvopiridol给药后VH-64/ADR细胞周期的变化;Western-blotting方法检测细胞中Bcl-2、pro-caspase-3、活化型多聚ADP核糖多聚酶(PARP-85)蛋白的表达.结果:flavopiridol可抑制尤文肉瘤耐阿霉素细胞株VH/ADR的细胞增殖,其效果呈时间及浓度相关性(P<0.05).flavopiridol给药后,耐药细胞株VH-64/ADR的细胞凋亡率明显高于对照组(P<0.05);bcl-2、pro-casepase-3表达下调,而活性型PARP表达上调. 结论:FP可有效诱导VH-64/ADR细胞发生凋亡,其机制可能与线粒体信号传导途径有关.     

Flavopiridol诱导耐阿霉素尤文肉瘤细胞株VH-64／ADR凋亡及作用机制的研究

目的：探讨细胞周期蛋白酶抑制剂flavopiridol（FP）对耐阿霉素尤文肉瘤细胞增殖抑制及凋亡诱导的作用机制。方法：采用MTT法测定阿霉素（ADM）及falvopifidol对VH-54／ADR细胞的半数抑制浓度（IC50）,计算耐药倍数;流式细胞计数仪（FCM）检测falvopiridol给药后VH-64／ADR细胞周期的变化;Western—blotting方法检测细胞中Bcl-2、pro—caspase-3、活化型多聚ADP核糖多聚酶（PARP-85）蛋白的表达。结果：flavopiridol可抑制尤文肉瘤耐阿霉素细胞株VH／ADR的细胞增殖,其效果呈时间及浓度相关性（P〈0．05）。flavopiridol给药后,耐药细胞株VH-54／ADR的细胞凋亡率明显高于对照组（P〈0．05）;bcl-2、pro—casepase-3表达下调,而活性型PARP表达上调。结论：FP可有效诱导VH-64／ADR细胞发生凋亡,其机制可能与线粒体信号传导途径有关。     

三氧化二砷诱导尤文肉瘤细胞凋亡及对EWS—FLil融合蛋白的影响

目的：探讨三氧化二砷（Arsenic trioxide，As2O3）诱导尤文肉瘤细胞凋亡及对融合蛋白EWS—FLi1表达的影响，．方法：应用噻唑蓝（MTF）法、形态学观察、原位末端标记法（TUNEL）、流式细胞术（FCM）观察As2O3对体外生长的尤文肉瘤RD—ES细胞系生物行为的影响：应用半定量RT—PCR测定应用As2O3前后c—mye基因mRNA水平的变化；应用免疫细胞化学及固定化蛋白印迹法（Western blot）观察用药前后EWS—FLi1融合蛋白表达水平的变化、结果：As2O3对体外生长的RD—ES细胞系具有明显抑制作用，并可诱导细胞凋亡、c-mye基因mRNA表达水平和EWS—FLil融合蛋白表达量随As2O3作用时间延长逐渐降低结论：常规治疗浓度的As2O3对体外生长的尤文肉瘤细胞具有明显的杀伤作用，其作用机制与改变线粒体膜通透性和抑制EWS—Flil融合蛋白、降低c一myc基因表达有关。     

三氧化二砷诱导尤文肉瘤细胞凋亡及对EWS-FLi1融合蛋白的影响

目的:探讨三氧化二砷(Arsenictrioxide,As₂O₃)诱导尤文肉瘤细胞凋亡及对融合蛋白EWS-FLi1表达的影响。方法:应用噻唑蓝(MTT)法、形态学观察、原位末端标记法(TUNEL)、流式细胞术(FCM)观察As₂O₃对体外生长的尤文肉瘤RD-ES细胞系生物行为的影响;应用半定量RT-PCR测定应用As₂O₃前后c-myc基因mRNA水平的变化;应用免疫细胞化学及固定化蛋白印迹法(Westernblot)观察用药前后EWS-FLi1融合蛋白表达水平的变化。结果:As₂O₃对体外生长的RD-ES细胞系具有明显抑制作用,并可诱导细胞凋亡。c-myc基因mRNA表达水平和EWS-FLi1融合蛋白表达量随As₂O₃作用时间延长逐渐降低。结论:常规治疗浓度的As₂O₃对体外生长的尤文肉瘤细胞具有明显的杀伤作用,其作用机制与改变线粒体膜通透性和抑制EWS-Fli1融合蛋白、降低c-myc基因表达有关。     

活性氧在2-甲氧雌二醇诱导骨尤文肉瘤细胞凋亡中的作用

目的研究在2-甲氧雌二醇（2-ME）诱导SK—N—MC尤文肉瘤细胞凋亡的过程中，调控细胞活性氧水平（ROS）的环节及ROS引发的下游事件。方法利用流式细胞仪、clark氧电极等手段及撤药实验、线粒体通透性转换（PT）孔干预等方法检测2-ME作用下凋亡的可逆性及呼吸链活性、线粒体跨膜电势（△ψm）、细胞ROS水平等参数的变化，并考察它们之间的关系。结果2-ME诱导SK—N—MC细胞发生依赖于ROS的细胞凋亡。2-ME作用3h内撤药，至24h无明显凋亡发生；3h后撤药，至24h有明显凋亡。2-ME作用下，线粒体呼吸链活性被抑制，ROS生成加速；△ψm经历“升高-降低”变化，3h时开始降低，PT孔稳定剂可维持△ψm不降低；ROS水平持续升高，3h时有跳跃性增高，胛孔稳定剂对ROS升高趋势无明显影响。结论2-ME作用引起sK—N—MC细胞呼吸链的抑制，引发△ψm的升高，由此造成ROS生成加速及ROS水平升高，当ROS水平突破-定阈值，引发了胛孔的不可逆开放及△ψm的消解乃至崩溃，并最终使细胞走向凋亡。ROS是2-ME诱导凋亡信号传导中的-个环节。     

RNA干扰细胞周期蛋白依赖激酶6基因对尤文肉瘤细胞生物学行为的影响

背景与目的：细胞周期蛋白依赖激酶6(cyclin-dependent kinase 6,CDK6)是一类丝/苏氨酸蛋白激酶,有实验报道其在尤文肉瘤细胞中呈高表达,但在尤文肉瘤细胞中的生物学功能及相关机理仍不十分清楚。本研究旨在通过研究小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)沉默CDK6基因表达,探讨其对尤文肉瘤A673、SK-ES-1细胞生物学行为的影响。方法：将化学合成的CDK6-siRNA转染至A673及SK-ES-1细胞中,实时荧光定量PCR法检测转染前后细胞中CDK6 mRNA的表达;蛋白质印迹法(Western blot)检测转染前后细胞CDK6以及CDK6下游因子视网膜母细胞瘤基因(Rb)、磷酸化Rb(P-Rb)的蛋白表达;分别采用CCK-8法、流式细胞仪、Transwell肿瘤细胞迁移和侵袭实验检测细胞增殖、周期、凋亡、迁移以及侵袭能力的变化。结果：实时荧光定量PCR结果显示,CDK6-siRNA能够明显降低细胞CDK6的表达(P<0.01)。抑制CDK6表达后细胞的增殖速度明显减缓,细胞周期分布发生改变,G0/G1期细胞的比例上升,而S期细胞的比例下降,细胞的早期凋亡率明显升高(P<0.01)。各组细胞的迁移能力：untreated组、si-con组及si-CDK6组A673细胞的穿膜细胞数分别为(516.00±58.59)个、(534.00±124.77)个、(192.33±68.92)个,SK-ES-1细胞的穿膜数分别为(371.33±29.67)个、(363.33±60.28)个、(200.00±20.00)个,差异有统计学意义(P<0.01);各组细胞的侵袭能力：untreated组、si-con组及si-CDK6组A673细胞的穿膜细胞数分别为(251.00±42.93)个、(238.67±78.62)个、(94.67±23.03)个,SK-ES-1细胞的穿膜数分别为(310.00±35.36)个、(302.33±41.31)个、(105.00±54.08)个,差异有统计学意义(P<0.01)。Western blot检测结果显示,CDK6-siRNA能够明显降低细胞CDK6以及下游因子P-Rb的表达(P<0.01),但细胞总Rb表达量无明显变化。结论：针对CDK6基因的特异性小RNA干扰片段能够下调CDK6基因及蛋白的表达,并抑制尤文肉瘤细胞增殖、侵袭和迁移,诱导其凋亡。     

曲古抑菌素A通过p53转录激活途径诱导尤文肉瘤细胞凋亡

目的：探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A（trichostatin A,TSA）诱导尤文肉瘤细胞株WE-68和VH-64凋亡及作用机制.方法：四甲基偶氮唑蓝法（MTT法）测定细胞增殖抑制率.流式细胞计数法测量TSA给药后细胞周期中sub-G1含量的变化.免疫印迹法（Western-blot）检测细胞中活化型多聚ADP核糖多聚酶（cleaved-PARP）,p53-lys382残基乙酰化和p53蛋白总量的表达.实时定量PCR和siRNA转染技术测定p53多个下游基因的mRNA水平改变和p53表达下调对TSA诱导凋亡的影响.结果：TSA抑制了尤文肉瘤细胞的增殖,诱导细胞周期中sub-G1含量和凋亡终产物cleaved-PARP蛋白表达的增加.TSA给药后,p53-lys382残基乙酰化表达量呈浓度依存性增加,同时上调p53下游因子p21,mdm2,Bax和PUMA的mRNA水平.另一方面,p53蛋白表达的下调明显削弱了TSA介导的p21表达的上调和cleaved-PARP的产生.结论：组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA能够通过激活p53高乙酰化表达来恢复p53转录功能,从而诱导尤文肉瘤细胞株产生凋亡.     

紫杉醇对尤文肉瘤细胞系诱导凋亡及生长抑制的研究

目的 研究抗微管药紫杉醇在体外实验条件下对尤氏肉瘤细胞系RD—ES的诱导凋亡及生长抑制作用。方法 不同浓度的紫杉醇作用于体外培养的RD—ES细胞，通过形态学观察，台盼兰染色，Giemsa染色，流式细胞仪分析技术，原位末端标记分析凋亡细胞DNA降解产物等方法，观察紫杉醇诱导RD—ES凋亡的作用。结果 通过与其他化疗药物比较，及随时间剂量改变的情况，可见紫杉醇对RD—ES细胞的诱导凋亡作用呈时间，剂量依赖关系，细胞分裂受阻，凋亡峰明显，多核瘤细胞增多，胞浆中空泡明显。原位末端标记可见DNA降解后的阳性反应。结论 体外诱导实验证实紫杉醇对RD—Es细胞系的有丝分裂有明显的抑制作用及诱导凋亡作用且随时间，剂量增加而增大。     

三氧化二砷诱导的结肠癌细胞凋亡及其与细胞周期的关系

目的：探讨三氧化二砷（Ａｓ２Ｏ３）对结肠癌细胞的凋亡诱导作用及其与细胞周期的关系。方法：采用透射电镜、丫啶橙荧光染色,ＴｄＴ及流式细胞仪检测药物作用前后细胞在形态学及细胞周期２等方面的变化。结果：形态学观察发现Ａｓ２Ｏ３诱导的ＬｏＶｏ细胞死亡呈现凋亡特征,研究表明随经物作用时间延长,凋亡细胞比例逐渐增加。Ａｓ２Ｏ３在低浓度时主要干扰细胞在Ｓ期的通过,高浓度时则选择性诱导Ｓ期细胞凋亡。结论：Ａｓ２ｏ     

Sequential half-body irradiation as systemic treatment of progressive ewing sarcoma

Sequential half-body irradiation (HBI) to be delivered in two sessions was used in 18 consecutive patients with metastatic Ewing sarcoma who relapsed after radiotherapy and multidrug chemotherapy. The HBI program to both upper and lower hemi body was completed in 11 patients (61 %). The remaining 7 patients received only one single treatment of HBI because of relapse before the completion of the treatment program. In 20 of the 29 sessions HBI was employed to treat overt metastases. The overall objective response rate was 50 %. Six of 18 patients (33 % ) are alive from 4 to 27 months, 3 of them without evidence of disease. No severe toxicity was observed. HBI as systemic treatment was more effective in patients who relapsed while off chemotherapy, with metastases confined to the lungs or to one single bone segment.     

Analysis of prognostic factors in ewing sarcoma family of tumors: review of St. Jude Children's Research Hospital studies

BACKGROUND: Advances in systemic and local therapies have improved outcomes for patients with the Ewing sarcoma family of tumors (ESFT). As new treatments are developed, a critical review of data from past treatment eras is needed to identify clinically relevant risk groups. METHODS: The authors reviewed the records of 220 patients with ESFT who were treated on protocols at St. Jude Children's Research Hospital from 1979 to 2004. Two treatment eras were defined. Factors predictive of outcome were analyzed to identify distinct risk groups. RESULTS: The median age at diagnosis was 13.7 years (range, 1.1-25.2 years). Metastatic disease was associated with tumors measuring >8 cm (P = .002) and axial location (P = .014). The 5-year overall survival (OS) estimate (63.5% +/- 3.5%) did not appear to differ by protocol. Tumor stage and size were found to be the only independent predictors of outcome. Treatment era and type of local control therapy were found to influence the outcome of patients with localized disease. Four risk groups were defined: favorable risk (age <14 years with localized, nonpelvic tumors), intermediate risk (localized, age >/=14 years, or pelvic tumors), unfavorable-pulmonary (isolated lung metastases), and unfavorable-extrapulmonary (extrapulmonary metastases). The 5-year OS estimates for these groups were 88.1% +/- 4.4%, 64.9% +/- 5.2%, 53.8% +/- 9.4%, and 27.2% +/- 7.3%, respectively (P < .001). The incidence of therapy-related leukemia was significantly higher during the second treatment era, when more intensified regimens were used (6.1% +/- 2.7% vs 0% +/- 0%; P = .005). CONCLUSIONS: Risk stratification schemes such as this should be used to prospectively evaluate novel risk-based therapies. Studies of biologic pathways may help to refine this model.     

RETRA exerts anticancer activity in Ewing’s sarcoma cells independent of their TP53 status

Mutant p53 can exert oncogenic activity by inhibitory interaction with p73. The small-molecule RETRA has been described to disrupt this interaction and to suppress carcinoma cells (Kravchenko et al., 2008). RETRA’s anticancer activity was restricted to tumour cells bearing mutant p53; it was not active in p53 negative and in p53 wild-type cells. Here, we explored the responsiveness of Ewing’s sarcoma (ES) cells with mutant p53 to RETRA. For comparison, we also tested RETRA in p53 null and in p53 wild-type ES cells. We found RETRA to be effective in the three mutant p53 ES cell lines investigated. Strikingly, however, RETRA was similarly effective in the p53-deficient and in the two p53 wild-type ES cell lines examined. RETRA elicited apoptosis, as assessed by flow cytometric analyses of mitochondrial depolarisation and DNA fragmentation, caspase 3/7 activity assay and PARP-1 cleavage immunodetection, and G2/M cell cycle arrest completely independent of the cellular TP53 status. In contrast, various p53-deficient and -proficient carcinoma, osteosarcoma and leukaemia cells were unresponsive to RETRA. RETRA also induced gene expression of p53 target genes PUMA and p21 in ES cells irrespective of their TP53 status. These in vitro findings provide a rationale for an in vivo exploration of RETRA’s potential as an effective therapeutic approach for patients with ES.     

Extraskeletal Ewing's sarcoma: first case report in Greece

The first case of soft tissue Ewing's sarcoma in Greece is presented. The tumour was a circumscribed large mass at the right calf, was radically excised and histologically proved to be small cell malignant neoplasm, performing the characteristic structural and cytological pattern of Ewing's sarcoma. Systematic clinical and radiological examination was negative. Operation was followed by local radiotherapy and systematic chemotherapy and the patient remains disease-free and clinically in perfect health eight months after the operation. The case is presented with special reference to its histological appearance and its treatment.     

BTG1对喉癌细胞增殖和凋亡的影响及其机制研究

背景与目的：在多种细胞中B细胞易位基因1(B-cell translocation gene 1,BTG1)能够抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,调节细胞周期进程及分化。该研究通过体外实验探讨BTG1高表达对喉癌Hep-2细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响及其相关作用机制。方法：构建pEGFP-N1-BTG1,培养并转染喉癌Hep-2细胞,分为实验组(转染pEGFP-N1-BTG1的Hep-2细胞)和对照组(转染pEGFP-N1空质粒的Hep-2细胞)。采用蛋白［质］印迹法(Western blot)检测两组细胞中BTG1蛋白的表达水平;应用MTT法检测细胞的增值活性;使用流式细胞术检测细胞周期分布和磷脂酰丝氨酸外翻分析(Annexin Ⅴ-FITC/PI)检测细胞凋亡;采用Western blot法检测细胞周期调控蛋白Cyclin D1、凋亡相关蛋白Bcl-2表达情况。结果：成功构建pEGFP-N1-BTG1,Western blot检测结果显示,实验组细胞中BTG1蛋白表达水平明显高于对照组细胞(0.921±0.091 vs 0.308±0.047,P<0.05)。实验组与对照组细胞相比,从第24 h实验组细胞生长速度减慢,细胞增值能力降低,两组比较差异有统计学意义(P<0.05);实验组细胞中Cyclin D1蛋白表达水平下降(0.436±0.023 vs 0.916±0.092,P<0.05),细胞周期的G₀/G₁期细胞比例升高［(85.1±5.2)% vs (63.8±3.1)%,P<0.05)］;S期细胞比例降低［(8.3±1.1)% vs(23.1±1.5)%,P<0.05］;实验组细胞Annexin Ⅴ增多,细胞早期凋亡率升高［(10.3±1.1)% vs (2.8±0.3)%,P<0.05］,抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平降低(0.167±0.009 vs 0.834±0.084,P<0.05)。结论：BTG1高表达能明显抑制喉癌Hep-2细胞的生长增殖、诱导凋亡,其可能的机制与BTG1参与细胞周期调控、诱导细胞凋亡相关。     

塞来昔布抑制肝癌细胞株增殖及其机制的实验研究

目的:研究特异性环氧化酶-2(COX-2)抑制剂塞来昔布对人肝癌细胞株SMMC-7721是否有抑制增殖、诱导凋亡作用并初步探讨其作用机制。方法:采用四氮唑盐比色法(MTT法)观察不同浓度的塞来昔布作用后细胞增殖活力改变;流式细胞仪检测细胞凋亡百分率及细胞周期变化;免疫组化观察Bcl-2蛋白和Bax蛋白表达情况。结果:MTT法显示随着塞来昔布浓度和作用时间增加,细胞增殖抑制率上升;流式细胞仪测定空白对照组未见明显凋亡峰,塞来昔布组出现凋亡峰,凋亡率随着时间及药物浓度变化而变化,二者呈正相关;免疫组化显示经塞来昔布干预后,凋亡蛋白Bax表达增加,而Bcl-2表达减少,并随时间和药物浓度变化而明显。结论:塞来昔布抑制SMMC-7721细胞增殖,促进SMMC-7721细胞凋亡,并呈剂量和时间依赖性。其作用机制之一可能是通过减少Bcl-2的表达,增加Bax的表达,从而启动细胞凋亡途径。     

lncRNA ANCR对直肠癌细胞增殖和凋亡能力的影响及机制

目的 探讨长链非编码RNA（lncRNA）抗分化非编码RNA（ANCR）对结直肠癌（CRC）细胞生物学行为的影响及其作用机制。方法 收集50例CRC患者的癌组织和癌旁组织,通过RT-qPCR检测组织中ANCR和叉头框蛋白O1（FOXO1）的表达水平并进行Pearson相关性分析。利用RNA 拉下和RNA免疫沉淀实验（RIP）确认ANCR是否可与FOXO1相互作用。将经过慢病毒包装的ANCR和FOXO1慢病毒质粒转染至人CRC细胞系SW480细胞中,细胞分为6组：对照组（未转染）,NC组（转染慢病毒质粒空载）,ANCR组（转染 pHRi-ANCR）,sh-ANCR组（转染pHRi-sh-ANCR）,FOXO1组（pHRi-FOXO1）,sh-ANCR + sh-FOXO1组（同时转染pHRi-sh-ANCR和pHRi-sh-FOXO1）。RT-qPCR检测过表达和抑制ANCR后FOXO1的表达水平,5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷（EdU）标记技术和流式细胞术分别检测各组细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡情况。Western blot检测B淋巴细胞瘤-2（BCL-2）、BCL2相关蛋白X（BAX）、细胞周期蛋白D1（cyclin D1）及人P27蛋白（P27）的表达情况。结果 与癌旁组织相比,CRC组织中ANCR表达明显增加,FOXO1表达明显减少（P<0.01）,二者表达水平负相关（P<0.01）。ANCR能够结合并抑制FOXO1表达。与NC组相比,sh-ANCR组和FOXO1组细胞增殖数减少,细胞阻滞于G0/G1期,细胞凋亡数增多,BAX和P27增多,BCL-2和cyclin D1减少（P<0.05）。与sh-ANCR组相比,sh-ANCR + sh-FOXO1组上述指标得到逆转（P<0.05）。结论 lncRNA ANCR在CRC中表达升高并通过调控FOXO1的表达调控CRC细胞的细胞增殖和凋亡。     

~(131)I-GMCSF诱导HL-60细胞凋亡与细胞周期阻滞的研究

目的　观察和探讨1 31 I-GMCSF诱导HL - 6 0细胞凋亡及其与细胞周期的关系。方法　采用体外放射免疫治疗模型,通过MTT比色法、TUNEL来研究1 31 I -GMCSF辐射后HL - 6 0细胞的存活率、凋亡率的改变;用流式细胞术及免疫细胞化学方法细胞周期的改变。结果　放射性浓度≥18.5×10 8Bq/L时HL - 6 0细胞存活率显著下降。1 31 I -GMCSF能致HL - 6 0细胞凋亡、细胞发生G2 /M期阻滞。结论　GMCSF作为载体携带1 31 I能诱导HL - 6 0细胞凋亡,凋亡与细胞发生G2 /M期阻滞有关。