双靶向调控CDX2基因慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的 构建5个拷贝的HRE和hTERTp双靶向调控表达CDX2基因的慢病毒表达载体,并在结肠癌LoVo细胞中检测其启动活性。方法 设计引物应用PCR法从人结肠癌基因组中克隆获得hTERT启动子,用双酶切和PCR法切除笔者所在课题组已构建的载体pLEGFP-5HRE-CEAp中的CEA启动子后,将hTERT启动子与该载体重组,构建出pLEGFP-5HRE-hTERTp;提取5HRE-hTERTp基因序列,同时双酶切切除pLVX-EGFP-3FLAG载体中的CMV启动子,同源重组构建获得pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG载体。设计引物应用PCR法从笔者所在课题组已构建的GV230-CDX2-EGFP载体中克隆获得CDX2基因序列,用双酶切和PCR法切除载体pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG中的EGFP后,将CDX2基因序列与该载体重组,构建出pLVX-5HRE-hTERTp-CDX2-3FLAG。应用pLVX-5HRE-hTERTp- EGFP-3FLAG载体瞬时转染体外培养的人结肠癌LoVo细胞,通过观察绿色荧光蛋白EGFP的表达,鉴定hTERTp的启动活性。结果 经PCR和测序分析,pLEGFP-5HRE-hTERTp、pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG和pLVX-5HRE-hTERTp-CDX2-3FLAG 3组质粒与设计一致,测序正确。将pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG载体瞬时转染体外培养的人结肠癌LoVo细胞,有绿色荧光表达,提示hTERT启动子能够有效启动下游基因的表达。结论 成功构建了pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG及pLVX-5HRE-hTERTp-CDX2-3FLAG载体,为后续的体外和体内研究打下了基础。     

端粒酶逆转录酶基因启动子调控FADD表达载体诱导人结肠细胞凋亡的研究

目的 构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因启动子调控Fas相关死亡结构域蛋白(FADD)肿瘤细胞特异性表达载体,观察其对人结肠癌细胞凋亡的作用.方法 利用hTERT基因核心启动子和FADD基因片段,构建hTERT基因启动子调控FADD 的肿瘤细胞特异性表达载体.用脂质体转染法,将其分别转染人结肠癌细胞和正常细胞,观察人结肠癌细胞和正常细胞的端粒酶活性、细胞周期及凋亡.结果 hTERT基因核心启动子调控FADD 表达载体,在所检测的肿瘤细胞中具有明显的转录活性;而在正常细胞中则无明显的转录活性.Colon320细胞、LoVo细胞、SW480细胞与WI-38细胞凋亡率在不同转染时间比较,差异有统计学意义(P均<0.01).WI-38转染pLNCX-hTERT-FADD与pLNCX-hTERT-GFP在24、48、72、96、120h凋亡率比较,差异均无统计学意义(P均>0.05).结论 hTRET基因核心启动子具有肿瘤特异性,构建hTERT基因核心启动子调控FADD 表达载体可能是一种新的肿瘤治疗途径.     

热诱导对8HSE修饰的hTERT启动子转录活性的增强作用

目的:探讨热诱导对8倍重复串联热休克元件(8HSE)修饰的人端粒酶逆转录酶启动子(h TERTp)转录活性及靶向性的影响。方法:用PCR法从人结肠癌基因组中克隆h TERTp;将单纯的h TERTp或8HSE修饰的h TERTp重组于双荧光素酶报告载体p GL4.2后,分别与内参质粒p GL4.74(含TK启动子)共转染h TERT高表达的SW480细胞株和h TERT低表达的MKN28细胞株,双荧光素酶法检测h TERTp在37℃及43℃下的转录活性。结果:PCR、酶切和DNA测序表明h TERTp克隆、8HSE合成及载体构建成功。37℃下,单纯h TERTp在SW480细胞中的转录活性明显高于MKN28细胞(P0.05),8HSE对h TERTp转录活性无增强作用,且在SW480细胞中8HSE对h TERT转录活性具有抑制作用;43℃下,单纯h TERTp的转录活性在两种细胞中无明显改变(P0.05),但与单纯h TERTp比较,8HSE修饰的h TERTp转录活性在SW480细胞中明显增强(P0.05),而在MKN28细胞中无明显改变(P0.05)。结论:热诱导对h TERTp转录活性无明显影响,但对8HSE修饰的h TERTp转录活性有明显的增强作用,且该调控元件靶向于h TERT高表达的肿瘤细胞。     

BMI-1和MMP-9在结肠癌细胞中的表达及意义

目的探讨BMI-1mRNA和MMP-9mRNA在结肠癌细胞中的表达及其意义。方法采用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测结肠癌细胞和人正常结肠平滑肌细胞中BMI-1mRNA和MMP-9mRNA的表达,分析二者的关系。结果在结肠癌SW620和LoVo细胞株中,BMI-1mRNA的表达量明显高于结肠癌细胞株SW480细胞和人正常结肠平滑肌细胞(P0.05);SW620和LoVo结肠癌细胞中MMP-9mRNA的表达亦明显高于SW480细胞和人正常结肠平滑肌细胞(P0.05)。在结肠癌细胞中BMI-1mRNA的表达与MMP-9mRNA的表达呈正相关(r=0.966,P0.05)。结论作为原癌基因,BMI-1可用作反映结肠癌细胞侵袭力的生物学指标。     

脆性组氨酸三联体基因对结肠癌细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨脆性组氨酸三联体基因（FHIT）转染对结肠癌细胞株SW480增殖和凋亡的影响及其作用机制.方法 将重组真核表达质粒pRc/CMV2-FHIT通过脂质体转染技术导入人结肠癌细胞株SW480（实验组）,筛选稳定转染的细胞并扩增培养,以转染了空质粒pRc/CMV2的SW480细胞作为阴性对照,以正常SW480细胞作为空白对照.应用MTT法检测细胞的增殖活性,流式细胞仪检测细胞周期分布和细胞凋亡率,Western blot分析caspase-8酶原的变化,半定量RT-PCR检测caspase-8 mRNA水平的改变,肽核酸标记底物的比色法检测caspase-8的相对活性.结果 转染96 h后,实验组和阴性对照组细胞生长抑制率分别为71.7%和16.9%,G0/G1细胞比例分别为（63.3±3.5）%和（50.6±2.1）%,细胞凋亡率分别为（40.5±3.1）%和（18.6±2.6）%,caspase-8 mRNA条带光密度积分值分别为107和41,caspase-8蛋白相对活性分别为0.43和0.25;上述差异均有统计学意义（P＜0.05）.当加入FHIT抑制剂后,caspase-8蛋白相对活性恢复至对照组水平（0.22）.结论 FHIT基因转染能够明显抑制人结肠癌细胞株SW480的增殖,诱导SW480细胞发生G0/G1期阻滞,其作用机制可能与caspase-8表达及活性上调有关.     

生长激素受体靶向siRNA联合5-FU对人结肠癌肝转移的影响

目的：探讨小分子干扰RNA（siRNA）靶向抑制人生长激素受体（hGHR）联合5-FU对人结肠癌细胞肝转移的影响。
方法：建立人结肠癌细胞SW480 BALB/c小鼠肝转移模型,并针对hGHR基因靶点构建siRNA干扰质粒,将荷瘤小鼠随机分成6个不同处理组,分别为生理盐水组、质粒组、生长激素（GH）组、5-氟尿嘧啶（5-FU）组、5-FU+质粒组、5-FU+质粒+GH组,观察各组肿瘤的肝转移情况。
结果：各组小鼠均有肝转移瘤形成,质粒组肝转移瘤数较生理盐水及GH组明显减少（2.67±1.37 vs. 10.17±1.94,10.50±1.38）（P＜0.05）;干扰质粒与5-FU联用后肝转移瘤数略低于两者单独使用（2.33±1.03 vs. 3.17±0.98,2.67±1.37）,但差异无统计学意义（P＞0.05）;在5-FU+质粒的基础上加用GH并不增加肝转移瘤的发生（P＞0.05）,但能改善小鼠由GHR抑制和化疗药物的毒性引起的体质量降低（P＜0.05）。
结论：siRNA靶向抑制hGHR可降低小鼠中人结肠癌细胞SW480肝转移的发生,GHR在肿瘤转移中可能起了重要作用。

     

癌胚抗原启动子正调控白细胞介素-15表达质粒载体的构建及其在肿瘤细胞中的靶向表达

目的 构建癌胚抗原(CEA)启动子正调控人白细胞介素-15(IL-15)真核表达质粒载体,观察其在肿瘤细胞内的靶向性表达.方法 基因克隆技术构建巨细胞病毒(CMV)启动子正调控质粒pHi2-IL-15-CMV-TAT和CEA启动子正调控质粒pHi2-IL-15-CEA-TAT;再以IL-2信号肽(SP)置换IL-15SP构建质粒pHi2-IL-2SP-IL-15-CMV-TAT和pHi2-IL-2SP-IL-15-CEA-TAT;阳离子脂质体介导法体外转染CEA阳性结肠癌SW480细胞和CEA阴性乳腺癌MCF-7细胞,酶联免疫吸附方法(ELISA)检测转染后48h细胞培养上清液中IL-15表达.结果 质粒均成功构建.ELISA检测结果:(1)以IL-2SP置换IL-15SP可提高转染细胞的IL-15表达4.8～5.9倍(P＜0.01);(2)转染SW480细胞后,CEA启动子正调控的两质粒(pHi2-IL-15-CEA-TAT和pHi2-IL-2SP-IL-15-CEA-TAT)与相对应的CMV启动子正调控质粒(pHi2-IL-15-CMV-TAT和pHi2-IL-2SP-IL-15-CMV-TAT)之间的IL-15表达无统计学意义(P＞0.05),其效应等同于CMV启动子正调控质粒;(3)转染MCF-7细胞后,CEA启动子正调控的两质粒IL-15表达显著低于CMV启动子正调控质粒(P＜0.01).结论 CEA启动子正调控IL-15质粒,尤其是质粒pHi2-IL-2SP-IL-15-CEA-TAT在CEA阳性细胞中高表达IL-15,CEA阴性细胞中低表达IL-15,实现了IL-15基因高效、靶向性表达.     

自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤对结直肠腺癌细胞生长与Notch1蛋白表的影响

目的：探讨自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）对人大肠癌SW480细胞生长与Notch1蛋白表达的影响。方法：将3-MA（5 mmol/L）作用于SW480细胞24 h后（以培养相同时间无处理的SW480细胞为对照）,分别免疫组化和Western blot法检测细胞Notch1蛋白的表达,用CCK-8法和Annexin/PI双染法检测细胞增殖与凋亡。结果：免疫组化与Western blot结果均显示,3-MA作用后,SW480细胞Notch1蛋白的表达明显下调（均P<0.05）;增殖与凋亡检测结果显示,3-MA作用后,SW480细胞增殖率明显降低,而凋亡率明显增加（均P<0.05）。结论： 3-MA能抑制结直肠癌细胞的增殖并促进其凋亡,该作用可能与3-MA抑制Notch1蛋白表达从而改变细胞自噬水平有关。

     

脆性组氨酸三联体基因转染对人结肠癌细胞株SW480奥沙利铂敏感性的影响

目的 观察脆性组氨酸三联体基因(FHIT)转染对人结肠癌细胞株SW480奥沙利铂敏感性的影响.方法 将重组真核表达质粒pRc/CMV2-FHIT通过脂质体转染技术导入人结肠癌细胞株SW480,筛选稳定转染的细胞并扩增培养,以转染了空质粒pRc/CMV2的SW480细胞(SW480-pRc/CMV2)和正常SW480细胞为对照.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测FHIT基因的mRNA转录水平.以奥沙利铂作用于3组细胞,用噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞的生长抑制率,用流式细胞仪检测奥沙利铂处理前后各组结肠癌细胞的凋亡率及细胞周期的变化.结果 SW480-FHIT细胞的RT-PCR产物经凝胶电泳有明显的阳性条带,而对照组则无;经奥沙利铂处理后,转染FHIT基因的SW480细胞的凋亡水平与空质粒转染组及结肠癌细胞株组比较明显增高(第2、3、4天A值比较P<0.05),并且FHIT基因与奥沙利铂有轻度的协同促进凋亡作用;同时奥沙利铂处理前后实验组结肠癌细胞的生长周期较对照组均出现了明显的G_0/G_1期阻滞,且细胞的生长抑制率存在浓度和时间依赖性.结论 外源性FHIT基因表达与奥沙利铂协同促进SW480细胞凋亡及细胞周期阻滞,FHIT基因可增加结肠癌细胞对奥沙利铂的敏感性.     

端粒酶逆转录酶启动子联合CD自杀基因靶向杀伤人肝癌细胞研究

目的 利用肿瘤特异性人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子介导自杀基因CD表达,检测其促进5-FC对肝癌细胞系的杀伤作用.方法 采用聚合酶链反应(PCR)技术获得hTERT基因的启动子片段,将其连至SV40增强子序列后,并克隆到表达荧光素酶基因的报告质粒上,检测hTERT基因启动子在肝癌细胞系Bel-7402和人成纤维细胞HDF中的转录活性,同时将CD自杀基因连至该调控序列后,转染肝癌细胞Bel-7402,通过逆转录(RT)-PCR、噻唑蓝(MTT)比色法检测其作为肝癌基因治疗中肿瘤特异性靶向杀伤载体的可行性.结果 成功构建pGL3-SV40-hTERT载体和SV40-hTERT-CD-GFP质粒载体,转染ST-CD载体后Bel-7402细胞表达CD基因,转染PGL3-SV40-hTERT质粒后Bel-7402细胞中hTERT启动子高表达,相对活性为354%.与未转染组比较,5-Fc对转染SV40-hTERT-CD-GFP质粒载体的肝癌细胞Bel-7402的杀伤效应明显增强(F=27.831,P<0.01).结论 hTERT启动子在肝癌细胞系中具有较强的转录活性,能有效地诱导CD自杀基因的表达.     

体外转染KISS-1基因对SW480细胞系侵袭和迁移力的影响

目的 探讨人肿瘤转移抑制基因KiSS-1对人结肠癌SW480细胞增殖、侵袭、迁移能力的影响.方法 将携有KISS-1基因的重组真核表达质粒pRc/CMV2-KISS-1转化大肠杆菌DH5et并扩增,抽提纯化质粒并进行酶切鉴定,pRc/CMV2-KISS-1体外转染SW480细胞(SW480-FH1T),筛选稳定转染的细...     

靶向抑制皮层肌动蛋白装配对大肠癌细胞侵袭作用的影响

目的 构建能够靶向抑制细胞皮层蛋白装配的重组质粒,观察其对于肿瘤细胞侵袭作用的影响.方法 构建重组质粒EGFP/N2/Repeat,将其和空载体质粒转染入人大肠癌细胞Lo-Vo和HCT-8,分别扩增培养,绘制生长曲线,通过boyden小室模型观察大肠癌细胞侵袭性的改变.结果 实验获得与预期一致的DNA特异性片段,经双酶切和测序证实目的 片段正确的与载体质粒连接,重组质粒经过双酶切证实构建成功.显微镜下观察重组质粒成功转染人大肠癌细胞,细胞生长曲线提示转染与未转染该基因的细胞生长曲线相同;行细胞侵袭力实验,含有EGFP/N2/Repeat的癌细胞、空质粒转染细胞和对照组细胞(未转染)穿膜数分别为LoVo组:35.27±6.70、85.47±5.50、87.47±6.39;HCT-8组:15.07±2.34、26.73±4.43、26.07±3.67,含有拮抗分子的细胞穿膜数较其余两组明显减少,差异有统计学意义(P<0.01).结论 通过抑制皮层肌动蛋白装配可抑制大肠癌细胞的侵袭性.     

microRNA-34a增加奥沙利铂对结肠癌细胞敏感性的实验研究

目的:构建奥沙利铂耐药结肠癌细胞株(SW480/ADR),观察miRNA-34a对SW480/ADR细胞奥沙利铂敏感性的影响。方法:使用浓度梯度法构建奥沙利铂耐药细胞株(SW480/ADR)。miR-34a慢病毒转染SW480/ADR细胞,MTT法检测细胞增殖,Real-time PCR定量检测miR-34a表达,Western blot检测蛋白表达。结果:SW480、SW480/ADR和过表达miR-34a-SW480/ADR细胞miR-34a的2-△△Ct值为0.15±0.03、0.12±0.02和0.74±0.13,各组间差异有统计学意义(P<0.01)。奥沙利铂对SW480、SW480/ADR和过表达miR-34a-SW480/ADR细胞的IC50值分别为8.64±1.54、24.16±3.72和11.52±1.22μmol/L,各组间差异有统计学意义(P<0.01)。SW480、SW480/ADR和过表达miR-34a-SW480/ADR细胞OCT-4蛋白的相对灰度值为0.096±0.014、0.352±0.053和0.136±0.017,各组间差异有统计学意义(P<0.01)。结论:miR-34a可以显著降低结肠癌奥沙利铂耐药细胞OCT-4蛋白表达,逆转结肠癌细胞对奥沙利铂的耐药。     

人FHIT基因的克隆及其真核表达质粒的构建

目的克隆人脆性组氨酸三联体（FHIT）基因,构建其真核表达质粒pRcCMV-FHIT。方法提取人外周血总RNA,用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）技术扩增人FHITcDNA全长开放阅读框序列,PCR产物与中间载体pGEM-T连接后转化到大肠杆菌DH5α。然后对单菌落进行菌落PCR、限制性内切酶酶切鉴定和测序。用EcoRI将目的片段切下,插入真核表达载体pRc／CMV2的相应位点,构建表达质粒pRc／CMV2-FHIT,将该重组质粒转化到大肠杆菌DH5α后进行菌落PCR、酶切鉴定。结果测序结果表明从正常人外周血单个核细胞中所获得的FHITcDNA含有781个碱基,与Genbank（NM_002012．1）序列完全一致。pRc／CMV2-FHIT经酶切鉴定与预期结果一致。结论成功构建重组真核表达质粒pRcCMV-FHIT,为进一步研究脂质体转染FHIT基因对结肠癌细胞株SW480凋亡作用的影响奠定基础。