胶原-壳聚糖支架与软骨细胞的生长

背景：目前软骨支架材料的种类比较多,但还没有一种材料能完全符合软骨修复的要求。目的：观察在混合材料胶原-壳聚糖支架中软骨细胞的生长情况。方法：采用冷冻干燥法将质量分数为2%胶原与3%壳聚糖混合制备胶原-壳聚糖多孔支架。将分离培养的第2代兔软骨细胞接种到胶原-壳聚糖支架上,对照组将软骨细胞接种到无支架的培养板中。观察支架的孔隙率、吸水性及内部形态结构,MTT法检测软骨细胞在支架上的增殖情况,组织切片苏木精-伊红染色,扫描电镜观察细胞在支架的生长、贴附情况,RT-PCR检测细胞支架复合物蛋白聚糖和Ⅱ型胶原mRNA表达情况。结果与结论：胶原-壳聚糖支架的吸水性为（80.0±0.55）%,孔隙率为（88.5±1.5）%,孔径为100～150μm,复合细胞培养2周后,细胞增殖活力高,软骨细胞分泌的蛋白聚糖和Ⅱ型胶原mRNA表达明显高于对照组。说明质量分数为2%胶原与3%壳聚糖的混合支架适合软骨细胞生长和快速增殖,是一种良好的修复和重建软骨载体。     

胶原-壳聚糖复合支架用作组织工程心瓣膜的可行性

目的:构建组织工程心脏瓣膜的先决条件之一是构建最佳解剖结构和性能的支架材料,拟证明胶原-壳聚糖复合支架可以作为组织工程心脏瓣膜的最佳支架材料。方法:实验于2004-03/2005-02在中国科学院昆明动物研究所完成。将胶原与壳聚糖分别按7∶1,5∶1,3∶1质量比混合,冷冻干燥法成膜,碾压平整后制成胶原-壳聚糖复合多孔支架。将复合支架制成直径1.0cm的圆片,依次经过固定、冲洗、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、展片与烘片行一般物理性状观察、苏木精-伊红染色和Masson染色观察内部结构;再将另一圆片依次经过固定、洗涤、脱水、置换、浸透、包埋后聚合、临界点干燥、喷镀、安置处理后制成超薄切片进行电镜扫描,观察其超微结构特性。结果:胶原-壳聚糖复合支架外观呈微黄色,半透明状,可见微孔状结构,柔韧适度,富有弹性,抗张强度约为4.0MPa,孔径大小基本一致,保持在80～260μm,孔隙率在95%以上,且孔与孔相互贯通,呈立体网状结构。结论:胶原-壳聚糖复合支架的结构和物理性状符合组织工程心瓣膜材料的要求。     

软骨细胞复合胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状梯度修复体的体外培养

背景：关节软骨缺损的修复涉及到软骨和软骨下骨的双重修复,需要将骨与软骨组织工程结合起来,构建骨软骨双层支架,或者在同一支架上构建组织工程化骨软骨。目的：观察胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状梯度修复体对软骨细胞的吸附作用及对细胞生物学性状的影响,评价其作为关节软骨工程支架的可行性。时间及地点：体外细胞学实验,于2007-12/2008-06在广东省构建与检测实验室进行。材料：以胶原、壳聚糖、β-磷酸三钙制备复合支架,上层以胶原/壳聚糖为主,下层以胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙为主,孔隙率≥90%,孔径100μm。方法：体外培养新西兰大白兔软骨细胞并成骨诱导3周,使之吸附于多孔胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状梯度修复体上三维立体培养3周。主要观察指标：通过生长曲线、倒置相差显微镜、组织学、扫描电镜及免疫组织化学检测支架在三维立体培养对软骨细胞的表型、增殖及功能的影响。结果：修复体/细胞体外培养3周,修复体上细胞数量明显增多,并分泌细胞基质,包裹在软骨细胞周围,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性。结论：胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状梯度修复体的细胞相容性良好,有望成为一种比较理想的关节软骨组织工程支架材料。     

聚乳酸/壳聚糖纳米纤维/纳米羟基磷灰石支架与兔软骨细胞的相容性

背景：传统的支架材料存在疏水性强,材料表面缺乏细胞表面受体特异结合的生物活性分子,材料的酸性降解产物易引发无菌性炎性反应等不足。根据仿生原理及软骨真实结构和构成来选择和制备组织工程软骨支架能够获得理想效果。目的：制备聚乳酸/壳聚糖纳米纤维/纳米羟基磷灰石支架,评价其与兔膝关节软骨细胞的生物相容性,探讨其应用于关节软骨组织工程的可行性。方法：采用二次相分离技术制备聚乳酸/壳聚糖纳米纤维/纳米羟基磷灰石复合支架,将第3代新西兰兔软骨细胞接种至复合支架材料上复合培养,倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。细胞-支架复合物在24孔板中培养5d以后,将其植入裸鼠皮下8周。结果与结论：聚乳酸/壳聚糖纳米纤维/纳米羟基磷灰石支架材料经化学合成后,具有合适的三维多孔结构,孔隙率为90%孔径300-450μm;植入裸鼠皮下8周后Ⅱ型胶原免疫组织化学染色和甲苯胺蓝染色显示细胞-支架复合物中的软骨细胞可以像天然软骨一样分泌黏多糖和Ⅱ型胶原。提示生物材料聚乳酸/壳聚糖纳米纤维/纳米羟基磷灰石对于兔软骨细胞有良好的生物相容性,可作为生物组织工程支架。     

胶原/生物活性玻璃/壳聚糖增强型复合支架

背景：生物活性玻璃/胶原复合材料具有优良的成骨活性和的生物学性能,然而其在人体环境中易降解而导致支架溃散、力学性能下降。 目的：构建具有良好力学性能、抗降解性能和骨修复特性的胶原/生物活性玻璃/壳聚糖增强型复合支架。 方法：以壳聚糖作为分散剂,将生物活性玻璃粉体预先在壳聚糖溶液中均匀分散,然后与胶原溶液混合,结合冷冻干燥法制备多孔胶原/生物活性玻璃/壳聚糖增强型复合骨修复支架。采用傅里叶变换红外光谱仪、场发射扫描电子显微镜、X射线衍射仪、动态生物力学试验机等对复合支架的结构和性能进行表征。 结果与结论：由于壳聚糖和生物活性玻璃粉体在微酸性环境下的电荷吸引,使在壳聚糖中预分散的生物活性玻璃颗粒在复合支架中分散更均匀;壳聚糖的引入大量增加了机体中的羟基和氨基,使分子间的相互作用增强,显著提高了材料的抗压模量和强度;壳聚糖和胶原在分子尺度的混合,使胶原分子被壳聚糖包裹,降低了胶原酶对胶原分子的酶切能力,显著提高了复合支架的抗胶原酶解性;壳聚糖分子使生物活性玻璃颗粒更均匀的包裹在大分子基相中,减少了生物活性玻璃颗粒的团聚和暴露,导致复合支架在模拟体液中的矿化活性略微降低。     

兔骨髓间充质干细胞/壳聚糖-胶原支架复合体构建软骨组织工程支架

背景:软骨组织工程的核心是利用少量的细胞经体外培养、扩增后,在一定环境下附着在三维多孔支架上,再将细胞/支架复合体移植到体内形成新的组织.目的:拟构建兔骨髓间充质干细胞/壳聚糖-胶原支架复合体,探讨该支架作为软骨组织工程支架的可行性.设计、时间及地点:细胞-支架学体外观察,于2008-03/2009-02在武警医学院生物化学教研室完成.材料:日本大耳白兔6只用于分离培养骨髓间充质干细胞.医用壳聚糖粉末为山东奥康生物科技有限公司产品.Ⅰ型胶原为Sigma公司产品.方法:取3%的壳聚糖和2%的胶原混合的醋酸溶液,倒入72孔板内,-20℃预冷冻10 h,冻干机冷冻抽干24 h制作成壳聚糖-胶原支架.取第3代兔骨髓间充质干细胞,以1×109L-1密度接种于支架内,构建细胞/支架复合体.主要观察指标:傅里叶红外光谱、扫描电镜、液体置换法测定支架的理化性质,观察三维培养后细胞在支架上的生长情况.结果:壳聚糖-胶原支架孔径为160～380 μm,平均为270 μm,孔相通性好,支架孔隙率为(86.00±5.12)%.傅里叶红外光谱仪测定数据表明复合支架组成物有典型的壳聚糖、胶原峰,未发现有聚乙二醇峰.细胞/支架共培养24,48,72 h后,骨髓间充质干细胞可渗入支架多孔结构内,并黏附在支架上成簇生长,部分细胞已与支架融合.结论:壳聚糖-胶原支架基本符合软骨组织工程支架要求,能够作为种子细胞的承载体.     

体外培养脂肪组织来源干细胞与胶原/壳聚糖复合支架的亲和性

目的：制备适合脂肪组织来源的干细胞生长的支架,观察复合支架各组成的体积比率与细胞培养的亲和性. 方法：实验于2006-09/2007-01在大连理工大学干细胞与组织工程研发中心完成.①实验方法：将3.55 g/L Ⅰ型胶原和20 g/L壳聚糖分别以9∶1,7∶3,5∶5,3∶7,1∶9的体积比混合冻干,碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺交联后再次冻干并进行分析.②实验评估：扫描电镜观察不同材料交联前后的微观结构;IPP软件分析计算支架的平均孔径;测量支架的吸水性和孔隙率;通过胶原酶检测支架的体外生物可降解性;扫描电镜和苏木精-伊红染色观察脂肪组织来源的干细胞在复合支架上的生长情况. 结果：①交联前后的微观结构：冻干后的各种支架材料呈白色,表面粗糙,材料内部呈海绵状多孔隙结构,其中以胶原/壳聚糖体积比为9∶1的复合支架最为疏松,1∶9的支架最致密.扫描电镜下支架的胶原含量越高,支架内的胶原丝越多,支架的孔与孔之间相互连通构成了通孔.交联前后支架的形态结构无明显改变.②支架的平均孔径∶交联后体积比为9∶1,7∶3和5∶5的复合支架孔径50～200 μm,可用于细胞的三维培养.③支架的吸水性和孔隙率∶体积比为5∶5的复合支架的吸水性和含水量最高,而7∶3次之;多孔支架在水中未发生明显的溶胀现象;支架的孔隙率均在90%以上.④支架的体外生物可降解性：未交联的支架随着胶原含量的减少,支架的降解速率增加.而交联后随着胶原含量的减少,降解速率减慢,交联后的复合支架降解速度较未交联慢.⑤脂肪组织来源的干细胞在复合支架上的生长情况：脂肪组织来源的干细胞在支架上培养5 d后扫描电镜观察细胞在7∶3的支架上爬行生长并融合成片,苏木精-伊红染色观察支架孔内及表面出现大量的细胞团,并融合成片状,而5∶5支架上黏附生长的细胞较少. 结论：结合支架的孔径、吸水性、孔隙率、体外生物可降解性和细胞与支架的生物相容性,可知体积比为7∶3的复合支架对脂肪组织来源的干细胞的亲和性较好,适于脂肪组织来源的干细胞的三维培养.     

Ⅰ型胶原三维立体支架高密度培养软骨细胞的增殖及其分泌功能

目的：观察体外Ⅰ型胶原三维立体支架培养软骨细胞形态、增殖能力及Ⅱ型胶原表达的变化，并与单层培养结果相比较。方法：实验于2004—09／12在中山大学附属第三医院中心实验室完成。选择2周龄健康雄性一级新西兰大白兔1只，体质量0．5kg。体外分离兔双侧股骨髁关节软骨细胞后行单层贴壁培养，细胞铺满单层后，分别将细胞悬液按2&;#215;10^6／L，2&;#215;10^7／L，2&;#215;10^8／L密度传代培养。选择生长状态良好的第2，3代细胞置于Ⅰ型胶原三维立体支架培养。分别通过相差倒置显微镜、流式细胞仪、电镜检查以及组织学染色及免疫组织化学染色，分析软骨细胞的表型、增殖速度等生物学性状变化情况。结果：①单层培养随着时间的延长，增殖速度逐渐减慢，第6代细胞增殖能力较第2代明显下降，出现树突状的细胞突起，表现出细胞老化的趋势。分泌Ⅱ型胶原的能力也逐渐减低，第2代细胞Ⅱ型胶原免疫组化染色胞浆内呈阳性反应，至第6代呈阴性。在以低密度传代培养时上述过程出现较快，而以高密度传代培养时软骨细胞形态改变延迟。②在Ⅰ型胶原三维立体支架中培养时，软骨细胞大量增殖，能维持其细胞表型及分泌Ⅱ型胶原的功能。扫描电镜观察到软骨细胞成团吸附于支架孔隙网壁，说明支架吸附性良好，与软骨细胞相容性好。结论：软骨细胞在体外单层培养会失去细胞表型，不能分泌Ⅱ型胶原，高密度培养能减缓该过程。而在Ⅰ型胶原三维立体支架中培养，有利于维持软骨细胞的表型及分泌Ⅱ型胶原的功能。因此，建议采用在三维立体支架内高密度培养软骨细胞，构建有功能的组织工程软骨。     

胶原-壳聚糖支架材料与间充质干细胞的组织相容性

背景：近年来一些研究发现胶原蛋白-壳聚糖复合支架材料可作为神经组织工程的支架材料,但相关细胞相容性研究较少。目的：观察兔骨髓间充质干细胞在胶原蛋白-壳聚糖复合支架材料表面生长及分化情况。方法：分离培养兔骨髓间充质干细胞,无血清培养液培养,流式细胞仪检查细胞表型;然后,将其接种到凝胶支架材料表面（实验组）及多聚赖氨酸包被的盖玻片表面（对照组）,神经诱导培养基内培养,倒置相差显微镜观察干细胞的生长及分化情况。结果与结论：细胞表型为CD29＋、CD44＋、CD166＋。倒置相差显微镜观察：实验组中,接种的骨髓间充质干细胞生长良好,7d后可见有突起神经细胞,细胞生长情况与对照组未见有明显差别。证实胶原蛋白-壳聚糖复合支架材料对骨髓间充质干细胞有良好细胞相容性。     

胶原-壳聚糖支架材料与间充质干细胞的组织相容性

背景:近年来一些研究发现胶原蛋白-壳聚糖复合支架材料可作为神经组织工程的支架材料,但相关细胞相容性研究较少。目的:观察兔骨髓间充质干细胞在胶原蛋白-壳聚糖复合支架材料表面生长及分化情况。方法:分离培养兔骨髓间充质干细胞,无血清培养液培养,流式细胞仪检查细胞表型;然后,将其接种到凝胶支架材料表面(实验组)及多聚赖氨酸包被的盖玻片表面(对照组),神经诱导培养基内培养,倒置相差显微镜观察干细胞的生长及分化情况。结果与结论:细胞表型为CD29+、CD44+、CD166+。倒置相差显微镜观察:实验组中,接种的骨髓间充质干细胞生长良好,7d后可见有突起神经细胞,细胞生长情况与对照组未见有明显差别。证实胶原蛋白-壳聚糖复合支架材料对骨髓间充质干细胞有良好细胞相容性。     

分离扩增肋软骨细胞在三维支架上的种植与培养

背景:外科长段气管切除后,需要应用气管替代物,理想的替代材料需具有相当的强度、可弯曲性以及内面覆盖的上皮.合适的种子细胞、性质优良的载体、良好的生长媒介是组织工程化气管构建中最重要的组成部分.目的:寻找分离培养肋软骨细胞的最佳方法,构建软骨-支架模型.方法:将取出的兔第5,6肋软骨切成组织片,经胰酶、蛋白酶消化或酶处理后贴壁,分离肋软骨细胞并扩增.传代2次后种植于聚乳酸羟基乙酸或涤纶支架上,继续载体外环境下培养.观察单层培养扩增中软骨细胞的形态、结构,及在支架上培养时的细胞生长状态、外分泌基质.结果与结论:酶消化法和组织块培养法所获细胞均为原代肋软骨细胞,单次传代时间为5 d,但组织块培养法分离细胞较慢,且存在成纤维细胞污染情况,提示酶消化法适合用于肋软骨细胞的分离.肋软骨细胞种植于支架后贴附良好,第2周时可见基质分泌,获得软骨-支架模型,可用于构建组织工程化气管.     

滑膜间充质干细胞与软骨细胞三维条件下混合培养向软骨细胞的分化

背景：软骨细胞通过自分泌及旁分泌的作用可以为滑膜间充质干细胞向软骨细胞分化提供所需的生长因子及微环境,三维条件下更有利于细胞的黏附增殖与分化。目的：观察滑膜间充质干细胞与软骨细胞混合培养于壳聚糖/Ⅰ型胶原复合支架材料中向成软骨细胞分化的能力。方法：取SD大鼠滑膜组织及软骨组织,用酶消化法获得滑膜间充质干细胞及软骨细胞分别进行培养。取第3代滑膜间充质干细胞及第2代软骨细胞,将二者以1∶2的比例混合培养负载于壳聚糖/Ⅰ型胶原复合支架材料21 d,进行激光共聚焦扫描及免疫组织化学检测。结果与结论：培养72 h后,扫描电镜观察细胞黏附于支架材料表面,并可见细胞分泌大量基质成分。培养21 d后,激光共聚焦扫描可见细胞在支架表面分布均匀,逐层扫描后细胞逐渐减少。免疫组织化学检测可见基质能被Ⅱ型胶原染色,细胞染色呈现棕黄色。结果表明壳聚糖/Ⅰ型胶原复合支架材料提供三维生长空间,利用软骨细胞分泌生长因子及细胞间的相互作用可以诱导滑膜间充质干细胞向软骨细胞分化。     

脱细胞猪小肠黏膜下层支架复合软骨细胞构建组织工程软骨

背景：关节软骨损伤后无论是否施加干预,都难以达到满意的修复效果。目的：观察以猪自体软骨细胞为种子细胞复合脱细胞猪小肠黏膜下层构建组织工程软骨的可行性。方法：将培养至第3代的猪膝关节软骨细胞接种于小肠黏膜下层膜上,复合培养48h,构建细胞-载体复合物,光学显微镜、扫描电镜观察软骨细胞在小肠黏膜下层膜上的生长情况。结果与结论：苏木精-伊红染色见细胞在小肠黏膜下层基质层表面呈单层或复层生长;免疫组织化学染色结果显示软骨细胞与小肠黏膜下层表面之间形成一条连续阳性表达条带;扫描电镜见软骨细胞在支架孔隙内贴壁良好生长。     

脱细胞猪小肠黏膜下层支架复合软骨细胞构建组织工程软骨

背景:关节软骨损伤后无论是否施加干预,都难以达到满意的修复效果.目的:观察以猪自体软骨细胞为种子细胞复合脱细胞猪小肠黏膜下层构建组织工程软骨的可行性.方法:将培养至第3代的猪膝关节软骨细胞接种于小肠黏膜下层膜上,复合培养48 h,构建细胞-载体复合物,光学显微镜、扫描电镜观察软骨细胞在小肠黏膜下层膜上的生长情况.结果与结论:苏木精-伊红染色见细胞在小肠黏膜下层基质层表面呈单层或复层生长;免疫组织化学染色结果显示软骨细胞与小肠黏膜下层表面之间形成一条连续阳性表达条带;扫描电镜见软骨细胞在支架孔隙内贴壁良好生长.     

激活态许旺细胞在胶原几丁糖膜上的生长规律

背景：新型组织工程材料和许旺细胞扩增后置入生物合成管内去修复周围神经的缺损，是人工生物材料管的两大进展。 目的：以胶原几丁糖为支架，以激活态的许旺细胞为种子细胞，观察二者的亲和性以及激活态的许旺细胞在胶原几丁糖膜上的生长规律，为人工神经的预构做准备。 设计：开放性实验。 单位：复旦大学附属华山医院手外科。 材料：实验于2003-07／2003-12在卫生部手功能重建重点实验室完成。选取清洁级雄性SD大鼠4只。胶原几丁糖膜（上海其胜生物材料技术研究所提供），许旺细胞激活液（自制）。 方法：大鼠麻醉后坐骨神经切断预变性7d，再次麻醉后引颈处死，迅速切取双侧坐骨神经，置于含青霉素和链霉素的D—HANK’S液中，剔除神经外膜，剪碎成1min的小段，移入盛有质量浓度为5g／L的胰蛋白酶和0．6g／L的胶原酶的离心管中，每2mL液体中加入激活液0．5mL，复合酶分步消化法获激活态许旺细胞，以浓度为2&;#215;10^7 L^-1激活态的许旺细胞200μL接种于胶原几丁糖膜上和培养皿上，2周后通过相差显微镜和扫描电镜观察细胞生长情况，S-100染色鉴定细胞的纯化程度。 主要观察指标：①绘制细胞生长曲线，确定体外倍增时间。②激活态许旺细胞倒置相差显微镜下观察结果。③激活态许旺细胞接种于胶原几丁糖膜上扫描电镜观察结果。 结果：①体外倍增时间的确定：激活态的许旺细胞接种于胶原几丁糖膜和培养皿上时的浓度均是2&;#215;10^7 L^-1，2周后细胞浓度分别达到30&;#215;10^7 L^-1和20&;#215;10^7 L^-1。根据DT=（t-t0）lg 2／（lgn-lgno）算出激活态许旺细胞在胶原几丁糖膜上的倍增时间为4d。②激活态许旺细胞倒置相差显微镜下观察结果：接种于培养皿上的激活态许旺细胞24h后大多数由圆球形变成长梭形，有突起，多为双极，也有的呈三极状；接种于膜上的激活态许旺外形上和培养皿中无明显差异，但膜上的激活态许旺细胞在相差显微镜下犹如“刻在沙地上的文字”一般。S-100染色见激活态许旺细胞成棕色，纯度达95％以上。③激活态许旺细胞接种于胶原几丁糖膜上扫描电镜观察结果：激活态许旺细胞多数生长于胶原几丁糖膜的凹陷中或紧贴膜表面，呈有规律的首尾相接贴附于膜上，胞体呈纺锤形，直径在4-6μm，长度为60-80μm，细胞呈梭形，有许多细小分枝。1周时膜的形态仍然完整。 结论：胶原几丁糖膜和高度纯化的激活态许旺细胞有良好的亲和性，以其为工艺材料制成的组织工程支架很有可能在促进周围神经再生中发挥优势作用。     

卵磷脂、多聚赖氨酸二次包埋新型支架材料的亲水性及对人鼻中隔软骨细胞的吸附力(英文)

背景: 甲壳胺是一种天然生物材料, 具有良好的生物相容性、可降解吸收性及优良的力学性能, 但在软骨组织工程中可否成为一种较理想的细胞支架?目的: 观察以卵磷脂和多聚赖氨酸共同包埋新型支架- 聚丙交酯- 乙交酯共聚物 / 甲壳胺无纺布, 对支架亲水性和对人鼻中隔软骨细胞吸附力的改变, 及对人鼻中隔软骨细胞功能的影响。设计: 空白对照实验。单位: 解放军南京军区南京总医院耳鼻咽喉- 头颈外科。材料: 实验于 2005- 10/2006- 06 于解放军南京军区总医院耳鼻咽喉-头颅外科实验室完成。甲壳胺无纺布( 海南欣龙公司) , 主要技术参数为: 脱乙酰度≥90%, 相对分子质量(2～5)×105; 聚丙交酯- 乙交酯共聚物 / 甲壳胺无纺布支架为南京军区南京总医院耳鼻咽喉- 头颈外科与中山大学高分子研究所合作自行制备, 其主要技术参数为: 单体丙交酯和乙交酯的摩尔比为 75∶25, 孔隙率 82%～86%, 孔径 100～300 μm, 剪切强度为 48 MPa, 厚度约 1.5 mm, 完全降解时间 14～18 周。人鼻中隔软骨细胞为无菌条件下取鼻中隔偏曲手术患者的鼻中隔软骨。方法: 将 PLGA/ 甲壳胺无纺布支架剪成 1.5 cm×1.5 cm 大小的片状, 体积分数为 0.01 的卵磷脂无水乙醇及 1 g/L 多聚赖氨酸中浸泡 6 h, 干燥后紫外线照射 1 h, 体积分数为 0.75 乙醇中浸泡 24 h, 大量 Hanks 液冲洗后孵育 24 h。得到含不同成分的 2 种类型支架: ①单纯支架; ②卵磷脂 多聚赖氨酸包埋的支架。取第 3 代的人鼻中隔软骨细胞制成细胞悬液, 将细胞悬液种于 2 种支架上, 通过观察人鼻中隔软骨细胞悬液在支架上扩散程度来判断其亲水性大小, 在相差显微镜下观察人鼻中隔软骨细胞悬液在支架上是否飘动来判断细胞与支架的吸附情况; 同时观察细胞生长繁殖及基质产生情况。主要观察指标: ①两种支架材料亲水性( 人鼻中隔软骨细胞悬液在支架上扩散程度) 、对细胞的吸附力(人鼻中隔软骨细胞悬液在支架上是否飘动)。②细胞生长繁殖及基质产生情况。结果: ①单纯支架加入人鼻中隔软骨细胞悬液后悬液先呈球型附在支架表面, 然后缓慢地扩散到支架空隙内。培养期间相差显微镜观察见细胞成团地附在支架纤维表面, 晃动培养皿可见细胞团漂浮不定[黏附率为(21±3.7)%], 随着培养时间延长无基质产生。②卵磷脂 多聚赖氨酸包埋的支架加入人鼻中隔软骨细胞悬液后悬液迅速均匀地扩散到支架空隙内[黏附率为(89±5.6)%, 高于单纯支架组], 表明支架有较强的亲水性; 相差显微镜下见软骨细胞以单个或群落状均匀分布于支架纤维之间及吸附在支架纤维表面, 晃动培养皿细胞团无飘动, 散落在培养皿底部的细胞较少, 表明支架对细胞有较强的吸附力; 培养 1 周, 支架纤维间有呈蜘蛛网状基质产生, 随着培养时间延长, 基质产生旺盛。结论: 以卵磷脂和多聚赖氨酸共同包埋的聚丙交酯- 乙交酯共聚物 / 甲壳胺无纺布的新型生物支架, 亲水性良好, 对人鼻中隔软骨细胞的吸附力明显增强, 并可促进软骨细胞分泌基质。     

卵磷脂、多聚赖氨酸二次包埋新型支架材料的新水性及对人鼻中隔软骨细胞的吸附力

背景: 甲壳胺是一种天然生物材料, 具有良好的生物相容性、可降解吸收性及优良的力学性能, 但在软骨组织工程中可否成为一种较理想的细胞支架?目的: 观察以卵磷脂和多聚赖氨酸共同包埋新型支架- 聚丙交酯- 乙交酯共聚物 / 甲壳胺无纺布, 对支架亲水性和对人鼻中隔软骨细胞吸附力的改变, 及对人鼻中隔软骨细胞功能的影响。设计: 空白对照实验。单位: 解放军南京军区南京总医院耳鼻咽喉- 头颈外科。材料: 实验于 2005- 10/2006- 06 于解放军南京军区总医院耳鼻咽喉-头颅外科实验室完成。甲壳胺无纺布( 海南欣龙公司) , 主要技术参数为: 脱乙酰度≥90%, 相对分子质量(2～5)×105; 聚丙交酯- 乙交酯共聚物 / 甲壳胺无纺布支架为南京军区南京总医院耳鼻咽喉- 头颈外科与中山大学高分子研究所合作自行制备, 其主要技术参数为: 单体丙交酯和乙交酯的摩尔比为 75∶25, 孔隙率 82%～86%, 孔径 100～300 μm, 剪切强度为 48 MPa, 厚度约 1.5 mm, 完全降解时间 14～18 周。人鼻中隔软骨细胞为无菌条件下取鼻中隔偏曲手术患者的鼻中隔软骨。方法: 将 PLGA/ 甲壳胺无纺布支架剪成 1.5 cm×1.5 cm 大小的片状, 体积分数为 0.01 的卵磷脂无水乙醇及 1 g/L 多聚赖氨酸中浸泡 6 h, 干燥后紫外线照射 1 h, 体积分数为 0.75 乙醇中浸泡 24 h, 大量 Hanks 液冲洗后孵育 24 h。得到含不同成分的 2 种类型支架: ①单纯支架; ②卵磷脂 多聚赖氨酸包埋的支架。取第 3 代的人鼻中隔软骨细胞制成细胞悬液, 将细胞悬液种于 2 种支架上, 通过观察人鼻中隔软骨细胞悬液在支架上扩散程度来判断其亲水性大小, 在相差显微镜下观察人鼻中隔软骨细胞悬液在支架上是否飘动来判断细胞与支架的吸附情况; 同时观察细胞生长繁殖及基质产生情况。主要观察指标: ①两种支架材料亲水性( 人鼻中隔软骨细胞悬液在支架上扩散程度) 、对细胞的吸附力(人鼻中隔软骨细胞悬液在支架上是否飘动)。②细胞生长繁殖及基质产生情况。结果: ①单纯支架加入人鼻中隔软骨细胞悬液后悬液先呈球型附在支架表面, 然后缓慢地扩散到支架空隙内。培养期间相差显微镜观察见细胞成团地附在支架纤维表面, 晃动培养皿可见细胞团漂浮不定[黏附率为(21±3.7)%], 随着培养时间延长无基质产生。②卵磷脂 多聚赖氨酸包埋的支架加入人鼻中隔软骨细胞悬液后悬液迅速均匀地扩散到支架空隙内[黏附率为(89±5.6)%, 高于单纯支架组], 表明支架有较强的亲水性; 相差显微镜下见软骨细胞以单个或群落状均匀分布于支架纤维之间及吸附在支架纤维表面, 晃动培养皿细胞团无飘动, 散落在培养皿底部的细胞较少, 表明支架对细胞有较强的吸附力; 培养 1 周, 支架纤维间有呈蜘蛛网状基质产生, 随着培养时间延长, 基质产生旺盛。结论: 以卵磷脂和多聚赖氨酸共同包埋的聚丙交酯- 乙交酯共聚物 / 甲壳胺无纺布的新型生物支架, 亲水性良好, 对人鼻中隔软骨细胞的吸附力明显增强, 并可促进软骨细胞分泌基质。     

碱性成纤维细胞生长因子对生长板软骨细胞增殖与分化的影响

背景：体外培养软骨细胞经历多次传代后，其增殖能力将逐渐退化。实验表明，碱性成纤维细胞生长因子可促进软骨细胞增殖，并可能影响软骨细胞的表型与分化。目的：观察碱性成纤维细胞生长因子对生长板软骨细胞增殖和分化的影响，并筛选其用于体外软骨细胞培养的最佳剂量。设计、时间及地点：以细胞为观察对象的观察对比实验，于2004—10／2005—02在暨南大学医学院生化教研室组织工程实验室完成。材料：选用12只新西兰白兔用于分离软骨细胞，碱性成纤维细胞生长因子由英国PeproTech公司生产。方法：分离并在低血清条件下培养兔生长板软骨细胞。根据实验需要加入0，1，2．5，5，10，25，50及100μg／L8个剂量的碱性成纤维细胞生长因子，进行各项指标观察。主要观察指标：应用改良四甲基偶氮唑蓝比色法检测细胞增殖倍数；应用羟脯氨酸法测定软骨细胞胶原产量：应用酶动力学方法测定碱性磷酸酶活性。结果：①碱性成纤维细胞生长因子剂量在5～100μg／L范围内可以促进软骨细胞增殖，并以25μg／L时刺激效果最为显著。②当碱性成纤维细胞生长因子剂量高于25μg／L时，软骨细胞的胶原合成被抑制。③当碱性成纤维细胞生长因子剂量高于1ug／L时，软骨细胞的碱性磷酸酶活性被抑制。结论：碱性成纤维细胞生长因子可以刺激生长板软骨细胞增殖，并在剂量高于25μg／L时抑制生长板软骨细胞的分化。     

AdLacZ基因修饰山羊耳软骨细胞复合F127构建组织工程化软骨

目的:应用AdLacZ基因修饰体外培养的山羊耳软骨细胞,并与Pluronic F127支架材料复合,观察裸鼠皮下软骨形成的情况,为进一步应用软骨分化因子基因修饰重建软骨的研究提供参数。方法:实验于2004-11/2006-12在上海交通大学医学院附属第九人民医院完成。①实验材料:取健康雄性山羊,体质量26～30kg。6周龄BALB/c裸鼠24只,体质量20g。体外培养山羊耳软骨细胞,转染AdLacZ基因,检测基因转染效率。②实验方法:将基因修饰的细胞与可吸收生物材料PluronicF127混合形成细胞-生物材料复合物,并注射到6只裸鼠皮下,每只在其背部皮下分别接种2个点,分别在术后2,4周取材,每个时间点有标本6例。另取裸鼠18只,同样设计,分别以未转基因的软骨细胞-材料复合物、单独注射的软骨细胞、或单独注射的F127支架作为对照组,每组6只。③实验评估:标本行苏木精-伊红染色、阿利新蓝染色,并对4周标本行X-gal染色,Ⅱ型胶原免疫组织化学检测。结果:纳入BALB/c裸鼠24只,均进入结果分析。①50pfu/细胞可以获得80%的转染效率。②2周时细胞-材料复合物形成了不成熟的软骨样组织,苏木精-伊红染色显示外周呈纤维样组织包裹,中部大部分为不成熟的软骨细胞;4周实验组中央部位出现少量稍成熟的软骨,阿利新蓝染色显示该部位为深蓝色的巢状软骨,部分细胞有Ⅱ型胶原阳性表达。冰冻切片X-gal染色提示细胞来自于植入的软骨-材料复合物。对照组未转基因的软骨细胞-材料复合物,其组织学及Ⅱ型胶原免疫组织化学表现与实验组没有明显差别,而X-gal染色为阴性。单独注射软骨细胞或单独注射F127支架,在4周内则均未见到软骨形成。结论:腺病毒载体可向软骨细胞高效转移目的基因,F127支架材料是软骨再生较为理想的支架材料。