细胞移植及髓核组织工程重建修复椎间盘退变

背景：通过细胞组织工程将细胞或细胞支架复合体植入退变缺损的椎间盘内,使退变的椎间盘再生可能是治疗椎间盘退变性疾病最为理想的方法。目的：评价组织工程髓核体内移植抑制腰椎间盘退变的临床疗效及应用前景。方法：由第一作者检索1990/2010 PubMed数据、中国知网及万方数据库有关组织工程髓核、组织工程材料及骨髓间充质干细胞治疗腰椎间盘退变方面的文献。结果与结论：目前常用的细胞支架主要包括胶原支架、琼脂糖支架、藻酸盐支架、聚乙醇酸支架与壳聚糖支架以及复合材料等。通过自体椎间盘细胞或间充质干细胞结合基因技术筛选种子细胞,进行细胞和/或细胞支架复合体移植恢复或再生相关细胞外基质的合成,通过逆转和修复椎间盘细胞病理性改变,为退变的椎间盘组织和功能恢复提供了全新的治疗策略。     

间充质干细胞移植修复椎间盘退变的研究进展

下腰痛影响了不少人的生活和工作,造成沉重的社会、经济负担。下腰痛最主要的原因是椎间盘退变,目前临床上治疗椎间盘退变的方法有保守治疗和椎体融合等手术治疗,这些方法可以缓解症状但是不针对退变的原因。通过恢复椎间盘功能来缓解疼痛的方法受到人们关注,利用组织工程学方法逆转椎间盘退变已经实现。成体间充质干细胞可以分化为髓核样细胞为椎间盘组织工程提供了种子细胞。目前这种方法初步应用于临床前研究,但是许多问题有待进一步解决,例如间充质干细胞在宿主椎间盘中如何生存和增殖,移植过程中是否需要生物支架以及移植的安全性等。     

脂肪间充质干细胞复合血小板凝胶修复兔椎间盘退变

背景:富含血小板的血浆凝胶作为三维支架使其中干细胞可以呈立体生长,同时富含血小板的血浆凝胶又释放大量生长因子,促进脂肪间充质干细胞增殖及分化.目的:探讨脂肪间充质干细胞-富含血小板的血浆凝胶复合体注入兔椎间盘退变模型后的修复作用.方法:取兔动脉血采用二次离心法制备自体富血小板血浆,取兔肩胛间区脂肪分离培养脂肪间充质干细胞,制备脂肪间充质干细胞-富含血小板的血浆凝胶复合体.新西兰大白兔随机分为对照组、模型组、富含血小板的血浆凝胶组和脂肪间充质干细胞-富含血小板的血浆凝胶复合体组,后3组以穿刺法制备椎间盘退变模型,退变模型制备完成2周后,富含血小板的血浆凝胶组和脂肪间充质干细胞-富含血小板的血浆凝胶复合体组分别对退变间盘中注射相应材料.结果与结论:兔椎间盘退变后,间隙明显降低,髓核信号明显降低,髓核内基质高,密度染色较深;而经富含血小板的血浆凝胶和脂肪间充质干细胞-富含血小板的血浆凝胶复合体治疗后,上述症状明显改善,且脂肪间充质干细胞-富含血小板的血浆凝胶复合体的治疗效果更好.提示对退变椎间盘内注射富含血小板的血浆凝胶支架及脂肪间充质干细胞-富含血小板的血浆凝胶复合体均有利于减少退变对椎间盘的影响,其中脂肪间充质干细胞-富含血小板的血浆凝胶复合体注射效果更为突出.     

间充质干细胞治疗椎间盘退变的研究进展

下腰痛已严重影响了人们的工作和生活,带来了严重的经济负担和社会负担。下腰痛主要是由椎间盘退变性疾病引起,保守治疗和手术治疗是目前临床上治疗椎间盘退变的常用方法,但这些方法仅限于缓解症状,而无法从根本上扭转椎间盘退变。人们已经开始关注通过恢复椎间盘细胞的数量和功能,从而实现生物学修复椎间盘退变的目的。间充质干细胞可分化为髓核样细胞,这为利用干细胞治疗椎间盘退变提供了种子细胞。间充质干细胞与椎间盘细胞的共培养技术也为此提供了可行的方法。目前这种方法也仅限于临床前研究,还有许多问题需要解决,例如:如何确定髓核细胞表型、如何避免干细胞的渗漏和肿瘤形成等。     

透明质酸钠溶液复合可注射型骨髓间充质干细胞修复退变椎间盘

背景:透明质酸作为椎间盘组织工程支架的基质材料,可提供蛋白多糖附着点,增加蛋白多糖的沉积,以足够大的孔率允许种子细胞长入.目的:观察透明质酸钠混合溶液复合骨髓间充质干细胞修复兔退变椎间盘的效果.方法:以后外侧穿刺抽吸L1/2和L3/4髓核构建日本大耳白兔椎间盘退变模型,造模后2周应用微量注射器向L3/4椎间盘内注射同种异体骨髓间充质干细胞与透明质酸钠混合溶液作为实验组,L1/2椎间盘注射透明质酸钠作为对照组.注射后2,4,8,12 周时行兔椎间盘影像学及病理学检查.结果与结论:对照组椎间盘高度呈降低趋势,实验组注射后2周椎间盘高度缓慢下降,之后缓慢升高,两组在4个时间点椎间盘高度指数改变差异有显著性意义(P < 0.05).病理结果显示实验组髓核纤维环形态得到保留,髓核纤维环边界清晰,植入的骨髓间充质干细胞产生增殖分裂,并向周围迁徙规律排列,其病理学评分明显高于对照组.12周内实验组Ⅱ型胶原含量高于对照组(P < 0.05).说明移植于退变椎间盘内的骨髓间充质干细胞能够存活,且有增殖能力,其与透明质酸钠混合溶液联合移植可以延缓退变椎间盘进一步退变,并促进退变椎间盘修复.     

骨髓间充质干细胞与髓核细胞的体外共培养

背景:细胞移植治疗椎间盘退行性变目前尚处在实验室研究阶段.目的:通过SD大鼠骨髓间充质干细胞与退行性改变的髓核细胞体外共培养,探索骨髓间充质干细胞能否通过直接接触促进髓核细胞外基质的表达以及髓核细胞能否诱导骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化.方法:取已自然退变的第6 代髓核细胞与生长良好的第4 代骨髓间充质干细胞按不同比例(75∶25,50∶50 和25∶75)体外共培养7 d,单独髓核细胞(100∶0)与单独骨髓间充质干细胞(0∶100)分别作为阳性对照和阴性对照.结果与结论:RT-PCR 检测显示共培养组(75∶25 和50∶50)蛋白多糖和Ⅱ型胶原蛋白条带均明显亮于单独髓核细胞培养组(100∶0),吸光度值比较差异有显著性意义;免疫组织化学检测显示Ⅱ型胶原蛋白在共培养组(75∶25 和50∶50)胞浆内的表达明显高于单独髓核细胞培养组(100∶0).共培养组中可见骨髓间充质干细胞由长梭形向多角形、类圆形转变,胞浆内异染颗粒增多.提示通过体外直接接触共培养,骨髓间充质干细胞能逆转髓核细胞退变,而且髓核细胞能诱导骨髓间充质干细胞向类髓核细胞转换.     

构建兔髓核细胞诱导人骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化的体外模型

背景:目前尚缺乏诱导骨髓间充质干细胞向髓核细胞转化的体外模型.目的:建立兔髓核细胞诱导人骨髓间充质干细胞分化为类髓核细胞的体外模型,为髓核细胞体内移植培养种子细胞提供实验依据.设计、时间及地点:对比观察,于2008-08/2009-03在青岛大学医学院附属医院骨科研究所和中心实验室完成.材料:8周龄新西兰大白兔2只用于兔髓核细胞的分离培养:人椎间盘髓核组织为术中取自16岁先天性脊柱侧弯患者T_(12)L_1、L_(1.2)椎间盘髓核组织,患者家属知情同意.人骨髓间充质干细胞株为广州赛业生物科技有限公司产品.方法:将人骨髓间充质干细胞和兔髓核细胞新式分层共培养(应用去掉挂臂、膜孔为0.4 μm的小室,膜底与贴壁细胞相接触,膜上下两种细胞比例为50%:50%)7 d,同时设立传统的分层培养(带有挂臂的小室)组、单独人骨髓间充质干细胞培养组和髓核细胞培养组为对照.主要观察指标:反转录-聚合酶链反应和Western blot检测蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的表达.结果:传统分层培养组及单独人骨髓间充质干细胞培养组不表达蛋白聚糖和Ⅱ型胶原.新式分层培养组、单独髓核细胞培养组Ⅱ型胶原和蛋白聚糖mRNA表达均高于传统分层培养组、单独人骨髓间充质干细胞培养组(P＜0.01).新式分层培养组与单独髓核细胞培养组比较及传统分层培养组与单独人骨髓间充质干细胞培养组比较,差异无显著性意义(P＞0.05).结论:新式分层培养人骨髓间充质干细胞能较高的表达蛋白聚糖和Ⅱ型胶原,接近椎间盘未退变人的髓核细胞表达水平,表明成功建立兔髓核细胞诱导人骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化的体外模型,为椎间盘退变的细胞治疗奠定了基础.     

透明质酸钠溶液复合可注射型骨髓间充质干细胞修复退变椎间盘

背景：透明质酸作为椎间盘组织工程支架的基质材料,可提供蛋白多糖附着点,增加蛋白多糖的沉积,以足够大的孔率允许种子细胞长入。目的：观察透明质酸钠混合溶液复合骨髓间充质干细胞修复兔退变椎间盘的效果。方法：以后外侧穿刺抽吸L1/2和L3/4髓核构建日本大耳白兔椎间盘退变模型,造模后2周应用微量注射器向L3/4椎间盘内注射同种异体骨髓间充质干细胞与透明质酸钠混合溶液作为实验组,L1/2椎间盘注射透明质酸钠作为对照组。注射后2,4,8,12周时行兔椎间盘影像学及病理学检查。结果与结论：对照组椎间盘高度呈降低趋势,实验组注射后2周椎间盘高度缓慢下降,之后缓慢升高,两组在4个时间点椎间盘高度指数改变差异有显著性意义（P〈0.05）。病理结果显示实验组髓核纤维环形态得到保留,髓核纤维环边界清晰,植入的骨髓间充质干细胞产生增殖分裂,并向周围迁徙规律排列,其病理学评分明显高于对照组。12周内实验组Ⅱ型胶原含量高于对照组（P〈0.05）。说明移植于退变椎间盘内的骨髓间充质干细胞能够存活,且有增殖能力,其与透明质酸钠混合溶液联合移植可以延缓退变椎间盘进一步退变,并促进退变椎间盘修复。     

髓核细胞移植抑制椎间盘退变

背景：近年来,椎间盘细胞移植和椎间盘移植修复椎间盘退变研究取得较大的进展。目的：探讨髓核细胞的体外培养方法以及髓核细胞移植在抑制椎间盘退变研究中的作用。方法：通过数据库检索的方式探讨髓核细胞移植抑制椎间盘退变的研究。髓核细胞的主要功能是产生胶原和蛋白聚糖,改进髓核细胞的培养方法,使培养后的髓核细胞数量增多,合成和分泌细胞外基质增加,通过髓核细胞移植来修复退变的椎间盘。结果与结论：通过三维小球聚集培养、微载体旋转立体培养等方法可以使髓核细胞数量增多,肝细胞生长因子对髓核细胞增殖产生促进作用。髓核细胞移植可以恢复退变椎间盘高度,促进退变椎间盘内蛋白多糖和Ⅱ型胶原的生物合成和分泌。随着对椎间盘退变研究的不断深入,髓核细胞移植对退变椎间盘可能是一种重要的治疗手段。     

新式分层共培养环境下人骨髓间充质干细胞诱导髓核细胞的分化

背景:诱导分化的骨髓间充质干细胞或髓核细胞移植都存在一定的局限性,抑制自体髓核细胞的退行性变有望成为未来治疗椎间盘退变的有效方法.目的:通过建立骨髓间充质干细胞和髓核细胞分层共培养模型,观察骨髓间充质干细胞对髓核细胞分化的影响.方法:取传至第4代的骨髓间充质干细胞,分为2组:新式分层培养组将髓核细胞接种于去掉挂臂的Transwell小室,膜孔0.4 μm,其与骨髓间充质干细胞比例为1∶1;传统分层培养组同法将髓核细胞接种于带有挂臂的Transwell小室.同时设立单独髓核细胞培养组,各组均培养7 d.免疫组织化学法检测Ⅱ型胶原的表达,~(35)S放射标记渗入放免定量检测蛋白多糖的合成.结果与结论:与单独髓核细胞培养组比较,传统分层培养组、新式分层培养组Ⅱ型胶原阳性细胞数、蛋白多糖合成量均明显增加(P < 0.05,P < 0.01),且新式分层培养组增高幅度大于传统分层培养组(P < 0.05).提示骨髓间充质干细胞与髓核细胞接触共培养后,能显著增加髓核细胞分化增殖和特征性物质的表达,且新式分层培养环境优于传统分层培养.     

多次胶原酶消化法培养小鼠椎间盘髓核细胞

背景：椎间盘为无血运组织,椎间盘髓核细胞为分化终末细胞,细胞增殖能力较差,体外培养难度较大。目的：探索小鼠椎间盘髓核细胞体外分离培养的方法。方法：取小鼠椎间盘髓核组织,使用多次胶原酶消化的方法,分离培养髓核组织细胞,接种,传代,取第2代细胞,分别采用免疫细胞化学和RT-PCR方法检测椎间盘髓核细胞特征性分泌物Ⅱ型胶原和聚合蛋白的分泌量及mRNA的表达,并与软骨细胞,成骨细胞及成纤维细胞进行比较。结果与结论：椎间盘髓核细胞贴壁后呈现软骨细胞的形态;Ⅱ型胶原和聚合蛋白染色均为阳性;Ⅱ型胶原和聚合蛋白mRNA表达与软骨细胞相同,与成纤维细胞和成骨细胞存在明显差别。说明多次胶原酶消化的方法可以获得大量纯净的椎间盘髓核细胞,性状稳定。     

髓核组织工程学研究进展

椎间盘退化是临床上一个重大的问题,椎间盘退化起自于椎间盘细胞以及髓核细胞外基质的变化。近年来,随着对椎间盘退变的分子学基础研究的进展,人们提出用生物对策来修复和恢复退变的椎间盘,其中一种很有希望的方法是应用组织工程的方法修复退变的椎间盘,恢复椎间盘组织的功能。作者就种子细胞、细胞支架和生长因子方面髓核组织工程学的研究进展进行综述。     

体外培养人退变髓核细胞的生物学性状

背景：椎间盘退行性变后很难自行修复,研究退变髓核细胞的生物学特性可为研究椎间盘退变机制、组织工程椎间盘构建、基因治疗等提供理论基础。目的：观察体外培养的人退变髓核细胞的生物学特性。方法：分离培养人退变椎间盘髓核细胞,采用光镜、电镜观察细胞的形态和超微结构,荧光定量PCR技术检测髓核细胞Ⅱ型胶原和糖胺多糖mRNA的表达。ELISA法检测细胞培养上清中人Ⅱ型胶原水平,DMMB比色法检测细胞培养上清中糖胺多糖水平。结果与结论：体外培养的传2代内的退变椎间盘髓核细胞结构与原代细胞相似,传3代后的细胞出现退变及凋亡改变。对体外培养第1代的退变髓核细胞和正常髓核细胞的Ⅱ型胶原和糖胺多糖进行检测发现,退变髓核细胞Ⅱ型胶原、糖胺多糖mRNA水平及细胞外基质中Ⅱ型胶原和糖胺多糖的表达均明显低于正常髓核细胞,呈现去分化趋势。     

体外培养人退变髓核细胞的生物学性状

背景:椎间盘退行性变后很难自行修复,研究退变髓核细胞的生物学特性可为研究椎间盘退变机制、组织工程椎间盘构建、基因治疗等提供理论基础.目的:观察体外培养的人退变髓核细胞的生物学特性.方法:分离培养人退变椎间盘髓核细胞,采用光镜、电镜观察细胞的形态和超微结构,荧光定量PCR技术检测髓核细胞Ⅱ型胶原和糖胺多糖mRNA的表达.ELISA法检测细胞培养上清中人Ⅱ型胶原水平,DMMB比色法检测细胞培养上清中糖胺多糖水平.结果与结论:体外培养的传2代内的退变椎间盘髓核细胞结构与原代细胞相似,传3代后的细胞出现退变及凋亡改变.对体外培养第1代的退变髓核细胞和正常髓核细胞的Ⅱ型胶原和糖胺多糖进行检测发现,退变髓核细胞Ⅱ型胶原、糖胺多糖mRNA水平及细胞外基质中Ⅱ型胶原和糖胺多糖的表达均明显低于正常髓核细胞,呈现去分化趋势.     

正常与退变髓核细胞的变形能力

背景：细胞的变形能力在较大程度上能反映出细胞结构与功能的改变,目前对髓核细胞在细胞力学方面的研究较少。目的：分析正常和退变髓核细胞的变形能力。方法：正常髓核组织和退变髓核组织分别取材于3例脊柱侧弯患者和3例椎间盘突出患者术中取出的废弃髓核组织,用胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶分离提取细胞,行原代培养,通过微管加载装置适宜负压下测量细胞在第4秒时吸入微管的长度,并行统计学处理。结果与结论：正常髓核细胞和退变髓核细胞所用的负压分别为（411.31±27.93）Pa,（434.24±46.26）Pa,差异有显著性意义（P〈0.05）。在4s时吸入长度分别为（2.20±0.92）μm,（2.48±0.71）μm,差异无显著性意义（P〉0.05）。结果可见在规定时间的情况下,吸入微管的长度基本相同时,退变髓核细胞所需要的负压较正常髓核细胞大,说明退变髓核细胞的变形能力比正常髓核细胞差。     

不同代次免髓核细胞的形态学特征和生物学性状

背景：椎间盘退变是个慢性、复杂的过程,然而椎间盘退变其发生机制尚未完全阐明,很难自行修复。近年来研究细胞移植治疗椎间盘退行性变尚处在实验室阶段。研究髓核细胞的生物学性状可为研究椎间盘退变机制、组织工程构建椎间盘、基因治疗等提供理论依据。目的：研究兔不同代次髓核细胞的生物学特性,旨在找出合适的种子细胞去治疗椎间盘退变性疾病。方法：从新西兰大耳白兔椎间盘髓核组织中,分离并培养髓核细胞同时进行培养传代,对原代及第3,4代髓核细胞进行苏木精一伊红染色观察细胞形态学变化;甲苯胺蓝染色和免疫细胞化学法检测髓核细胞内聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的表达;反转录PCR法测定Ⅱ型胶原和聚合蛋白聚糖mRNA的表达水平,观察各代髓核细胞生物学特性的变化。结果与结论：兔椎间盘髓核细胞可以在体外培养并进行传代,原代髓核细胞一般需7d左右贴壁,形状呈类圆形或多角形,原代和第3代髓核细胞都呈圆形或多角形,活力较强,苏木精-伊红染色后细胞核被染成均一蓝黑色,胞浆呈现淡粉色;髓核细胞经过甲苯胺蓝染色后,胞浆内呈现天蓝色,通过Ⅱ型胶原免疫组织化学染色后,胞浆内表现为黄褐色沉淀。到第4代细胞出现退变,Ⅱ型胶原和聚合蛋白聚糖mRNA的表达水平较前几代细胞显著下降。前3代的髓核细胞代谢旺盛,表型一致,聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原表达正常,传第4代后髓核细胞开始出现衰老、退变。     

模拟人后路髓核摘除构建椎间盘退行性变动物模型

背景:髓核摘除术是治疗椎间盘突出的经典方法,但存在较高的复发率.目的:验证模拟人后路髓核摘除进行后外侧穿刺抽吸髓核,建立椎间盘退行性变动物模型的可行性.设计、时间及地点:观察对照实验,于2006-10/2007-02在解放军南京军区福州总医院动物实验室完成.材料:选用日本大耳白兔20只,行椎间盘退行性变动物模型制备.方法:用持针器夹持21G穿刺针,行L<,1-2>及L<,3-4>椎间盘右后外侧穿刺髓核抽吸法摘除部分髓核组织,术后2,4,8,12周分别对造模后椎闻盘行组织学观察,并将L<,2-3>椎间盘作为对照.主要观察指标:通过苏木精-伊红染色观察椎间盘组织学结构.结果:苏木精-伊红染色可见对照椎间盘大多髓核完整,髓核与纤维环分界清晰,纤维环结构接近正常,髓核组织中有大量髓核细胞.造模后第4周髓核细胞数量不断减少,第12周时髓核中主要为纤维组织,伴有极少量髓核细胞.结论:模拟人后路髓核摘除术建立后外侧纤维环穿刺髓核抽吸的椎间盘退行性变动物模型成功建立.可为应用组织工程修复重建退行性变椎间盘提供有效的动物模型.     

正常与退变髓核细胞形态学及Ⅱ型胶原蛋白的定量分析

背景：椎间盘退变导致椎间隙狭窄的主要变化是髓核细胞表达软骨特异性基因产物蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的减少。 目的：对成人的正常与退变椎间盘髓核细胞Ⅱ型胶原蛋白免疫荧光染色及番红O染色进行定量观察比较。 方法：取成人脊柱侧弯患者与椎间盘突出症患者自愿者术中取出的废弃髓核组织各3例,经培养后每个患者各测量26个细胞,正常组和退变组分别测量78个细胞。对正常与退变椎间盘髓核细胞进行番红“O”染色并行灰度及测定细胞内Ⅱ型胶原蛋白行免疫荧光染色定量测定。 结果与结论：免疫荧光染色显示：退变椎间盘髓核细胞仅轻度染色,染色模糊,其呈类圆形,纺锤形,梭形及不规则形,其内仅有极少量荧光颗粒;Ⅱ型胶原表达较正常髓核细胞降低显著（P〈0.05）。番红O染色显示：退变的髓核细胞肿胀,细胞核肿胀染色略淡,细胞突起延长,胞浆染色不匀伴有空泡,部分细胞崩解,细胞分布零散,混乱,可见成片坏死区。与正常髓核细胞图像灰度值相比差异无显著性意义（P〉0.05）。结果表明退变的椎间盘髓核细胞减少、部分凋亡,其细胞内Ⅱ型胶原蛋白含量较正常髓核细胞显著减少。