深低温冷冻骨的形态学及免疫组织化学检测

背景：深低温冷冻技术能够降低同种异体骨的免疫原性,对修复骨缺损具有重要意义。目的：观察深低温冷冻对骨材料中骨形态发生蛋白2表达的影响。方法：18只新西兰兔随机分为3组,深低温冷冻3个月组,深低温冷冻6个月组,新鲜骨对照组,取右侧胫骨中上1/3,分别于-80℃保存保存3个月,6个月及不保存,进行苏木精-伊红染色和骨形态发生蛋白2免疫组织化学染色。结果与结论：深低温冷冻后骨材料形态学,与新鲜骨差异不大;深低温冷冻3个月及6个月骨组织中骨形态发生蛋白2均有表达,但较新鲜骨降低。     

自制人骨形态发生蛋白2复合骨修复材料诱导骨再生

背景:骨形态发生蛋白是目前发现的一类惟一可独立诱导骨再生的细胞因子,临床应用前景广阔.但它们价格昂贵,限制了在中国的应用.目的:探讨自主生产的重组人骨形态发生蛋白2的骨诱导活性及对骨缺损的修复作用.方法:通过电泳及质谱的方法检测其复性后重组人骨形态发生蛋白2的纯度,通过C2C12细胞在重组人骨形态发生蛋白2诱导下向成骨细胞分化检测其骨诱导活性.将重组人骨形态发生蛋白2与以动物骨为原料加工制成的新型骨修复材料复合,植入新西兰兔桡骨缺损实验模型观察其对骨缺损的修复作用.结果与结论:自主生产的重组人骨形态发生蛋白2纯度≥95%,能明显诱导C2C12细胞向成骨细胞分化,分化早期大量表达碱性磷酸酶,分化末期形成大量的矿化小节,诱骨活性良好.在兔桡骨修复试验中,X射线影像学及苏木精-伊红染色组织学检查结果表明,重组人骨形态发生蛋白2复合材料组在2个月时形成大量骨痂,4-6个月时载体与自体骨融合,材料大量降解,修复效果良好;单纯骨填充材料组4-6个月时只有少量新生骨桥与自体骨连接,降解量极少;空白对照组损伤部位为纤维化组织所填充.结果提示自主生产的重组人骨形态发生蛋白2促进骨修复作用明显,适合应用于临床.     

玻璃化法和低温冷冻法保存兔股动脉的形态结构及力学性能比较

背景:一种有效的保存方法必须能够保存组织的完整结构.目的:比较玻璃化法和低温冷冻法保存对动脉形态结构和力学性能的影响.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2001-0912004-08在解放军总医院骨科研究所完成.材料:新两兰兔18只,按随机数字法分为3组:玻璃化法保存组,低温冷冻法保存组,新鲜血管组,每组6只.方法:切取股动脉标本,置于平衡液中备用.玻璃化法保存组血管在4℃条件下经25%,50%和100%梯度玻璃化溶液浸泡后,直接投入液氮中.低温冷冻法保存组血管由常温状态下,经过0,-20,-70℃梯度降温,平衡60 min,直接投入液氮中.样本在液氮中保存14d以上.主要观察指标:进行大体形态和显微形态观察,以了解保存后动脉形态结构的改变;观察动脉的滞后环和应力松弛,测定其断裂强度.结果:两种方法均较好地保存了动脉的结构,玻璃化法保存组完整率为91.67%,低温冷冻法保存组完整率为54.17%(P<0.01):3组动脉均具有滞后环和应力松弛现象,玻璃化法保存组的断裂张力为(2.286 3±0.417 6)N,低温冷冻法保存组的断裂张力为(1.951 0±0.413 0)N,新鲜血管组的断裂张力为(2.543 5±0.5454)N,3组之间的差别无显著性意义(P>0.05).结论:玻璃化法和低温冷冻法对动脉的形态结构和力学性能无显著影响;玻璃化法保存造成的组织断裂较少,适合大段血管的保存.     

重组人血管内皮生长因子165/重组人骨形态发生蛋白2/脱蛋白骨与深低温冷冻骨成骨能力的比较

背景:载体+骨诱导因子+生长因子模式人工骨已被证实是理想的人工骨材料。目的:验证血管内皮生长因子+骨形态发生蛋白与脱蛋白骨复合成重组合人工骨的再血管化及成骨作用,并与深低温冷冻骨比较。方法:新西兰大白兔左前臂制成桡骨15mm骨缺损模型,随机分成2组,实验组植入重组血管内皮生长因子165/重组骨形态发生蛋白2/脱蛋白骨;对照组植入深低温冷冻骨。结果与结论:16周,实验组骨缺损区骨性愈合,移植物密度接近周围正常骨组织;对照组:断端间可见较多骨痂生成,移植物密度稍高于周围正常骨组织。实验组移植物-受体介面无明显分界,达到骨愈合;对照组移植物-受体分界线模糊,部分骨愈合。第3天及第1,2,4,8周,墨汁灌注微血管分析结果显示,实验组血管生成明显多于对照组(P<0.01);生物力学测试结果显示,实验组三点抗弯曲应力负荷明显强于对照组(P<0.01)。结果表明,重组血管内皮生长因子165/重组骨形态发生蛋白2/脱蛋白骨重组合人工骨能诱导断端间骨痂形成,加快移植物的血管化速度,且具有良好的生物学功能及生物力学功能。     

不同方法处理对同种异体皮质骨板移植组织相容性的影响

目的 :探讨深低温冷冻、环氧乙烷和γ射线辐照对同种异体皮质骨板移植组织相容性的影响。方法 :分别移植经过 - 70℃深低温冷冻 4周、 - 70℃深低温冷冻 4周 48℃环氧乙烷灭菌、 - 70℃深低温冷冻 4周 2 5kGyγ射线辐照处理的山羊同种异体皮质骨板 ,对照组移植异体山羊新鲜皮质骨板。检测山羊外周血CD4 、CD8 以及移植骨板周围软组织炎性细胞浸润。结果 :新鲜骨板移植组CD4 明显升高 ,移植骨板周围软组织大量淋巴细胞、浆细胞等炎性细胞浸润 ,CD4 升高以及炎性细胞浸润在术后 6周达到顶峰。除深低温组术后 6周CD4 升高外 ,深低温冷冻、深冻 环氧乙烷及深冻 γ射线辐照组T淋巴细胞亚群无明显改变 ,移植骨板周围软组织少量淋巴细胞等炎性细胞浸润。结论 :新鲜同种异体皮质骨板移植有较强的抗原性 ,诱发宿主较强烈免疫排斥反应 ;深低温冷冻、环氧乙烷和γ射线辐照处理皮质骨板移植宿主不发生免疫排斥反应 ,组织相容性较好。     

鹿脱蛋白松质骨的生物相容性

背景:经过脱蛋白去抗原处理的异种松质骨作为骨移植材料,具有天然的多孔结构、可塑性及一定的机械强度。目的:观察鹿脱蛋白松质骨的生物相容性。方法:①热源实验与急性毒性实验:将鹿新鲜骨、脱蛋白松质骨及深低温冻干脱蛋白松质骨浸提液分别注入家兔耳缘静脉与小鼠腹腔。②溶血实验:将兔血混悬液分别加入鹿新鲜骨、脱蛋白松质骨、深低温冻干脱蛋白松质骨、碳酸钠(阳性对照)、生理盐水(阴性对照)中。③凝血实验:将鹿新鲜骨、脱蛋白松质骨及深低温冻干脱蛋白松质骨分别加入兔正常混合血浆中。④肌袋实验:在小鼠大腿肌袋处分别植入新鲜鹿骨、鹿脱蛋白松质骨及深低温冻干脱蛋白松质骨。结果与结论:鹿脱蛋白松质骨及深低温冻干鹿脱蛋白松质骨无热源反应,未引起毒性、溶血及凝血反应,植入小鼠肌肉内后未发生排斥反应。新鲜鹿骨6种实验有轻度异常,但无动物死亡。表明鹿脱蛋白松质骨及深低温冻干鹿脱蛋白松质骨具有良好的生物相容性。     

骨形态发生蛋白2在骨质疏松症大鼠骨折愈合过程中的表达

目的:骨折愈合过程中,间充质细胞向骨折部位迁徙并分化为软骨细胞及成骨细胞是其中的关键性环节,骨形态发生蛋白2在其中具有重要作用.观察骨形态发生蛋白2在绝经后骨质疏松症大鼠胫骨骨折早期愈合过程中表达的变化,探讨骨质疏松症骨折延迟愈合的原因.方法:实验于2005-08/2006-10在教育部口腔生物医学工程重点实验室完成.①实验材料及分组:64只6个月龄雌性SD大鼠随机分为去势组和对照组,每组32只.②实验过程:去势组行双侧卵巢切除建立Ⅰ型骨质疏松动物模型,对照组切除少量脂肪组织.3个月后造成胫骨骨折.③实验评估:两组于术后7,14,21,28 d麻醉状态下各取大鼠8只,取胫骨周围少量软组织和外骨痂的骨折断端、骨痂、骨皮质及骨髓腔的全层标本,分别进行组织学、免疫组织化学,半定量反转录-聚合酶链反应方法检测.结果:①组织学观察结果:显示骨折处膜内成骨和软骨成骨两种方式,术后第21天及28天时去势组骨痂中仍可见大量软骨细胞.②免疫组织化学结果:术后第7天及14天对照组骨形态发生蛋白2平均吸光度值大(阳性细胞计数高)于去势组,而在术后第21天低于去势组.③反转录-聚合酶链反应结果:术后第7天对照组骨形态发生蛋白2条带强度高于去势组,而在第14天弱于去势组.结论:骨形态发生蛋白2在骨折早期骨痂形成中具有重要作用,骨质疏松症骨折愈合早期骨形态发生蛋白2的表达量减少且延迟,可能是其愈合延迟的重要影响因素.     

骨形态发生蛋白在大段同种异体骨移植中的表达

目的:通过动物实验来探讨骨形态发生蛋白在大段同种异体骨移植愈合中的表达及其意义。方法:实验于2005-10/2006-01在南京军区总院动物实验中心完成。①24只新西兰大白兔随机分为实验组和对照组各12只。实验组,手术移植用梯度降温深低温保存的同种异体兔股骨半髁植入,以金属螺钉固定;对照组将取下的自体股骨半髁原位植入,用与实验组相同的内固定方法固定。②术后4,8,12周取标本行大体标本观察,苏木精-伊红及骨形态发生蛋白免疫组织化学染色,观察骨形态发生蛋白在大段同种异体骨愈合过程的表达情况。结果:24只兔均进入结果分析。①两组移植骨段大体观察:第12周,实验组与对照组移植骨段已与宿主完全连接成一整体,外周骨痂已塑形。②两组自体骨与异体骨苏木精-伊红染色结果:第12周,实验组自体骨与异体骨间见较多成熟骨小梁,自体骨与异体骨连接处髓腔基本融合,于异体骨外侧新形成皮质骨结构。对照组已形成新皮质结构,有大量成熟的骨小梁结构,髓腔基本融合。③骨形态发生蛋白免疫组织化学染色结果:第4周:实验组皮质骨外周见较强的骨形态发生蛋白表达,阳性染色主要位于不成熟的骨细胞、成骨细胞、软骨细胞的胞浆及其分泌的基质中,表明骨形态发生蛋白通过“旁分泌”和“自分泌”的形式使得间质细胞分化为软骨细胞和骨细胞。对照组骨折断端两侧均有骨形态发生蛋白表达。第8周:异体皮质骨周围的骨痂中可见阳性表达,新形成的管状结构中呈“镶边”样排列的成骨细胞为阳性表达,其周围尚有一些软骨细胞核阳性表达。对照组与实验组相似,新生血管和新骨生成较实验组为多。第12周:实验组及对照组骨形态发生蛋白表达均较少。深低温保存的同种异体骨移植过程中骨形态发生蛋白表达与自体骨相似。骨形态发生蛋白染色在新生骨及其周围类基质表达阳性。结论:①骨形态发生蛋白在同种异体骨移植愈合早期起重要作用,其通过“旁分泌”和“自分泌”的形式使得间质细胞分化为软骨细胞和骨细胞,从而促使新骨形成。②大段同种异体骨移植愈合早期(4周)过程中骨诱导与骨吸收同时存在时,骨形态发生蛋白发生重要作用。     

腺病毒介导骨形态发生蛋白2基因转染诱导脂肪间充质干细胞向成骨细胞的定向分化

背景:在众多的骨生长因子中,骨形态发生蛋白2具有最著促进骨缺损修复和骨折愈合的效果.骨修复是一个阶段性过程,不需要转染的目的基因长久表达,因此利用腺病毒载体将目的基因导入脂肪间充质干细胞来促进骨愈合比较理想.目的:观察腺病毒介导的骨形态发生蛋白2基因转染后大鼠脂肪间充质干细胞的分化情况.设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2008-01/10在北京大学第三医院中心实验室完成.材料:清洁级3周龄雄性Lewis大鼠24只,由北京大学实验动物学部提供.腺病毒载体Ad-BMP2、Ad-GFP由靳小兵博士构建扩增.方法:胶原酶消化法分离培养大鼠脂肪间充质干细胞,传至第3代分为Ad-BMP2转染组、Ad-GFP转染组和未转染组.各转染组分别向培养液中加入对应的腺病毒液,转染复数MOI=100.主要观察指标:转染后脂肪间充质干细胞碱性磷酸酶活性,von Kossa染色结果,Western blotting法检测骨桥蛋白和骨形态发生蛋白2的表达.结果:与未转染组比较,转染后7,14,21d Ad-GFP转染组细胞碱性磷酸酶活性无明显变化;Ad-BMP2转染组细胞碱性磷酸酶活性明最增高(P<0.01),且随时间延长碱性磷酸酶活性增加更为显著.Ad-BMP2转染组von Kossa染色出现黑色钙结节,免疫细胞化学染色结果示胞浆内有大量黄染颗粒,骨桥蛋白、骨形态发生蛋白2均呈明显强阳性表达.Westernblotting检测结果显示Ad-BMP2转染组脂肪间充质干细胞骨桥蛋白、骨形态发生蛋白2表达水平增高,Ad-GFP转染组中未检测到骨桥蛋白、骨形态发生蛋白2的表达.结论:大鼠脂肪间充质干细胞经腺病毒介导的骨形态发生蛋白2基因转染后,可定向分化为成骨细胞.     

玻璃化法和低温冷冻法保存兔股动脉活性的差异

背景：异体血管保存常用的低温冷冻法会不可避免地形成大量冰晶,因此所保存的血管活性有限。玻璃化法可避免冰晶所造成的挤压损伤和冻融效应,尤其适合于活性组织的保存。目的：比较玻璃化法和低温冷冻法保存兔股动脉组织结构和收缩舒张能力的差异。设计、时间及地点：组织形态学及力学水平的随机对照实验,于2002-09/2006-08在解放军总医院骨科研究所完成。材料：纳入新西兰兔18只,按随机数字法分为3组,玻璃化法保存组、低温冷冻法保存组及新鲜血管组各6只,每组取12条股动脉。方法：切取股动脉标本,置于平衡液中备用。玻璃化法保存组血管在4℃条件下经25%,50%和100%梯度玻璃化溶液浸泡后,直接投入液氮中。低温冷冻法保存组血管由常温状态下,经过0,-20,-70℃梯度降温,平衡60min,直接投入液氮中。将新鲜动脉作为对照,样本在液氮中保存14d以上。主要观察指标：对动脉组织进行细胞培养和鉴定,测定动脉环张力随去甲肾上腺素和硝普钠剂量的变化。结果：3组动脉培养均为平滑肌细胞,玻璃化法保存组生长速度与新鲜血管组相近,而优于低温冷冻法保存组。玻璃化法保存组与新鲜血管组动脉环最大收缩力差异无显著性意义（P〉0.05）,玻璃化法保存组、新鲜血管组动脉环最大收缩力显著大于低温冷冻法保存组（P〈0.01）。当去甲肾上腺素剂量为10-6mol/L时,动脉开始明显收缩;当去甲肾上腺素剂量为10-4mol/L时,动脉收缩力达到最大。玻璃化法保存组、低温冷冻法保存组及新鲜血管组动脉环最大舒张程度差异无显著性意义（P〉0.05）。当硝普钠剂量为10-7mol/L时,动脉开始产生明显的舒张反应;当硝普钠剂量为10-4mol/L时,动脉基本达到最大舒张程度。结论：玻璃化法保存的动脉较低温冷冻法具有更多的活性平滑肌细胞,尽管玻璃化法保存的动脉在对去甲肾上腺素的收缩能力方面优于低温冷冻法保存的动脉,但是对硝普钠的舒张能力上二者之间没有差别。     

Impact of freezing on bone graft incorporation biomechanical evaluations in rats

Background

With an increasing clinical application of grafting for bone reconstruction, it is important to understand the physiological and biological events of graft incorporation. In this study, we have investigated the impact of deep freezing on the biopotency for incorporation of bone grafts.

Methods

Fresh and deep-frozen autogenous bone grafts were implanted in an 8-mm segmental defect in the tibia. The construct was stabilized with intramedullary nailing. Incorporation of the graft was assessed with use of conventional radiography, biomechanical testing and measurements of bone mineral content and density after 2 and 4 months, respectively.

Findings

Frozen grafts were significantly less integrated after 2 months as compared to fresh grafts. After 4 months, however, the frozen grafts showed an overall reconstruction that was not significantly different from the fresh grafts. Both frozen and fresh grafted segments had only reached 70% strength of intact bone at 4 months.

Interpretation

This study indicates that in the long run there are no significant consequences, radiologically or biomechanically, of deep freezing as compared to fresh bone grafts.     

冻存血浆中microRNAs稳定性研究

目的探讨不同冻存时间血浆microRNAs表达水平及血浆总RNA提取并冻存2周后microRNAs表达水平的稳定性。方法 -80℃冻存2a,1a及6个月和新鲜抽取的健康人血浆样本各10份,提取血浆总RNA,应用基于TaqMan探针的MicroRNA定量检测法检测血浆样本中4种microRNAs表达水平。结果冻存6个月人血浆样本中U6与新鲜血浆标本比较差异有统计学意义(P<0.05),冻存2a,1a及6个月人血浆样本中4种microRNAs表达水平与新鲜血浆标本比较差异无统计学意义(P>0.05);新鲜血浆RNA提取并冻存2周后2个目的microRNAs相对表达水平与提取后即刻比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 -80℃下冻存2a内血浆中microRNAs稳定存在,血浆总RNA提取并冻存2周后仍可用于microRNAs的定量检测。     

恒强旋转磁场对骨折愈合过程中骨形态蛋白-2和血小板源性生长因子表达的影响

目的观察恒强旋转磁场对骨折愈合过程中骨形态蛋白-2(BMP-2)和血小板源性生长因子(PDGFs)在骨折部位不同时间表达的变化,探讨恒强旋转磁场促进骨折愈合的机制。 方法将80只建立股骨闭合性骨折模型的Sprague Dawley（SD）大鼠按随机数字表法分为磁场干预组和对照组,每组40只。磁场干预组大鼠置于0.4T恒强旋转磁场(浙江康尔医疗器械公司)中,磁体旋转频率6Hz,每日磁场干预1次,每次连续30min,每周6次;对照组未做任何干预处理。分别于骨折后2、3、4和8周四个观察时间点（每个时间点10只大鼠）,观察各组大鼠骨折部位BMP-2、PDGF-A和PDGF-B免疫组化染色阳性表达,并采用Nikon显微成像分析仪（Nikon 50i,日本）拍照（图像放大400倍）,用生物图像分析处理软件测量阳性染色区域的积分光密度值(IOD)。采用双因素方差分析比较时间、磁场的主效应及二者的交互效应。 结果①不同时间点各组大鼠骨折部位BMP-2阳性表达的IOD值比较,差异有统计学意义（F=21.58,P<0.01）,多重比较显示,BMP-2阳性染色区域在骨折后2、3和4周时的IOD值均明显高于骨折后8周（P<0.01）,骨折后4周的IOD值亦明显高于骨折后2周（P<0.01）;磁场干预与时间存在有交互作用（F=3.17;P<0.05）。②磁场干预组与对照组大鼠不同时间点间骨折部位的PDGF-A阳性表达IOD比较,差异有统计学意义（F=28.16,P<0.01）,多重比较显示,骨折后2周骨折部位PDGF-A的阳性表达的IOD值显著高于骨折后3周（P<0.01)、4周（P<0.01)和8周（P<0.01),骨折后3周和4周PDGF-A的阳性表达IOD也显著高于骨折后8周(P<0.01)。③磁场干预组骨折部位的PDGF-B阳性表达IOD值明显高于对照组［磁场干预组（57.6±2.1） vs 对照组（50.11±2.22）］,差异有统计学意义（F=5.98,P<0.05）;且不同时间点骨折部位PDGF-B阳性表达IOD值比较,差异亦有统计学意义（F=50.06,P<0.01）,多重比较显示,骨折后3周骨折部位PDGF-B阳性表达IOD值显著高于骨折后2周（P<0.05）、4周（P<0.01）和8周（P<0.01）,骨折后2周和4周阳性表达IOD值亦显著高于骨折后8周（P<0.01）。 结论恒强旋转磁场可能通过调节骨折部位BMP-2和PDGF-B的表达,促进骨折的修复。     

去抗原牛松质骨支架复合骨形态发生蛋白2基因在骨缺损修复过程中的血管化反应

背景：体外构建的组织工程骨是细胞与材料的复合体，再血管化是组织工程骨植入体内后关系其能否充分发挥成骨作用，有效修复骨缺损的关键环节。 目的：观察以去抗原牛松质骨支架复合骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein2，BMP-2）基因修复大段骨缺损过程中对血管化的影响。 设计、时间及地点：随机分组设计、对照动物实验，于2003—09／2004—12在吉林大学中日联谊医院中心实验室完成。 材料：选用清洁级新西兰大耳白兔60只。选取市售新鲜牛肱骨上端松质骨制备去抗原牛松质骨支架（Bovine Cancellous Bone，BCB）。携带人BMP-2和β-半乳糖酐酶基因的重组腺病毒（Ad-BMP-2和Ad—Lacz）及重组人BMP-2（rh-BMP-2）由美国Dr．Oliver及吉林大学病理教研室高航博士馈赠。 方法：新西兰大耳白兔60只分离培养兔骨髓基质干细胞，经BMP-2腺病毒载体转染后复合BCB移植修复兔双上肢桡骨1．5cm的缺损。按随机数字表法分为5组，每组12只，植入经不同处理的人工骨，Ad—BMP-2转染细胞＋BCB组，未转染细胞＋rh-BMP-2＋BCB组，Ad-Lacz转染细胞＋BCB组，未转染细胞＋BCB组，单纯BCB组。通过紧密缝合肌膜和筋膜固定移植骨。 主要观察指标：术后4，8，12周X射线检查观察骨缺损区的新骨形成情况，微血管墨汁灌注观察血管分布情况，透射电镜观察成骨细胞和血管生成情况，苏木精一伊红染色、爱辛蓝染色和VonKossa染色观察微血管与骨形成关系，血管内皮生长因子免疫组织化学染色测定染色灰度值、CD34免疫组织化学染色特异性标记血管内皮细胞，进行微血管计数。 结果：纳入兔60只均进入结果分析。X射线检查和组织学观察显示AD-BMP-2转染细胞＋BCB组和未转染细胞＋rh—BMP-2＋BCB组骨形成及血管生成情况优于其他3组。微血管墨汁灌注显示术后4周，两组每一个骨小梁孔隙中有一支新形成的小血管，骨间血管的密度在周边区域较高，随着向移植骨中央呈向心性减少。透射电镜观察，两组术后4周，可见较多功能活跃的成骨细胞及新生血管芽；术后12周，成熟的板层骨形成，新生血管结构完好。血管内皮生长因子表达检测和微血管计数测定显示AD—BMP-2转染细胞＋BCB组血管内皮生长因子相对含量明显高于其他各组，差异有显著性意义（P〈0．01）。微血管计数明显高于其他各组，差异有显著性意义（P〈0．01）。 结论：BMP-2基因可通过上调血管内皮生长因子表达，间接诱导移植骨血管化，比应用rh—BMP-2更有优势。     

Biomechanical strength of deep-frozen versus lyophilized large cortical allografts

OBJECTIVE: To compare biomechanical strength of deep-frozen versus lyophilized large cortical allografts. DESIGN: In vivo transplantation studies performed in tibia of adult cats using 4 cm deep-frozen and lyophilized, gamma-irradiated allografts to bridge large cortical defect model. BACKGROUND: Bridging large cortical bone defect is a challenging problem. Options include autografts, allografts, bioceramics and prostheses. Allografts provide a suitable option. METHODS: Forty mature cats were used. A large defect (4 cm) was created in mid-diaphysis of right tibia. In 16 cats, cortical defect was reconstructed using deep-frozen allografts (-80 degrees C) with intra-medullary rodding. In another 16 cats, lyophilized, gamma-irradiated allografts were used. Observation periods include 8, 12, 16 and 24 weeks. The specimens were procured together with unoperated legs as controls. Mechanical testing was performed using a materials testing machine with torsion test device of up to 500 Nm at speed of 0.18 rpm. Parameters studied included maximum torque, torsional stiffness and energy of absorption. RESULTS: Deep-frozen allografts did not reach 100% strength, achieving only 64% at 6 months. In marked contrast, lyophilized allografts were significantly weaker with only 12% maximum torque strength at 6 months. Lyophilized allografts were significantly weaker than deep-frozen allografts in all observation periods (p < 0.05). CONCLUSION: Deep-frozen allografts did not reach 100% normal strength and were significantly weaker than non-vascularised autografts. Lyophilized allografts were significantly weaker than deep-frozen allografts. RELEVANCE: For the reconstruction of massive cortical bone defects, only deep-frozen cortical allografts should be used. Lyophilized allografts are not suitable.     

Selective inhibitors of the osteoblast proteasome stimulate bone formation in vivo and in vitro

We have found that the ubiquitin-proteasome pathway exerts exquisite control of osteoblast differentiation and bone formation in vitro and in vivo in rodents. Structurally different inhibitors that bind to specific catalytic beta subunits of the 20S proteasome stimulated bone formation in bone organ cultures in concentrations as low as 10 nM. When administered systemically to mice, the proteasome inhibitors epoxomicin and proteasome inhibitor-1 increased bone volume and bone formation rates over 70% after only 5 days of treatment. Since the ubiquitin-proteasome pathway has been shown to modulate expression of the Drosophila homologue of the bone morphogenetic protein-2 and -4 (BMP-2 and BMP-4) genes, we examined the effects of noggin, an endogenous inhibitor of BMP-2 and BMP-4 on bone formation stimulated by these compounds and found that it was abrogated. These compounds increased BMP-2 but not BMP-4 or BMP-6 mRNA expression in osteoblastic cells, suggesting that BMP-2 was responsible for the observed bone formation that was inhibited by noggin. We show proteasome inhibitors regulate BMP-2 gene expression at least in part through inhibiting the proteolytic processing of Gli3 protein. Our results suggest that the ubiquitin-proteasome machinery regulates osteoblast differentiation and bone formation and that inhibition of specific components of this system may be useful therapeutically in common diseases of bone loss.     

钙磷涂层镁合金植入体周围组织中骨形成蛋白2的表达

背景:改变合金构成可以改善镁合金的耐腐蚀性和机械性能。目的:观察钙磷涂层对镁合金植入体周围软组织中骨形成蛋白2表达的影响。方法:将27只兔随机分成3组,分别在兔下颌骨内植入钙磷涂层镁合金螺钉、镁合金螺钉及钛合金,植入后1,2,3个月,采用反转录聚合酶链技术检测植入体周围软组织中骨形成蛋白2mRNA的表达情况。结果与结论:钙磷涂层镁合金螺钉组、镁合金螺钉组周围软组织中骨形成蛋白2mRNA的表达,随时间的增加逐渐增高,钙磷涂层镁合金螺钉组内各时间点间骨形成蛋白2mRNA的表达水平差异有显著性意义(P<0.05),且镁合金螺钉组植入后1,2个月周围软组织中骨形成蛋白2mRNA的表达水平高于钙磷涂层镁合金螺钉组(P<0.05)。显示钙磷涂层能够促进骨形成蛋白2mRNA的表达,并抑制其过度表达,有利于早期成骨过程,表现出良好的生物活性。     

骨髓基质干细胞成骨分化过程中Wnt、骨形态发生蛋白2信号通路相关因子与辛伐他汀的作用

背景：辛伐他汀可促进体外培养的人或鼠骨髓基质干细胞向成骨细胞分化,但作用机制尚不清楚。目的：观察辛伐他汀对大鼠骨髓基质干细胞向成骨细胞分化过程中Wnt与骨形态发生蛋白2信号途径中相关因子表达的影响。方法：取6周龄雌性SD大鼠双侧股骨、胫骨全骨髓进行体外成骨细胞诱导培养。实验分为对照组及SIM组。SIM组加入浓度为10-7mol/L辛伐他汀,对照组加入等量无水乙醇和PBS。培养14d,行碱性磷酸酶染色,28d时,行vonKossa染色观察细胞外基质矿化情况;培养14,21d,免疫荧光细胞化学染色观察成骨细胞中β-catenin,Smad1/5,Cbfa1的表达及分布。结果与结论：大鼠骨髓基质干细胞经体外诱导后可分化为具有碱性磷酸酶活性和矿化细胞外基质能力的成熟成骨细胞。辛伐他汀可显著上调骨髓基质干细胞成骨分化过程中碱性磷酸酶的表达。同时,与对照组比较,SIM组β-catenin,Smad1/5,Cbfa1表达明显增多（P〈0.05）,且呈现明显的核内聚集趋势。说明辛伐他汀促进骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的作用可能与调控Wnt与骨形态发生蛋白2信号通路中相关因子的表达及细胞内分布有关。     

In vivo endochondral bone formation using a bone morphogenetic protein 2 adenoviral vector.

Bone morphogenetic proteins (BMPs) are polypeptides that induce ectopic bone formation in standard rat in vivo assay systems. Previous studies have demonstrated the clinical utility of these proteins in spinal fusion, fracture healing, and prosthetic joint stabilization. Gene therapy is also a theoretically attractive technique to express BMPs clinically, since long-term, regulatable gene expression and systemic delivery with tissue-specific expression may be possible in future. This study was performed to determine whether an adenoviral vector containing the BMP-2 gene can be used to express BMP-2 in vitro and promote endochondral bone formation in vivo. In vitro, U87 MG cells transduced per cell with 20 MOI of an adenoviral construct containing the BMP-2 gene under the control of the universal CMV promoter (Ad-BMP-2) showed positive antibody staining for the BMP-2 protein at posttransfection day 2. The synthesis and secretion of active BMP-2 into the conditioned medium of Ad-BMP-2-transduced 293 cells were confirmed by Western blot analysis and the induction of alkaline phosphatase activity in a W-20 stromal cell assay. In vivo, Sprague-Dawley rats and athymic nude rats were injected with Ad-BMP-2 in the thigh musculature and were sacrificed on day 3, 6, 9, 12, 16, 21, 60, and 110 for histological analysis. The Sprague-Dawley rats showed evidence of acute inflammation, without ectopic bone formation, at the injection sites. In the athymic nude rats, BMP-2 gene therapy induced mesenchymal stem cell chemotaxis and proliferation, with subsequent differentiation to chondrocytes. The chondrocytes secreted a cartilaginous matrix, which then mineralized and was replaced by mature bone. This study demonstrates that a BMP-2 adenoviral vector can be utilized to produce BMP-2 by striated muscle cells in athymic nude rats, leading to endochondral bone formation. However, in immunocompetent animals the endochondral response is attenuated, secondary to the massive immune response elicited by the first-generation adenoviral construct.