金黄色葡萄球菌肠毒素A基因的克隆及原核表达

目的从分离培养的金黄色葡萄球菌中提取肠毒素A(SEA)基因,亚克隆入表达载体pET-28a(+),诱导融合蛋白的表达,为肠毒素A应用研究奠定基础。方法根据GenBank中SEA的序列,设计一对特异性引物,以金黄色葡萄球菌DNA为模板PCR扩增SEA,纯化DNA进行BamHⅠ、XholⅠ双酶切鉴定及测序鉴定,并与做相应酶切的pET-28a(+)连接,转化大肠杆菌BL21,并对质粒进行双酶切鉴定及基因序列分析,用IPTG诱导融合蛋白的表达,His标签单克隆抗体进行免疫印迹验证融合蛋白的表达。结果以金黄色葡萄球菌DNA为模板,成功扩增了SEA基因,基因大小为774bp,重组PET-28a(+)-SEA双酶切鉴定可见目的片段,测序结果显示SEA在正确读框中,序列比对分析显示其与相关报道核苷酸序列一致性达99.9%。经IPTG诱导后,SDS-PAGE可见pET-28a(+)-SEA/BL21在相应分子量(约30000Mr)条带大量表达,免疫印迹能检测到目的蛋白条带,说明其与His标签融合表达。结论克隆了金黄色葡萄球菌SEA基因,并成功在大肠杆菌BL21中融合表达,为肠毒素A应用研究奠定了基础。     

超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A基因克隆与鉴定

目的克隆金黄色葡萄球菌肠毒素A（SEA）全长基因并构建其表达载体。方法采用PCR技术,从产SEA的葡萄球菌标准菌株ATCC13565基因组DNA中获得SEA全长序列共771bp,克隆入pUC57载体中,进行酶切及测序鉴定。结果克隆了SEA全长基因,经测序证实与Genbank中收录的SEA基因序列完全一致。结论本研究成功地克隆了SEA全长基因,为进一步研究SEA基因的靶向抗肿瘤研究奠定了实验基础。     

金黄色葡萄球菌肠毒素A（SEA）多克隆抗体的制备及鉴定

目的：制备金黄色葡萄球菌肠毒素A（SEA）多克隆抗体并用金黄色葡萄球菌野生株对其进行验证,为进一步研究SEA在金黄色葡萄球菌致病机制中的作用提供基础。方法：PCR方法扩增肠毒素A基因（sea）,构建原核表达载体p ET 30 a/sea,经PCR方法和测序鉴定后,阳性表达载体转化大肠杆菌表达宿主菌DH 5α,表达产物用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹法（Western Bloting,WB）分析鉴定。蛋白经纯化后作为免疫原免疫新西兰大白兔,得到抗血清并纯化,采用sea基因阳性的金黄色葡萄球菌野生株S8和S 23株的菌体蛋白进行鉴定。结果：pET 30 a/sea重组表达载体构建成功,目的蛋白在构建的原核表达系统中可实现高表达,纯化后得到高纯度的SEA蛋白,经临床分离金黄色葡萄球菌S 8和S 23株菌体蛋白验证,证实得到理想的兔抗SEA多克隆抗体。结论：通过基因重组技术,金黄色葡萄球菌SEA蛋白在构建的原核表达系统中得以成功表达,并获得了高纯度的目的蛋白及其多克隆抗体,为进一步研究金黄色葡萄球菌肠毒素A蛋白的生物学活性及抗体的保护作用奠定了基础。     

金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA) 多克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备金黄色葡萄球菌肠毒素A( SEA) 多克隆抗体并用金黄色葡萄球菌野生株对其进行验证,
为进一步研究SEA 在金黄色葡萄球菌致病机制中的作用提供基础。方法: PCＲ 方法扩增肠毒素A 基因( sea) ,
构建原核表达载体pET 30 a /sea,经PCＲ 方法和测序鉴定后,阳性表达载体转化大肠杆菌表达宿主菌DH 5α,表
达产物用十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳( SDS－PAGE) 和蛋白质印迹法( Western Bloting,WB) 分析鉴定。
蛋白经纯化后作为免疫原免疫新西兰大白兔,得到抗血清并纯化,采用sea 基因阳性的金黄色葡萄球菌野生株S
8 和S 23 株的菌体蛋白进行鉴定。结果: pET 30 a /sea 重组表达载体构建成功,目的蛋白在构建的原核表达系统
中可实现高表达,纯化后得到高纯度的SEA 蛋白,经临床分离金黄色葡萄球菌S 8 和S 23 株菌体蛋白验证,证实
得到理想的兔抗SEA 多克隆抗体。结论:通过基因重组技术,金黄色葡萄球菌SEA 蛋白在构建的原核表达系统
中得以成功表达,并获得了高纯度的目的蛋白及其多克隆抗体,为进一步研究金黄色葡萄球菌肠毒素A 蛋白的
生物学活性及抗体的保护作用奠定了基础。     

金黄色葡萄球菌肠毒素基因定位研究

对40株产1种或1种以上肠毒素的金黄色葡萄球菌（以下简称金葡菌）进行分析，结果全部金葡菌肠毒素A（SEA，12/12）、金葡菌肠毒素C（SEC，19／19）、大部分金葡菌肠毒素B（SEB，23／28）的产生不因质粒的消除而消失，说明SEA、SEC的基因位点在染色体上。有5株金葡菌因质粒消除而失去产SEB的能力，其基因位点，可能在质粒或染色体上。4株金葡菌亦均因质粒消除失去产金葡菌肠毒素D的能力，其基因位点可能在质粒上。     

PCR技术检测金黄色葡萄球菌A型肠毒素基因的实验研究

目的建立一种检测金黄色葡萄球菌A型肠毒素的PCR方法，以期用于葡萄球菌肠毒素食物中毒的诊断。方法根据文献报道选择金葡菌SEA基因中比较保守的片段设计引物，优化各种工作条件，建立PCR检测方法，并鉴定其敏感性和特异性以及抗杂菌干扰性。扩增片段应用限制性核酸内切酶RsAI消化进行分析。结果所建立的方法敏感性和特异性均较好，有较强的抗杂菌干扰能力。结论应用PCR法检测SEA基因为SEA基因的诊断提供了病因学基础。     

金黄色葡萄球菌临床分离株肠毒素基因的检测

[摘要]目的 检测临床分离的金黄色葡萄球菌肠毒素基因,了解肠毒素基因的携带情况。方法 根据Genbank的序列设计合成金黄色葡萄球菌肠毒素基因A-F的引物,采用聚合酶链反应方法对随机收集的124株金黄色葡萄球菌肠毒素基因进行检测,并进行序列分析。结果 在124株受检的金黄色葡萄球菌中,116株检出肠毒素基因,检出率为93.5%,其中SEA、SEB、SEC、SED和SEF的检出率分别为90.5%、6.9%、61.3%、5.2%和25.9%,未检测出SEE基因。同时检出2种及2种以上的肠毒素基因的菌株有78株（67.2%）,以携带SEA+SEC、SEA+SEF和SEA+SEC+SEF基因为主,检出率分别为33.6%,7.8%,13.8%。序列分析显示所检出的肠毒素基因与Genbank上登陆的参考序列的同源性为97%～100%。结论 金黄色葡萄球菌临床分离株肠毒素基因携带率高,其中以携带SEA、SEC、SEF基因为主。     

金黄色葡萄球菌临床分离株肠毒素基因的调查分析

摘要：目的检测临床分离的金黄色葡萄球菌（SA）肠毒素基因,了解肠毒素基因的携带情况与SA耐药的关系。方法采用聚合
酶链反应检测SA mecA基因和肠毒素基因,了解肠毒素基因在SA中分布的状况,并对其进行耐药性分析。结果67株甲氧西
林耐药的SA（MRSA）和57株甲氧西林敏感的SA（MSSA）肠毒素基因携带率（100% vs 83.5%）无明显差异（χ2=0.203,P>0.05）。
肠毒素基因检出率为93.5%（116株）,其中SEA、SEB、SEC、SED和SEF的检出率分别为90.5%、6.9%、61.3%、5.2%和25.9%,未
检测出SEE基因。同时检出2种及2种以上的肠毒素基因的菌株有78株（67.2%）,以携带SEA+SEC、SEA+SEF和SEA+SEC+
SEF基因为主,检出率分别为33.6%、7.8%和13.8%。与携带一种肠毒素基因的菌株耐药率相比,携带多种肠毒素基因的菌株耐
药率呈上升趋势,其中携带SEA+SEC+SEF的菌株对复方新诺明的耐药率为75.0%,高于单独携带SEA（28.6%）、SEA+SEC
（38.7%）的耐药率,具有统计学差异（P<0.05）。携带SEA+SEC+SEF、SEA+SEF、SEA的菌株对阿米卡星耐药率分别为75.0%、
77.0%和21.5%,前两者与携带SEA的菌株相比有显著差异（P<0.05）。结论临床分离的SA中携带多种肠毒素基因的菌株在耐
药率上高于只携带一种肠毒素基因的菌株,提示肠毒素在SA耐药中起重要作用。
     

慢性鼻-鼻窦炎中金黄色葡萄球菌肠毒素基因研究

目的检测国人慢性鼻-鼻窦炎患者鼻腔金黄色葡萄球菌肠毒素基因谱,探讨与国人慢性鼻-鼻窦炎发病相关的金黄色葡萄球菌肠毒素基因类型。方法本实验取国人慢性鼻-鼻窦炎不伴鼻息肉组、慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉组及鼻中隔偏曲组患者中鼻道黏膜拭子进行金黄色葡萄球菌分离培养鉴定,通过PCR技术检测实验组每例患者金黄色葡萄球菌样本18种肠毒素基因的携带情况,并进行统计学分析。结果 3组患者金黄色葡萄球菌肠毒素基因均有较高的阳性检出率,但差异无统计学意义;3组患者阳性检出例数均较高的几种肠毒素基因为:seg、sem、sen、sei、seo、seu;金黄色葡萄球菌肠毒素基因seq在慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉患者中有16例阳性检出,而对照组无阳性检出,差异有统计学意义。结论金黄色葡萄球菌肠毒素seg、sem、sen、sei、seo、seu可能在慢性鼻-鼻窦炎的发病中起主要作用,肠毒素seq与慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉发病的关系还有待进一步深入研究。     

临床标本金黄色葡萄球菌肠毒素基因分布及耐药性

目的 了解临床分离的金黄色葡萄球菌肠毒素基因分布及耐药情况。 方法 对金黄色葡萄球菌进行分离鉴定。采用聚合酶链反应检测肠毒素基因 (SEA~SEE),采用K-B法进行药敏试验。 结果 共收集到138株金黄色葡萄球菌,其中74株分离自痰液标本,占53.62%;从年龄≥50岁患者中分离得到102株菌株,占73.91%;金黄色葡萄球菌中肠毒素阳性为120株,检出率为86.96%,SEA、SEB、SEC和SEE阳性率分别为63.33%、46.67%、45.00%和37.50%,未检测出SED基因,分离自痰液标本菌株以携带SEA和SEC为主,而分离自创面分泌物菌株则以携带SEB和SEE为主;药敏 结果 显示金黄色葡萄球菌对青霉素（96.67%）、红霉素（81.67%）、氯霉素（74.17%）、四环素（71.67%）耐药较为严重,对呋喃妥因（6.67%）、复方磺胺甲恶唑（16.67%）、阿莫西林/克拉维酸钾（4.17%）则比较敏感,所有菌株对万古霉素、替考拉宁均敏感。 结论 临床分离的金黄色葡萄球菌肠毒素基因携带率较高;不同标本来源的金黄色葡萄球菌携带肠毒素基因型存在差异,对于临床金黄色葡萄球菌的感染治疗应根据药敏结果选择合理的抗生素。     

PCR法检测葡萄球菌肠毒素A基因

目的 建立PCR方法快速检测葡萄球菌肠毒素A(Staphylococcal enterotoxin A,SEA)基因.方法 根据SEA基因的序列,设计PCR引物特异性扩增靶基因片段,对1株产SEA金黄色葡萄球菌和9株对照菌株进行PCR检测,评价其特异性和敏感性.另检测30株金黄色葡萄球菌SEA基因的携带情况.结果 建立PCR方法快速检测SEA基因,扩增产物长度为439bp.PCR反应体系中有29cfu的产SEA金黄色葡萄球菌即可检出SEA基因,30株分离的金黄色葡萄球菌中有10株携带有SEA基因.结论 PCR法可以快速、敏感地检测SEA基因,为金黄色葡萄球菌食物中毒诊断提供依据.     

金黄色葡萄球菌SEB基因的克隆及其系统发生分析

目的克隆和测定金黄色葡萄球菌深圳分离株S4070肠毒素B（SEB）基因序列,并作系统发生分析。方法采用PCR法从金黄色葡萄球菌S4070基因组中扩增出SEB基因片段,纯化后与pMD-18T载体连接构建重组子pMD-18T-SEB,并转化E.coli DH5α;阳性克隆质粒经双酶切法鉴定后,采用双脱氧末端终止法作序列测定,并以BLAST和MEGA4软件分析其分子特征。结果从金黄色葡萄球菌基因组DNA中扩增出约704bp的基因片段,阳性克隆质粒鉴定结果与预期一致;序列测定结果显示,所克隆的SEB基因片段含704个碱基,与GenBank中17株金黄色葡萄球菌SEB基因序列比对,无碱基的插入或缺失,同源性均为98%以上;基于SEB基因序列,采用邻位连接法（Neigh bor-joining）构建系统发生树,深圳S4070株与日本分离株NN35、NN37、NN41-F1D、NN41-F1F和NN41-F1G以及印度分离株DQ535901、DQ535902的遗传距离小,同处在一个分支群上。结论实验成功克隆了金葡菌深圳株S4070 SEB基因,不同分离株间SEB基因序列相对保守,本分离株与日本和印度分离株遗传关系较近。     

一起金黄色葡萄球菌肠毒素致食物中毒的病原学鉴定

目的对一起餐厅食物中毒事件进行可疑病原菌及其毒素的分离鉴定。方法参照《食品微生物学检验沙门氏菌检验》GB 4789.4-2016、《食品微生物学检验志贺氏菌检验》GB 4789.5-2012、《食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》GB 4789.10-2016、《食品微生物学检验副溶血性弧菌检验》GB 4789.7-2013,分别对剩余食品、餐具涂抹液、病人肛拭标本进行病原学及毒素检测。结果在5份食品及3份肛拭标本中分别有1份培根和1份肛拭中检出金黄色葡萄球菌及肠毒素。结论金黄色葡萄球菌易引起毒素型食物中毒,可通过餐饮行业、食品监管部门、疾控部门的密切配合,减少食物中毒的发生。     

食源性金黄色葡萄球菌肠毒素及耐药性分析

目的了解乌鲁木齐市日常食品中分离出的金黄色葡萄球菌的肠毒素分布情况以及耐药性特征。方法金黄色葡萄球菌的分离以及肠毒素的鉴定依据国标GB 4789.10-2010《食品卫生微生物检验金黄色葡萄球菌检验》进行,利用法国梅里埃全自动微生物生化鉴定系统(VITEK2–compact)对菌株进行生化鉴定和药敏试验。同时对分离出的阳性菌株进行肠毒素测定及分型。结果 2013-2014年检测乌鲁木齐市日常食品样品6类823份,检测出38株金黄色葡萄球菌。通过对金黄色葡萄球菌肠毒素分型,共有12株产生肠毒素,携带率为31.6%。对阳性菌株进行耐药性分析,其中对万古霉素和头孢噻肟敏感,敏感率为100.0%;对青霉素的耐药程度较高,耐药率为71.1%;对诺氟沙星、氧氟沙星、甲氧苄啶敏感性较高,对其他几种抗生素都有不同程度的耐药。结论乌鲁木齐市食品中存在金黄色葡萄球菌潜在的危害,主要来源于肉制品;金黄色葡萄球菌的产毒能力较强,且耐药性较强,应合理用药。     

金黄色葡萄球菌肠毒素及其检测方法的研究进展

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种人畜共患病的重要致病菌，该菌在自然界广泛存在于空气、水、尘埃及人和动物的排泄物中。金黄色葡萄球菌能产生多种致病性物质，如毒素、酶类和菌体的一些成份，该菌产生的主要毒素有：肠毒素（Staphylococcal enterotoxins，SE）、葡萄球菌溶素、表皮剥脱毒素、杀白细胞素、毒性休克综合征毒素-1等；产生的主要酶类有：凝固酶、耐热核酸酶、葡激酶等，其中sE在该菌的致病性中起着重要的作用。在美国由SE引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的33％，加拿大则更多占45％，我国每年发生的此类中毒事件也非常多见，中毒食品多为奶、肉、鱼、蛋及其制品以及剩饭，剩菜和凉盆；人畜化脓性感染部位常成为传染源。据报道，每100g食物中含18ug SE时即能引起金黄色葡萄球菌食物中毒。因此，研究SE尤其是开展SE的检测和分型工作，对于由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒临床诊断和预防该菌引起的食物中毒均有重要意义。     

金黄色葡萄球菌肠毒素的检测和耐药性分析

目的了解临床分离的金黄色葡萄球菌(SA)产肠毒素(SE)的情况及耐药现状。方法对从临床标本中分离出的260株SA,用反向间接血凝试验检测其肠毒素,按2005年美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)的标准,用K-B法对260株SA进行药物敏感性试验,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)检测分别用检测头孢西丁及乳胶凝集检测PBP2a方法进行。结果260株SA中有172株携带肠毒素,占66.2%,主要为SEA型10.8%(28/260)、SEB型14.6%(38/260)、SEC型10.0%(26/260),同时携带二种或二种以上肠毒素的占23.8%(62/260);其中MRSA134株,全部携带肠毒素,且以SEA、SEB和SEC为主,分别为19.4%、16.4%和13.4%;甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)126株,携带肠毒素率为30.0%(38/126),以SEB为主,占9.5%。用头孢西丁及检测PBP2a的方法检测MRSA,检出率无显著意义(P>0.05);SA对临床常用的抗菌素除万古霉素及替考拉宁较敏感(100.0%敏感),其它的抗菌素存在多重耐药性,且MRSA的耐药性比MSSA的强。结论临床分离的SA株大部分都携带肠毒素,MRSA的带毒率及耐药性均高于MSSA;临床应重视SA肠毒素和MRSA的检测,合理使用抗菌素。     

金黄色葡萄球菌及其肠毒素B的生物学特性

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus）是一种革兰阳性球菌，广泛分布于自然界，如空气、水、土壤、饲料和一些物品上，也存在于人、动物的体表、鼻咽及肠道部位，绝大多数的金黄色葡萄球菌对人体是不致病的，但有少数可以引起人或动物致病，属于人兽共患病原菌。金黄色葡萄球菌是引起医院感染以及盆腔炎，产褥感染和细菌性食物中毒的一种主要病原菌，可以分泌20多种毒性蛋白质，这些蛋白质是引起人类疾病的主要病原因子。尤其是其中的肠毒素（Staphylococcal enterotoxins，SEs），是具有超抗原活性的一组细菌毒素，有强大的激活淋巴细胞的能力，可使淋巴细胞产生强烈的细胞毒性作用和高水平的细胞因子，如肿瘤坏死因子（TNF）-α等，对肿瘤细胞具有强大的杀伤作用，金黄色葡萄球菌肠毒素的生物学特性越来越受到研究者的关注。