Nell-1对兔骨髓基质干细胞增殖与黏附的影响

目的探讨Nell-1对兔骨髓基质干细胞（BMSCs）增殖与黏附的影响。方法体外分离与培养兔BMSCs，分别用0、50、100、200、500ng／mL的Nell-1诱导培养基培养48h。利用MTr法测定细胞增殖能力的变化，通过荧光法测定接种后1hBMSCs的黏附率。结果Nell-1浓度为100ng／mL时BMSCs的黏附率增高，Nell-1浓度为200ng／mL时细胞黏附率达最高，但当Nell-1浓度进一步增加时，细胞黏附率却不再增加。Nell-1对BMSCs的增殖无明显影响。结论Nell-1可增强BMSCs的黏附率，同时对BMSCs的增殖无明显影响。     

新型聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)支架的细胞相容性研究

目的研究骨髓基质干细胞(BMSCs)与该聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)类支架的细胞相容性及体外粘附情况,为制备负载多种细胞因子的PLGA类支架提供研究基础。方法抽取新西兰兔骨髓,用全骨髓培养法获取单核细胞,经条件培养液体外诱导、扩增。设立空白BMSCs组和具有良好细胞相容性的β-磷酸三钙(β-TCP)为对照组。BMSCs以1×106/mL浓度接种于PLGA和β-TCP上,通过倒置相差显微镜、扫描电镜观察细胞生长及细胞与材料的附着情况。以MTT实验、流式细胞仪等手段检测各组细胞增殖和细胞周期变化情况。结果BMSCs可较好粘附于PLGA支架上,且该PLGA类支架对细胞增殖、生长周期无明显影响。结论该PLGA类支架的细胞相容性较好,并可进一步作为多种细胞因子载体构建缓释型支架,从而用于骨组织工程。     

脱细胞真皮支架复合骨髓基质干细胞构建前交叉韧带的实验研究

[目的]研究骨髓基质干细胞(BMSCs)复合脱细胞真皮(ADM)构建组织工程膝前交叉韧带(ACL),以及特定浓度转化生长因子TGF-β1和碱性成纤维细胞因子bFGF对骨髓基质干细胞生长、粘附及分化的影响.[方法]用ADM制备4股编织柱形及4股束形支架材料,将兔BMSCs接种于ADM支架上,分别用普通培养液(对照组)及含有特定浓度的TGF-β1和bFGF因子培养液(实验组)培养,通过绘制细胞增殖MTT曲线,碱性磷酸酶ALP测定,荧光显微镜及激光共聚焦扫描显微镜观察,分析ADM支架力学性能,细胞在支架材料中的生长增殖情况,以及其在ADM上的粘附情况.[结果]ADM的一般力学性能符合ACL要求,实验组BMSCs在ADM上生长数量及粘附效果明显优于对照组(P＜0.05),实验组相对于对照组细胞能够分泌更多的ALP (P ＜0.05).[结论] BMSCs复合ADM支架可能成为组织工程ACL材料替代移植材料,本浓度的TGF-β1及bFGF因子培养液对骨髓基质干细胞在ADM上的生长、粘附及分化有明显的刺激增强效果.     

小肠粘膜下层的制备及细胞相容性的实验研究

目的了解猪小肠粘膜下层(SIS)的细胞相容性,探讨用SIS为生长载体复合骨髓基质干细胞(BMSCs)构筑组织工程骨的可能性。方法用物理和化学方法处理猪小肠粘膜下层,将兔骨髓基质干细胞与SIS进行体外复合培养,分别进行组织学、相差显微镜和扫描电镜观察。结果经物理和化学处理的SIS纯度高,孔隙多,胶原纤维未受损;BMSCs在SIS材料上生长、粘附、增殖,并能长入材料的孔隙内,分泌大量的细胞外基质成分。结论SIS的细胞相容性良好,不影响BMSCs的形态,对细胞生长和功能表达无抑制作用,可以用作骨组织工程的支架材料。     

rhBMP-2对骨骼肌卫星细胞增殖与粘附的影响

目的探讨人重组骨形态发生蛋白(rhBMP)-2对骨骼肌卫星细胞增殖与粘附的影响.方法体外分离与培养骨骼肌卫星细胞,分别用0、50、100、500、1000 ng/ml的rhBMP-2诱导培养基培养48h.利用MTT法测定细胞增殖能力的变化,通过荧光法测定接种后1h的粘附细胞率.结果rhBMP-2可促进骨骼肌卫星细胞的增殖,这种作用从BMP浓度为500ng/ml即可表现出来,并随着浓度的增加而越发明显.在rhBMP-2作用下骨骼肌卫星细胞的粘附率增高,在500ng/ml的浓度时达最高,但当BMP浓度进一步增大时,细胞粘附率却不再增加.结论rhBMP-2可促进骨骼肌卫星细胞的增殖,增强其粘附特性.     

人骨髓基质细胞诱导成骨细胞和脱钙骨粘附率的研究

目的研究人MSC诱导为成骨细胞后,其在脱钙骨上的粘附特性.方法采用密度梯度法分离人骨髓中骨髓基质干细胞,条件培养液诱导培养至第3代细胞,经相差显微镜观察,钙结节茜素红染色,免疫组化检测Ⅰ型胶原和骨钙蛋白,RT-PCR检测Ⅰ型胶原和骨钙蛋白mRNA的表达.不同浓度细胞悬液接种脱钙骨,MTT计数未粘附细胞量,计算不同浓度下MSC的粘附率,单位重量脱钙骨上MSC最多能粘附的细胞数量.结果 MSC经体外诱导形成钙结节,Ⅰ型胶原和骨钙蛋白免疫组化结果阳性,RT-PCR证实Ⅰ型胶原和骨钙蛋白mRNA的表达.脱钙骨上接种MSC达到饱和后,MSC的粘附率随接种浓度上升而下降.单位重量脱钙骨最多粘附的MSC量为3.5×107/g.结论人MSC在体外经条件培养液诱导可表达成骨细胞表型,在脱钙骨上有良好的粘附能力,单位重量脱钙骨上存在MSC的最大粘附细胞数量.     

骨髓间充质干细胞的贴壁培养及内毒素对其增殖活性的影响

目的贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),并观察不同浓度内毒素对其增殖活性的影响。方法采用全骨髓贴壁培养法培养大鼠BMSCs,倒置显微镜下观察细胞形态,免疫细胞化学方法检测细胞CD44、CD29、CD34的表达,流式细胞术检测细胞周期。加不同浓度的内毒素(0、0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml)作用24h,用四唑盐比色法(MTT)检测BMSCs的增殖。结果分离培养的细胞三代以后呈均一的成纤维细胞样形态,高表达CD44,但不表达CD34、CD45。80%以上的第三代BMSCs处于G1期。不同浓度的LPS作用24h后各组的平均吸光度值(A)比较有统计学意义(F=3.598,P=0.007);0.01μg/mlLPS组A值与其余各组相比,具有统计学意义(P0.05)。结论全骨髓贴壁培养法可以方便、快捷地获得BMSCs,其在形态学、细胞表面标志物表达和多向分化能力方面具有干细胞生物学特性;0.01μg/mlLPS可明显促进BMSCs的增殖。     

以骨髓基质干细胞构建带内支撑的组织工程化软骨

目的 探讨构建特定形态带内支撑组织工程化软骨的医用假体的可能性.方法 以直径3 mm、长5 mm的圆柱状多孔高密度聚乙烯(Medpor)外裹厚1 mm的聚羟基乙酸为支架,将体外培养的骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs).按10×107/ml的细胞浓度均匀接种于支架,常规培养液培养5 d后,用含诱导因子的培养液立体诱导4周,同时以相同浓度的软骨细胞和BMSCs分别接种,常规体外培养4周作为阳性对照组和阴性对照组,分别种植于裸鼠皮下,4、8周后取材,行大体观察、组织学、组织化学、免疫组化及糖氨聚糖(GAG)定量等检测.结果 各组细胞均与材料粘附良好.实验组和阳性对照组均形成了大体形态良好的Medper-软骨复合体,内部的Medper与外层软骨结合紧密.组织学可见成熟软骨陷窝并渗入Medper孔隙内部、异染基质及Ⅱ型胶原表达,实验组GAG含量4、8周时分别为(5.13 ±0.32)mg/g、(5.37±0.12)mg/g.结论 以BMSCs作为种子细胞可于体内构建特定形态、组织学良好的Medpor-软骨复合体.     

低温保存对人骨髓基质干细胞在脱钙骨上体外增殖及成骨能力的影响

目的研究低温保存对人骨髓基质干细胞(BMSCs)在脱钙骨(DBM)上生长特性及成骨能力的影响。方法取3例志愿者骨髓(3～5mL),密度梯度离心、差速贴壁法获得BMSCs。第3代BMSCs在-196℃下保存24h,37℃复苏,测定细胞成活率。低温保存前、后的BMSCs分别用成骨诱导液诱导培养,至90%融合时,收集细胞接种在DBM支架上,并测定细胞在DBM上的粘附率。DiI荧光染料标记BMSCs,例置相差显微镜、荧光显微镜和SEM观察低温保存前、后的BMSCs在DBM上的生长及基质分泌情况,MTT法测定细胞在DBM上的增殖活性。通过测定碱性磷酸酶(ALP)活性和骨钙素(OCN)含量观察细胞在DBM上的成骨能力。结果复苏细胞的存活率为(90．24±0．02)%。低温保存前、后的BMSCs在DBM上的粘附率分别为(97．25±1．17)%和(97．00±1．09)%。倒置相差显微镜及SEM观察显示低温保存前、后的BMSCs在DBM上粘附、生长良好,有大量细胞外基质分泌、沉积。低温保存前、后的BMSCs在DBM上MTT吸光度值和ALP活性的检测结果差异无显著性意义(P＞0．05)；体外培养12d时,MTT吸光度值及ALP活性同时达到峰值。低温保存前、后的BMSCs在DBM上分泌OCN的量差异无显著性意义(P＞0．05),OCN含量随着培养时间延长而不断上升,在观察期(16d)内未出现平台期。结论低温保存对人BMSCs在DBM上的体外增殖、粘附及成骨能力影响差异无显著性意义,低温保存的人BMSCs可作为组织工程骨的种子细胞。     

新型多孔PLGA/HA复合支架体外细胞相容性的实验研究

目的研究新型多孔聚乳酸乙醇酸/羟基磷灰石(PLGA/HA)支架材料的体外细胞相容性。方法采用贴壁法对兔骨髓基质细胞(BMSCs)进行体外矿化诱导培养,扩增后与实验A组(含5%HA的PLGA/HA),实验B组(含10%HA的PLGA/HA)及对照C组(仅含PLGA)分别进行体外复合培养;并通过定性及定量法检测BMSCs在材料表面的粘附能力、增殖活力,验证细胞材料复合体的成骨活性。比较分析各组之间的差异。结果兔BMSCs在每组材料的表面均能生长,经体外诱导后在支架材料的表面形成钙结节,A、B组细胞的粘附及增殖能力均强于C组(P<0.05),A、B组之间无差异。结论兔BMSCs与新型多孔PLGA/HA支架材料有良好的相容性。     

不同培养基对Beagle犬骨髓基质细胞增殖与分化的影响

目的研究α-MEM、DMEM—LG、RPMI 1640三种培养基对Beagle犬骨髓基质细胞（Bone marrow stromal cells,BMSCs）体外培养生物学行为的影响,为BMSCs的培养寻找合适的培养基。方法取6只Beagle犬的BMSCs,分别用α-MEM、DMEM—LG、RPMI 1640三种培养基进行培养,比较3组细胞的贴壁、增殖及矿化等方面的差异。结果α—MEM组24h内贴壁的细胞数目最多;消除贴壁差异后,α-MEM和DMEM—LG促增殖作用相近;α-MEM组碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）表达量最高,但矿化结节形成数目较少,DMEM—LG组矿化结节形成个数最多。结论DMEM—LG培养基较适合BMSCs的培养。     

人参皂甙Rb1促进大鼠雪旺细胞增殖的实验研究

目的：观察人参皂甙Rb1对体外培养的大鼠坐骨神经经雪旺经细胞增殖能力的影响，探讨其促进神经再生的作用机制。方法：取SD雄性大鼠坐骨骨神经体外培养第2代第5天，加入不同浓度的人参皂甙Rb1，利用MTT比色分析，^3H－胸腺嘧啶核甙测定法检测不同浓度人参皂甙Rb1在不同培养时间对体外培养大鼠旺细胞增殖的影响。结论：人参皂甙Rb1在10μg/ml的浓度对雪旺细胞增殖有明显促进作用，高浓度的人参皂甙Rb1 1mg/ml则显示抑制作用。而200μg/ml人参皂甙Rb1对细胞增殖的促进作用与对照组相近。结论：人参皂甙Rb1在适当浓度范围内可以促进雪旺细胞的增殖，从而为促进活体神经损伤的修复途径提供了一些研究基础。     

胎儿骨髓间充质干细胞复合PLGA支架的形态学观察

目的 探讨胎儿骨髓间充质干细胞(fetal bone marrow mesenehymal stem cells，fBMSCs)与低热高压法制作的聚丙交酯-乙交酯(PLGA)支架材料复合培养。构建组织工程化骨的可行性。方法 预制PLGA支架材料，取5月胎儿肱骨和股骨骨髓，用单核细胞分离液分离fBMSCs，含双抗的低糖DMEM原代和传代培养，倒置显微镜下观察细胞生物学特性，用F1TC标记的抗CDl05、CD44和用PE标记的抗CD34、CD29对第4代细胞进行流式细胞鉴定，并与PLGA支架材料复合培养l周后行扫描电镜观察。结果原代及传代培养的fBMSCs增殖较迅速，第4代CD105阳性细胞占84．08％，CD29阳性细胞占88．77％，CD44阳性细胞占89．53％。复合PLGA支架材料细胞生长状态良好。结论 骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)是骨组织工程适宜的种子细胞，与低热高压制作的PLGA支架材料复合可体外构建组织工程骨。     

Percoll法分离犬骨髓单个核细胞与体外成骨诱导培养的实验研究

目的建立犬骨髓单个核细胞(Bone marrow mononuclear cells,BMNCs)的分离培养、体外扩增和成骨诱导方法,为骨缺损的修复提供理想的骨组织工程种子细胞。方法用1.063g/ml percoll液分离2.5ml Beagle犬骨髓,利用细胞贴壁筛选法进行分离、培养、扩增和成骨诱导。结果采用1.063g/ml percoll液可获得纯度较高的BMNCs,接种细胞生长良好,平均倍增周期为1d,经成骨诱导培养后可定向分化为成骨细胞。结论采用1.063g/ml percoll液能够较好的进行Beagle犬BMNCs的分离培养和体外扩增,分离得到的细胞具备骨髓基质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的特性。     

脊索细胞培养基促进BMSCs增殖分化的研究

目的为研究椎间盘组织工程种子细胞,观察脊索细胞培养基对BMSCs增殖分化的影响。方法取4周龄日本大耳白兔胸腰段椎间盘分离培养脊索细胞,取双侧股骨分离培养BMSCs,用含15%FBS的DMEM/F12培养基培养脊索细胞,5 d后制备脊索细胞培养基。实验分为两组,实验组BMSCs中加入脊索细胞培养基培养,对照组BMSCs中加入含15%FBS的DMEM/F12培养基培养。使用细胞活力细胞毒性检测检测细胞增殖情况,采用免疫荧光及实时荧光定量PCR检测BMSCs蛋白多糖及Ⅱ型胶原表达情况。结果成功分离脊索细胞及BMSCs。细胞增殖检测示,培养5、7、9、14 d,实验组细胞数量明显多于对照组(P<0.05)。免疫荧光检测示对照组培养7、14 d细胞内均无或者有较少Ⅱ型胶原及蛋白多糖表达,实验组二者均有较多表达,且培养14 d时表达明显多于7 d。实时荧光定量PCR检测示,培养7、14 d实验组蛋白多糖和Ⅱ型胶原mRNA表达均显著高于对照组(P<0.05);实验组14 d蛋白多糖和Ⅱ型胶原mRNA表达显著高于7 d(P<0.05)。结论脊索细胞培养基可促进BMSCs增殖,并诱导BMSCs向类软骨细胞分化,为脊索细胞和BMSCs作为种子细胞治疗椎间盘退变提供了依据。     

Differentiation of adult human bone marrow mesenchymal stem cells into Schwann-like cells in vitro

Bonemarrowmesenchymalstemcells, alsocalledbonemarrowstromalcells (BMSCs), areisolatedfrombonemarrow, andtheycanmultiplyinvitroanddifferentiateintoosteogeniccells,chondrocytes, adipocytes, musclecellsandneuralcells.1 5 RecentstudieshavedemonstratedthatBMSCsfromadultratscoulddifferentiateintoSchwann likecellsinspecificconditions.6, 7 BMSCsmayhavepotentialapplicationforautologousneuraltransplantation. Inthisstudy, wetrytoinvestigatethedifferentiativecapabilityofadulthumanBMSCsintoSchwann l…     

不同浓度麝香含药血清对骨髓间充质干细胞迁移影响的实验研究

目的探讨麝香对外源性骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)增殖和迁移的影响。方法将60只SD大鼠随机分为麝香高、中、低剂量组及空白对照组,制备麝香含药血清及生理盐水血清。15只SD大鼠利用全骨髓贴壁法分离BMSCs,培养至P3代,通过形态学观察、表型鉴定、成骨成脂诱导鉴定BMSCs,鉴定认为培养成功后通过麝香含药血清干预BMSCs,检测细胞增殖率,利用Transwell实验检测麝香含药血清对BMSCs迁移的影响。结果外源性大鼠BMSCs呈梭形贴壁生长,生长状态良好;表型鉴定:CD45、CD34阴性表达,CD44、CD90阳性表达;细胞成骨、成脂诱导后可定向成骨、成脂分化;不同浓度麝香组与对照组比较均能提高BMSCs增殖率(P0.05);与对照组比较,不同浓度麝香在24 h、48 h、72 h均增加BMSCs迁移(P0.05),以低浓度组效果最佳。结论麝香含药血清可以促进BMSCs增殖,促进BMSCs的体外迁移。     

PEI/SPIO对骨髓间充质干细胞生物学特性的影响

目的探讨应用新型聚乙烯酰胺（PEI）包覆的超顺磁性氧化铁（SPIO）标记骨髓间充质干细胞（bMSCs）对其生物学特性的影响。方法分离、培养贵州小香猪bMSCs,选取第3代bMSCs,用含铁浓度为4、6、8、10、12μg/ml的DMEM/F12培养液孵育24h,未标记组为对照。通过普鲁士蓝染色、透射电镜检查、胎盼蓝染色、MTT检测及成骨、成软骨、成脂诱导分化实验,探讨不同PEI/SPIO浓度对bMSCs标记效率、细胞活性、增殖及分化的影响。结果铁浓度为8μg/ml以上的SPIO标记bMSCs后,普鲁士蓝染色标记效率均接近100%。与对照组相比,Fe浓度为4、6、8μg/ml的PEI/SPIO标记的bMSCs活细胞比率均在95%以上,差异无统计学意义（P〉0.05）;而Fe浓度为10μg/ml时,活细胞比率约为（80.24±1.34）%,Fe浓度为12μg/ml时,活细胞比率约为（75.44±2.33）%,两者对细胞的活性有明显的抑制作用（P〈0.05）。4、6、8g/ml的PEI/SPIO标记的bMSCs成骨、成软骨及成脂分化与正常对照组相比无明显差异,而10、12ug/ml组在诱导培养过程中大部分细胞死亡。结论含铁浓度8μg/ml是PEI/SPIO标记干细胞的适宜浓度,既能高效地标记bMSCs,又不影响bMSCs的细胞活性及增殖分化能力等生物学特性。     

不同来源血清体外培养骨髓间充质干细胞的研究

目的 适当的血清浓度可维持骨髓问充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的体外培养,而不同来源的血清对BMSCs的培养效果是否小同.本研究探讨自体血清、脐带血清、AB血清、胎牛血清在体外培养人BMSCs的可行性.方法 Ficoll密度梯度离心法结合贴壁法分离纯化人BMSCs,在培养过程中分别加入白体血清、脐带血清、AB血清、胎牛血清,观察比较细胞形态、表面抗原、生长曲线及各组在诱导剂作用下表面抗原和诱导分化的相关性.结果 从BMSCs的形态学、生长曲线、表面抗原、诱导分化上看各组无明显差异,生长状况良好.结论 自体血清、脐带血清、AB血清、胎牛血清均可维持BMSCs的体外培养,而自体血清解决异种和异体血清带来的一些潜在的风险,更为安全.     

水平振摇在骨髓间充质干细胞提纯中的作用

目的研究水平振摇对全骨髓贴壁分离大鼠骨髓间充质干细胞在细胞数量、纯度、凋亡及远期增殖及分化能力的影响,探索更为简单、高效的间充质干细胞提纯方法。方法在全骨髓贴壁法的基础上,使用水平摇床,以180 r/min、4 h为干预条件,水平振摇后计算贴壁细胞总数量;使用流式细胞仪测定贴壁细胞纯度及凋亡情况;使用MTT法测定振摇后贴壁细胞24 h的增殖情况;对分离纯化后细胞使用定向诱导培养基进行诱导分化。结果经振摇处理后,获得的细胞总量有所下降,细胞纯度显著提升,凋亡略有增加,增殖情况变化不大,具有向成骨细胞和脂肪细胞分化的能力。结论水平振摇法可显著提高全骨髓贴壁法的提纯效率,具有推广价值。