丙型肝炎NS5A基因多克隆抗体的制备

目的：构建丙型肝炎病毒（HCV）NS5A蛋白原核表达载体,获得高产量的纯化目的蛋白,并制备其多克隆抗体。方法：应用聚合酶链反应技术,PCR扩增获得NS5A基因,将NS5A基因插入至原核表达载体pET-32a（＋）中,转化大肠埃希菌DH5α提取质粒,验证正确后,转化大肠埃希菌BL21中,以IPTG诱导,获得NS5A融合蛋白的可诱导性表达．通过SDS—PAGE电泳、Western blot免疫印迹分析证实融合蛋白表达的特异性。利用Ni^＋亲和柱对表达蛋白进行纯化及柱上复性。纯化蛋白免疫新西兰兔,利用Western blot和ELISA法对多克隆抗体进行特异性和效价检测。结果：NS5A融合蛋白表达成功,成功获得了融合蛋白及兔抗NS5A多克隆抗体。结论：成功表达NS5A基因融合蛋白．获得高特异性、兔抗NS5A多克隆抗体,为研究NS5A基因的生物学功能提供了重要制剂。     

癌症转移相关基因Syntenin1多克隆抗体的制备与鉴定

目的 获得原核表达GST-Syntenin1融合蛋白,制备高效价的抗Syntenin1多克隆抗体.方法 RT-PCR扩增Syntenin1 cDNA开放阅读框(CDS)序列,亚克隆到编码GST的pGEX-4T-2原核表达载体上,将编码Syntenin1的pGEX-4T-2-Syntenin1重组质粒化学转化BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导GST-Syntenin1融合蛋白表达,对融合蛋白亲和纯化.SDS-PAGE鉴定后,将纯化的融合蛋白辅以弗氏佐剂,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western blot检测抗体效价及特异性.结果 成功制备GST-Syntenin1融合蛋白及多克隆抗体.Western blot结果表明Syntenin1兔多克隆抗体效价可达到1∶20 000,且与Syntenin1蛋白特异结合.结论 成功制备Syntenin1多克隆抗体,为进一步研究Syntenin1基因的功能奠定了基础.     

大鼠新基因PMP22CD的克隆以及多克隆抗体的制备

目的:通过PCR克隆PMP22CD基因,构建原核表达载体PET-32a(+)/PMP22CD,表达并纯化蛋白,制备多克隆抗体,为研究该基因的功能奠定基础.方法:通过PCR的方法克隆PMP22CD基因,选择抗原性较强的C-端,构建原核表达载体PET32a(+)/PMP22CD,在大肠杆菌BL21(DE3 Lysis)中诱导表达,SDS-PAGE分析重组蛋白以包涵体的形式存在,应用电洗脱的方式获得重组蛋白,免疫新西兰大白兔,获得抗血清,通过琼脂糖双扩和Western Blot检测抗血清效价和特异性.结果:经测序鉴定成功克隆PMP22CD基因,并构建PET-32a(+)/PMP22CD重组质粒,表达融合蛋白,免疫新西兰大白兔,获得PMP22CD多克隆抗体.结论:得到了纯化的PET-32a(+)/PMP22CD融合蛋白,获得了效价高、特异性强的抗体.     

猪白血病抑制因子多克隆抗体的制备及其免疫定位

目的：构建猪LIF原核表达载体，表达并纯化重组猪LIF蛋白，制备兔抗猪LIF多克隆抗体并进行免疫定位。 方法：根据GenBank中猪LIF cDNA基因序列扩增出目的基因片段，将扩增的片段克隆进 PET-31b表达载体的NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点之间，经转化使其在大肠杆菌BL21中表达，产生重组猪LIF蛋白，纯化后作为抗原免疫新西兰大白兔，制备多克隆抗体；经ELISA和Western blotting分析鉴定抗体的效价和特异性；最后利用所制备的抗体进行LIF蛋白在猪体内的免疫定位。结果：酶切和DNA测序显示,所构建的原核表达质粒PET-31b-mpLIF含有编码成熟型猪LIF蛋白的cDNA序列；表达结果显示，诱导样品在相对分子质量约20 000的位置上有明显的增强表达条带；纯化结果显示，重组蛋白在相对分子质量约20 000的位置上有一条清晰、单一的条带；通过免疫新西兰大白兔，获得了特异性较高、效价达1∶10 000的多克隆抗体；应用该抗体进行的免疫定位显示，LIF蛋白在心肌细胞、脾索和脾被膜的单层上皮细胞、肺成纤维细胞中有弱表达。结论：重组猪LIF蛋白在大肠杆菌中进行了高效、正确表达；得到了效价较高、特异性较强的多克隆抗体；LIF蛋白在心肌细胞、脾索和脾被膜的单层上皮细胞、肺成纤维细胞中有弱表达。     

人心脏发育相关基因ZNF382的原核表达及多克隆抗体的制备

目的 表达、纯化ZNF382融合蛋白及制备兔多克隆抗体.方法 通过PCR扩增ZNF382编码区,将其克隆到pRSET C载体中,重组载体酶切鉴定,测序,转化大肠杆菌BL21(DE3)并用IPTG进行诱导表达,原核表达产物经鉴定、纯化后,免疫新西兰大白兔.通过ELISA和Western blot检测抗血清的效价和特异性.结果 成功构建了pRSET C-ZNF382原核表达重组质粒,His6-ZNF382融合蛋白被强烈诱导表达,以包涵体的形式存在,其相对分子质量约为 64×103,纯化后免疫产生的多克隆抗体效价约为1∶10 000,与ZNF382原核表达蛋白特异性结合.结论 获得了大量高效价、高特异性的兔抗人ZNF382多克隆抗体.     

S100A16基因的原核表达和多克隆抗体制备

目的:构建S100A16原核表达载体,制备S100A16蛋白多克隆抗体并初步鉴定?方法:RT-PCR扩增得到小鼠肝脏组织的S100A16基因,将此片段克隆到带有His标签的原核表达载体pET-28a多克隆位点,并转化大肠杆菌BL21(DE3)?IPTG诱导融合蛋白表达,以亲和层析的方法纯化His-S100A16融合蛋白?纯化蛋白经SDS-PAGE电泳鉴定后,免疫新西兰白兔制备抗血清?分别采用ELISA和Western blot方法检测抗体效价和特异性?结果:经双酶切和核酸序列分析证实成功构建pET-28a-S100A16原核表达质粒?考马斯亮兰染色结果证实IPTG可有效诱导融合蛋白表达?用纯化融合蛋白免疫新西兰白兔得到的S100A16抗体血清,经ELISA和Western blot检测结果显示该抗体效价高,特异性好?结论:构建带有His标签的S100A16原核表达载体,并获得高纯度His-S100A16融合蛋白及其多克隆抗体,为进一步研究S100A16生物学功能奠定基础?     

猪白血病抑制因子多克隆抗体的制备及其免疫定位

目的:构建猪LIF原核表达载体,表达并纯化重组猪LIF蛋白,制备兔抗猪LIF多克隆抗体并进行免疫定位。方法:根据GenBank中猪LIFcDNA基因序列扩增出目的基因片段,将扩增的片段克隆进PET-31b表达载体的NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点之间,经转化使其在大肠杆菌BL21中表达,产生重组猪LIF蛋白,纯化后作为抗原免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体;经ELISA和Western blotting分析鉴定抗体的效价和特异性;最后利用所制备的抗体进行LIF蛋白在猪体内的免疫定位。结果:酶切和DNA测序显示,所构建的原核表达质粒PET-31b-mpLIF含有编码成熟型猪LIF蛋白的cDNA序列;表达结果显示,诱导样品在相对分子质量约20000的位置上有明显的增强表达条带;纯化结果显示,重组蛋白在相对分子质量约20000的位置上有一条清晰、单一的条带;通过免疫新西兰大白兔,获得了特异性较高、效价达1∶10000的多克隆抗体;应用该抗体进行的免疫定位显示,LIF蛋白在心肌细胞、脾索和脾被膜的单层上皮细胞、肺成纤维细胞中有弱表达。结论:重组猪LIF蛋白在大肠杆菌中进行了高效、正确表达;得到了效价较高、特异性较强的多克隆抗体;LIF蛋白在心肌细胞、脾索和脾被膜的单层上皮细胞、肺成纤维细胞中有弱表达。     

结核分枝杆菌Rv0808基因的克隆、表达、纯化及抗原性研究

目的克隆、表达和纯化结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)体内诱导基因Rv0808,并制备多克隆抗体,研究其编码蛋白的抗原性,了解诊断应用价值。方法高保真PCR扩增Rv0808基因,克隆入表达载体pET-30a(+)后转化大肠杆菌BL21(DE3),测序正确的克隆用IPTG诱导表达。用镍柱纯化重组蛋白,然后用纯化蛋白免疫新西兰白兔,制备和纯化多克隆抗体。将重组蛋白分别与多克隆抗体和结核病患者血清进行Western blot鉴定,并尝试用多克隆抗体进行免疫组化染色检测巨噬细胞中M.tb。结果成功构建了pET-30a(+):Rv0808重组表达载体。经过重组蛋白的可溶性表达及纯化后,SDS-PAGE结果显示在66kD处有一单一蛋白条带。将此蛋白免疫新西兰白兔后获得了效价为6400的多克隆抗体。重组蛋白与多克隆抗体可以发生免疫反应,但却不能检测出结核患者血清中的相应抗体。用此多克隆抗体也无法检测出巨噬细胞中的M.tb。结论结核分枝杆菌Rv0808编码蛋白具有良好的免疫反应性和免疫原性,但可能对于结核病的诊断价值较小。     

奇异变形杆菌聚磷酸盐激酶多克隆抗体的制备和鉴定

目的 表达、纯化奇异变形杆菌聚磷酸盐激酶(PPK)蛋白,制备PPK多克隆抗体.方法 利用分子生物学软件分析奇异变形杆菌PPK的抗原性、疏水性等参数,选取N端较保守的309个氨基酸,并对其基因序列进行密码子优化以利于原核表达.合成新的基因序列后插入pET28b(+)质粒,转化入转化宿主菌BL21(DE3),诱导、表达融合蛋白.通过镍琼脂糖亲和层析技术,将获得的融合蛋白进行纯化.以纯化的蛋白作为免疫原并结合使用佐剂,背部多点注射新西兰大白兔,ELISA检测兔血清效价,Western Blotting验证抗体特异性.结果 成功构建了奇异变形杆菌PPK的原核表达重组质粒,可在0.5 mmol/L IPTG、37℃条件下获得较好的诱导、表达;利用镍柱纯化后的PPK蛋白与免疫佐剂一起,采用背部多点接种新西兰大白兔,制备了效价高的兔抗血清.ELISA检测血清效价达到1∶512 000,Western Blotting对ppk基因缺失株及其野生株进行验证显示抗体特异性良好.结论 利用pET28b(+)载体可构建奇异变形杆菌PPK的原核表达重组质粒,表达、纯化后的蛋白与佐剂共同免疫新西兰大白兔,可获得效价高、特异性良好的兔多克隆抗体血清,为奇异变形杆菌聚磷酸盐激酶的检测以及深入研究PPK在奇异变形杆菌致病中的作用奠定了基础.     

番茄叶绿体小分子热激蛋白多克隆抗体的制备

目的为深入研究叶绿体sHSP的功能,构建有效的原核表达体系,制备高特异性的叶绿体sHSP的多克隆抗体。方法将PCR方法得到的番茄叶绿体小分子热激蛋白基因(cpshsp)全长cDNA基因片段,克隆入融合表达载体pGEX6p-1中,在强启动子作用下在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中诱导表达,并将sHSP纯化产物免疫新西兰大白兔,western blot检测sHSP多克隆抗体。结果表达菌株经0.2 mmol/L IPTG诱导4h后,GST-CPsHSP形成包涵体,sHSP纯化产物免疫新西兰大白兔后得到叶绿体sHSP多克隆抗体,western blot检测表明该抗体的特异性和效价较好。结论构建的原核表达载体pGEX6p-1/cpshsp,在一定的诱导条件下,在DE3中得到稳定高效的融合表达,为制备叶绿体sHSP抗体提供足够的抗原,为进一步研究叶绿体sHSP的功能奠定了基础。     

幽门螺杆菌调控胃上皮细胞基因表达的机制

目的：在基因转录调节水平上研究幽门螺杆菌生物活性物质调控胃上皮细胞基因表达的机制。方法：人胃上皮癌细胞株SGC-7901采用常规方法培养,幽门螺杆菌菌株NCTC11637采用马血清琼脂培养基培养,收获后用超声粉碎法提取生物活性物质,基因转录采用报告基因方法分析。结果：幽门螺杆菌提取物使SRE反式激活的基因转录增加（P〈0．01）,而对CRE反式激活的基因转录没有明显影响（P〉0．01）。结论：幽门螺杆菌生物活性物质通过顺式转录调控元件SRE调控细胞基因表达。     

幽门螺杆菌培养上清液对大鼠胃黏膜上皮细胞增殖的影响

目的:研究幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)的代谢产物在胃黏膜上皮细胞增殖中的作用.方法:用液体培养的方法培养产毒Hp菌株NCTC11637,然后提取上清液,用浓缩上清液(concentrated broth culture supernatant,CCS)灌鼠胃.采用放射免疫方法测定血请胃泌素,用免疫组织化学SP(streptavidin/perosidase)法检测胃黏膜增殖细胞核抗原 (proliferation cell nuclear antigen,PCNA)和表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)的表达.结果:灌服CCS组与对照组比较,胃黏膜PCNA标记指数阳性率升高、差异具有显著性,胃黏膜细胞表皮生长因子受体在灌服CCS组有4/8阳性,对照组无1例阳性;血清胃泌素升高,但统计学上差异无显著性.结论:产毒Hp培养上清液可以促进胃黏膜上皮细胞的增殖,可能促进胃癌的发生.     

球形幽门螺杆菌vacA基因的克隆及序列测定

目的：克隆球形幽门螺杆菌(HpC)vacA基因全长片段，并进行序列分析。方法：采用亚抑菌浓度的抗生素作用，使幽门螺杆菌(Hp)标准株NCTC11637发生球形变异，收集球形Hp。从HpC基因组DNA中特异扩增出vacA基因片段，扩增的目的片段经纯化回收后克隆到pMD-18T中，转化人大肠杆菌JM109。阳性重组质粒用PCR及双酶切鉴定，并进行序列测定。结果：从HpC基因组DNA中扩增出3888bp的vacA基因，构建重组质粒pMD-18T-vacA，酶切产物的大小与预期相符。测序结果显示，HpC与已公布的HpvacA基因序列的同源性达99.8％。结论：成功地对HpC vacA基因进行体外扩增及构建原核重组质粒pMD-18T-vacA，并经酶切及序列分析所验证，证明HpC含有完整的vacA基因，其可能与Hp的致病性有关。     

幽门螺杆菌CagA抗原性多态性分析

目的 了解我国幽门螺杆菌CagA抗原性的多态性，为临床血清学诊断CagA阳性菌株感染提供实验依据，以及是否存在特定胃十二指肠疾病相关的CagA抗原性型提供线索。方法 采用Western blots方法，比较38株我国幽门螺杆菌分离株的CagA与3种不同胃肠疾病分离株兔免疫血清的反应强度。分析不同抗原性类型CagA与疾病的关系。结果 任何一种血清均不能识别所有CagSA，但任一CagA至少可被一种血清识别，多数菌株CagA的抗原性与CAPM N62接近；抗原性与NCTC11637接近的CagA可能与消化性溃疡相关，但不显著。结论 我国不同幽门螺杆菌菌株CagA抗原性存在明显多态性，血清学方法诊断CagA阳性菌株感染时应至少使用3种抗原或抗体，不同抗原性类型CagA与胃十二指肠疾病的关系有待进一步研究。     

幽门螺杆菌基因hp0231和hp0410的克隆表达及生物信息学分析

目的获取幽门螺杆菌hp0231和hp0410基因的序列,预测其编码蛋白HP0231和HP0410作为候选疫苗的可行性,在大肠杆菌表达系统中表达hp0231和hp0410。方法提取幽门螺杆菌标准株NCTC11639的基因组DNA,按照GenBank中幽门螺杆菌标准株22695的序列设计引物PCR,扩增hp0231和hp0410基因,克隆入pMD18-T载体中测序,进行生物信息学分析。将hp0231和hp0410克隆入表达载体pGEX-4T-1中,诱导表达,SDS-PAGE电泳鉴定。结果生物信息学分析表明HP0231和HP0410均为外膜蛋白,具良好的抗原性,并且与其他生物的同源性较低,其作为Hp疫苗不易产生交叉反应以及自身免疫性反应,构建的重组菌可高水平表达可溶性重组蛋白。结论HP0231和HP0410是有良好应用前景的Hp候选疫苗。     

幽门螺杆菌诱导胃癌细胞凋亡与p53状态和bax、caspase表达的关系

目的 探讨幽门螺杆菌(HP)体外诱导胃癌细胞凋亡与p53状态和bax、caspase表达的关系.方法 流式细胞术检测HP国际标准菌株NCTC 11637诱导SGC-7901和AGS细胞凋亡,检测NCTC 11637对SGC-7901和AGS的bax、caspasemRNA和蛋白表达的影响.结果 HP能够在体外直接诱导SGC-7901和AGS细胞凋亡,SGC-7901细胞发生凋亡的高峰时间出现在12～24h,AGS细胞的凋亡率则随着HP感染时间的延长而增高.HP能够呈时间依赖性地上调SGC-7901和AGS细胞的Bax mRNA和蛋白表达,并促进caspase-9和caspase-3的激活.结论 幽门螺杆菌可以通过线粒体途径直接诱导胃癌细胞凋亡,而且野生型p53具有放大线粒体凋亡途径的作用.     

健脾解毒方通过抑制环氧化酶2下调幽门螺杆菌诱导的人胃癌细胞血管内皮生长因子表达

目的：探讨健脾解毒方对幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp）感染胃癌细胞诱导的血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）表达的调控作用及可能的机制。方法：采用Hp标准株NCTC11637与人胃癌MKN45细胞共培养的方法感染MKN45细胞,实验中共分7组：对照组、Hp感染组、NS398抑制组、空白血清组和5%、10%、20%健脾解毒方药物血清组。采用实时荧光定量聚合酶链式反应法检测Hp感染对人胃癌MKN45细胞VEGF和环氧化酶2（cyclooxygenase-2,COX-2）mRNA表达的影响及健脾解毒方血清对Hp感染诱导的人胃癌MKN45细胞VEGF和COX-2mRNA表达的影响;采用COX-2特异性抑制剂NS398（50μmol/L）抑制COX-2的表达后,检测Hp感染后人胃癌MKN45细胞VEGF mRNA表达的变化。结果：与对照组比较,Hp感染MKN45细胞6h后,Hp感染组COX-2mRNA的表达明显上调（P〈0.01）;感染12h后,VEGF mRNA表达亦明显上调（P〈0.01）;而采用COX-2特异性抑制剂NS398抑制COX-2表达后,Hp感染组VEGF mRNA的表达相比抑制前明显下调（P〈0.01）。与Hp感染组比较,5%、10%和20%健脾解毒方药物血清均可下调Hp诱导的人胃癌MKN45细胞VEGF和COX-2mRNA的表达,并呈一定的剂量依赖效应。结论：Hp感染可诱导人胃癌细胞VEGF和COX-2表达,健脾解毒方通过下调COX-2表达进而下调VEGF的表达,这可能是其防治胃癌的重要作用机制之一。     

幽门螺杆菌NCTC11639基因hpaA的克隆表达及鉴定

目的获取幽门螺杆菌（Hp）hpaA基因的序列。预测其编码蛋白hpaA作为候选疫苗的可行性。在大肠杆菌表达系统中表达hpaA。方法提取Hp标准株NCTC11639的基因组DNA。使用PCR扩增hpaA基因。克隆入pGEM—T载体中测序。并进行同源性分析。将hpaA克隆入表达载体pGEX-4T-1中，诱导表达。SDS-PAGE电泳鉴定。结果同源性分析表明hpaA具有很高的保守性，成功构建出可以高效、分泌型表达hpaA的原核表达系统。结论hpaA具有高保守性，在Hp各菌株中普遍存在，是有良好应用前景的Hp候选疫苗。     

幽门螺杆菌感染小鼠胃模型的研究

①目的探索建立幽门螺杆菌感染昆明小鼠的胃感染模型的方法。②方法采用国际标准菌株NCTC11637灌喂昆明小鼠，所有动物灌喂前用酒精预处理一次，再隔天灌喂，共5次，每次0．4mL。实验组菌液灌喂，对照组生理盐水灌喂。所有动物灌喂前禁食、禁水12小时，灌喂后再禁食水4小时。在末次灌喂后2、4、6、8周分批以脊椎脱臼法处死实验组动物，分别用细菌学及组织学方法评价HP感染及其引起的胃组织炎症反应。③结果造模2、4、6、8周后，动物细菌培养阳性率分别是75％、100％、60％、30％；对照组是0％。胃黏膜快速尿素酶试验阳性率分别是50％、56％、90％、70％；对照组38％。HP感染4周后胃组织甲苯胺蓝染色胃黏膜表面及胃小凹内可见数量不等的HP，实验组与对照组的HP感染定植量的差异有显性；HE染色可见轻度的炎性反应，但与对照组相比差异无显性。④结论用灌喂HP的方法能建立早期的小鼠感染模型。     

线粒体途径在幽门螺杆菌诱导胃癌细胞凋亡中的作用

目的 探讨线粒体途径在幽门螺杆菌(H.pylori)诱导胃痛细胞凋亡中的作用.方法 采用流式细胞术检测H.pylori NCTC 11637诱导的SGC-7901细胞凋亡,RT-PCR和Western blot法检测H. Pylori感染对线粒体途径相关基凶和蛋白表达的影响,并观察Caspase抑制剂对H. Pylori所致SGC-7901细胞凋亡的影响.,结果 H. Pylori能够在体外直接诱导SGC-7901细胞凋亡,6、12、24 h和48 h的凋亡率分别为6.30%、11.57%、8.63%和7.22%;H. Pylori能够呈时间依赖性地上调SGC-7901细胞的Bax蛋白表达,并促进Caspase-9和3的激活;Caspase-9和3抑制剂能够显著抑制NCTC 11637所致的SGC-7901凋亡,而Caspase-8抑制剂仪能部分抑制约20%NCTC 11637所致的SGC-7901凋亡.结论 H.pylori可引起SGC-7901细胞Bax基因和蛋白表达升高,激活Caspase-9和Caspase-3,且主要通过线粒体途径诱导细胞凋亡.