SOCS-3在大鼠慢性肝损伤中的表达研究

目的 通过研究细胞因子信号转导抑制因子-3（Suppressor of cytokine signaling-3,SOCS-3）在慢性肝损伤中的表达,为阐明其在慢性肝损伤中的作用提供实验基础。方法 采用CCL4法构建大鼠慢性肝损伤模型,通过实时荧光定量PCR、免疫组化检测大鼠肝脏组织SOCS-3的表达。结果 慢性肝损伤组SOCS-3 mRNA相对表达量及SOCS-3蛋白高于对照组,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论 在慢性肝损伤中,随着肝脏损伤加重,因炎症因子持续刺激,SOCS-3表达逐渐增加,提示SOCS-3在慢性肝损伤发生发展过程中起重要作用。     

SOCS－3基因真核载体的构建及瞬时表达鉴定

目的构建含小鼠细胞因子信号抑制蛋白-3（SOCS-3）基因的重组pcDNA3.1质粒,同时瞬时转染后,鉴定其在非洲绿猴肾细胞株COS-7中的表达。方法自小鼠肝脏标本中提取RNA进行RT—PCR,经克隆后获得pUC19-SOCS-3质粒,从中切出目的基因片段克隆至质粒pcDNA3．1中,以构建重组质粒pcDNA3.1-SOCS-3。后将构建完成的质粒瞬时转染COS-7细胞株,并随机分为未转染质粒组（对照组）、转染空质粒组和转染重组SOCS-3基因质粒组,同时采用免疫印迹法测定SOCS-3的表达。结果经测序鉴定证实,SOCS-3与美国国立生物技术信息中心核苷酸序列数据库提供的原始序列完全一致;同时经瞬时转染COS-7细胞后,转染重组质粒组的SOCS-3蛋白表达水平（光密度比值）显著高于对照组和转空质粒组（P〈0．01）。结论成功构建含小鼠SOCS-3基因的真核表达质粒,为进一步研究该基因在脂肪代谢中的抑制调节作用提供了技术平台。     

14-3-3基因真核表达载体的构建

目的克隆人14-3-3基因并构建真核表达载体pcDNA3.1（＋）-14-3-3。方法从胎脑组织中提取总RNA,用RT-PCR方法获得人14-3-3基因的全长cDNA,将其插入pCUm-T载体中;序列测定后,重组携带14-3-3基因的表达载体pcDNA3.1（＋）-14-3-3。结果经限制性内切酶酶切分析、PCR和DNA序列测定证实目的基因已插入重组质粒。结论成功构建了14-3-3真核表达载体pcDNA3.1（＋）-14-3-3,为进一步研究14-3-3在帕金森病中的作用奠定了良好的基础。     

小鼠T-bet基因真核表达载体的构建

目的构建小鼠T—bet基因重组真核表达载体pcDNA3一T—bet,为T—bet基因治疗研究提供有效的生物表达系统。方法采用内切酶切从质粒T—bet/GFP—RV中获得约1.7 kb的小鼠T—betcDNA片段,以单酶切非定向克隆方式与真核表达质粒pcDNA3连接,构建真核表达载体pcDNA3-T-bet。结果经PCR筛选阳性重组子,双酶切鉴定T—bet基因重组方向,并测序鉴定无错配及插入移位等DNA顺序改变。结论本实验成功构建了小鼠T—bet基因真核表达载体pcDNA3-T-bet。     

小鼠LIF基因分泌型真核表达载体的构建及其应用研究

目的构建小鼠白血病抑制因子的真核表达载体,有助于开展高其他实验动物的胚胎干细胞的定向分化研究。方法运用RT-PCR技术,克隆含信号肽和不含信号肽的小鼠分泌型白血病抑制因子,通过pMD18-Tsimple载体和pBS-T载体过渡,酶切进行初步鉴定。结果分别经过酶切鉴定,成功构建了小鼠LIF基因真核表达载体pSecTag-LIF(sp )和pSecTag-LIF(sp-)。结论构建小鼠白血病抑制因子的真核表达载体有效可行,不仅为进一步研究LIF细胞因子所诱导的维持胚胎干细胞未分化状态的分子机制奠定了基础,而且为各种转基因实验动物的研究提供了一种新的方法。     

瘦素对大鼠脂肪细胞SOCS-3表达的影响

目的:探讨瘦素对脂肪细胞SOCS-3表达的影响及机制.方法:分离并培养大鼠成熟脂肪细胞,采用50 nmol·L-1重组瘦素对脂肪细胞分别处理0.5、2、6 h,免疫共沉淀结合Western blotting法检测SOCS-3、p-STAT1、p-STAT3蛋白表达.结果:瘦素未处理的脂肪细胞中有少量SOCS-3表达,在...     

阴道毛滴虫粘附蛋白65-3基因真核表达载体的构建与鉴定

目的构建并鉴定阴道毛滴虫粘附蛋白65-3基因的真核表达载体。方法Trizol试剂提取阴道毛滴虫株基因组总RNA,RT-PCR扩增粘附蛋白65-3基因,定向克隆入pMD-18T线性质粒,重组子经双酶切、PCR鉴定及测序分析。鉴定正确的重组质粒pMD-18T-ap65-3和peDNA3．1（．＋）空质粒径BamHI和XhoI限制性内切酶双酶切后,凝胶电泳纯化回收目的片段,将粘附蛋白65-3基因亚克隆入peDNA3．1（＋）载体并进行筛选和鉴定。结果成功克隆出阴道毛滴虫粘附蛋白65-3基因,序列分析发现该基因的开放阅读框长为1704bp,与GenBank上公布的粘附蛋白65-3基因序列比较,同源性高达99．6％,经PCR鉴定,限制性酶切鉴定及测序鉴定,正确构建出重组质粒peDNA3．1-ap65-3。结论成功克隆出粘附蛋白65-3基因并构建出真核表达质粒pcDNA3．1-ap65-3,为进一步研究该基因的功能及滴虫的致病机制奠定实验基础。     

人GM-CSF基因真核表达载体构建与表达

【目的】构建以基因佐剂hGM-CSF基因为基础的真核表达质粒pIGM-CSF,并在宫颈癌细胞HeLa中表达与鉴定。【方法】采用聚合酶链反应从载体pORF-hGM-CSF中,扩增出hGM-CSF基因,克隆到双顺反子真核表达载体pIRES的多克隆位点B（MCSB）中,构建pIGM-CSF真核表达载体。然后采用脂质体转染法将其转染HeLa细胞,用RT-PCR在RNA水平和ELISA在蛋白水平检测其在真核细胞中的表达。【结果】所克隆hGM-CSF基因片段经测序完全正确;重组质粒转染Hela细胞后,检测有hGM-CSF表达。【结论】成功构建含基因佐剂真核表达载体pIGM-CSF,并在宫颈癌细胞中能有效表达,为继续克隆目的抗原从而构建双顺反子真核表达质粒奠定了基础。     

凋亡抑制蛋白Livin真核表达载体的构建及表达

目的:构建凋亡抑制蛋白Livin真核表达载体pIRES2-AcGFP-Livin。方法:设计合成扩增Livinα和Livinβ基因全长cDNA序列的特异性PCR引物,以食管鳞状细胞癌EC9706细胞总RNA为模板,进行RT-PCR,将获得的cDNA序列克隆入T载体,再用BglⅡ和EcoRⅠ双酶切,亚克隆入真核表达载体pIRES2-AcGFP,将重组质粒用脂质体包裹转染NIH3T3细胞,G418筛选得到稳定表达的细胞克隆,Western-blot检测转染细胞Livinα和Livinβ蛋白的表达情况。结果:构建了真核表达载体pIRES2-AcGFP-Livinα和pIRES2-AcGFP-Livinβ,测序分析证实插入序列正确;转染的NIH3T3细胞,可稳定表达Livinα或Livinβ蛋白。结论:成功构建Livinα和Livinβ真核表达载体。     

ZAK-β蛋白激酶基因真核表达载体的构建

目的 将人源ZAK-β基因定向克隆入MSCV-IRES-GFP质粒,构建真核表达载体pMSCV-IRES-GFP-ZAK-β.方法 以肺癌A549细胞的cDNA为模板,通过PCR得到ZAK-β特异性基因产物,克隆入真核表达载体pMSCV-IRES-GFP中,获得重组真核表达载体pMSCV-IRES-GFP-ZAK-β,测序验证.结果 扩增了ZAK-β基因,经双酶切、测序鉴定证实目的基因克隆到真核表达载体pMSCV-IRES-GFP中,测序结果与预测完全一致.结论 成功构建了ZAK-β逆转录病毒表达载体,为进一步研究ZAK蛋白激酶的功能奠定了基础.     

PreS-Tat真核表达载体的构建及表达

目的:构建pEGFP-PreS-Tat嵌合载体并在真核细胞中表达.方法:提取人乙型肝炎病毒并用PCR法扩增出PreS片段,定向克隆入pEGFP-C3载体,在PreS下游连接合成的Tat序列,构建成功的pEGFP-PreS-Tat质粒经脂质体转染Hela细胞,Western blot鉴定目的蛋白的表达.结果:酶切和测序结...     

抑癌基因FHIT真核表达质粒的构建

目的 构建抑癌基因FHIT真核表达质粒pHCMVsp1A-FHIT。方法 用限制性内切酶EcoRⅠ酶切抑癌基因FHIT的克隆载体pGEM-FHIT获得FHIT基因片段,长度为0.9kb,将其插入真核表达载体pHCMVsp1A CMV启动子的下游,用HindⅢ酶切鉴定FHIT基因插入方向。结果 PCR扩增及EcoRⅠ、HindⅢ酶切鉴定证实FHIT基因以正确方向插入表达质粒pHCMV1A中。结论 成功构建抑癌基因FHIT真核表达质粒pHCMVsp1A-FHIT,为研究FHIT的抑癌作用提供有效的分子工具。     

细胞因子信号转导抑制因子-3与缺血性脑血管病

SOCS蛋白家族中多个成员参与细胞因子信号内转导的调控,其中,细胞因子信号转导抑制因子-3（SOCS-3）在缺血性脑血管病特别是缺血后再灌注损伤中,对炎症细胞因子的表达起着负性调控的作用。SOCS-3在缺血性再灌注中表达的升高,有利于控制炎症因子的过度表达,防止神经功能损害,本文就SOCS-3与缺血性脑血管病的关系,及其在缺血性再灌注损伤的研究现状做一综述。     

pLC3-EGFP真核表达载体的构建与表达

目的 构建人微管相关蛋白轻链3(LC3)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合表达的真核表达载体(pLC3-EGFP)并在哺乳动物细胞中表达,为研究自噬的过程及机制提供实验基础.方法 应用RT-PCR从人胚肾细胞系HEK293T细胞中扩增全长LC3基因,将产物LC3 cDNA片段亚克隆入载体pEGFP-N3,筛选阳性克隆,提取质粒测序进行鉴定.将表达质粒pLC3 -EGFP转染HEK293T细胞,荧光显微镜观察融合蛋白在细胞内的表达与定位,westem blot检测LC3-EGFP蛋白的表达.结果 测序结果表明,从人胚肾HEK293T细胞中所获得的LC3 cDNAs含有378个碱基,与Genbank( NM 022818)序列完全一致.构建的重组真核表达载体pLC3-EGFP经鉴定证实LC3基因已完全正确亚克隆到pEGFP--N3;LC3-EGFP融合蛋白能够在HEK293T细胞中表达,并主要定位于细胞质中.结论 成功构建具有报告基因-增强绿色荧光蛋白基因的重组真核表达载体pLC3-EGFP并在HEK293T细胞中很好地表达,实验结果为研究细胞自噬的进程及机制提供了实验基础.     

Adipophilin真核表达载体的构建与表达分析

目的 构建能在真核细胞中表达的adipophilin表达质粒pcDNA3.1-HA-adi.方法 从培养的C57BL/6J小鼠血管平滑肌细胞提取总RNA,在PCR引物中加入HA序列,用RT-PCR及TOPO克隆技术得到HA-adi克隆栽体,测序后,把HA-adi定向插入pcDNATM3.1/myc-His(-)-C的多克隆住点.阳离子聚合物介导转染人THP-1巨噬细胞,用R.T-PCR及Western blot的方法检测目的 蛋白在细胞中的表达.结果 限制性内切酶酶切和DNA测序分析证实成功获得HA-adi基因片段,HA-adi准确克隆入pcDNATM3.1/myc-His(-)-C的多克隆位点.转染THP-1巨噬细胞后,检测到目的 蛋白的表达.结论 成功构建pcDNA3.1-HA-adi,并在THP-1巨噬细胞中得到表达.     

大鼠EAAT3真核表达载体的构建及在Hella细胞中的表达

目的:克隆大鼠谷氨酸转运蛋白3(EAAT3)的cDNA,构建其真核表达载体并转染Hella细胞.方法:从大鼠的脑组织中提取RNA,采用RT-PCR技术扩增EAAT3的基因编码区序列,将序列定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1( ). 经酶切及测序鉴定后用阳离子脂质体将其转染到Hella细胞中,通过免疫印迹法鉴定其表达.结果:经双酶切、测序鉴定证实EAAT3基因的真核表达载体构建成功.免疫印迹法证实EAAT3基因的表达.结论:成功克隆了EAAT3编码区序列,并构建了其真核表达载体,为以EAAT3为基础的中枢神经系统疾病的治疗奠定了基础.     

人重组pcDNA3人钠/碘同向转运体核表达质粒的构建

目的:获取、构建并鉴定携带人钠/碘同向转运体(hNIS)基因的pcDNA3.0质粒载体。方法:利用逆转录和聚合酶链反应获取Graves甲亢患者甲状腺NIS基因可编码区片段。与pUCm-T质粒载体连接、经转化、蓝白斑筛选、酶切鉴定,序列测定鉴定,获得pUCm-T-重组质粒。pUCm-T-重组质粒亚克隆得到pcDNA3-hNIS重组质粒。结果:所构建的pcDNA3-hNIS重组质粒中的hNIS基因序列与文献报道序列一致。结论:成功构建pcDNA3-hNIS重组质粒。     

诱导性鼠Smad7真核表达载体的构建与鉴定

目的构建四环素诱导性鼠Smad7真核表达载体。方法采用常规分子生物学方法,抽提SD大鼠肾脏总RNA,RT-PCR获得鼠Smad7 cDNA,再定向克隆于四环素诱导性真核表达载体pBI-L多克隆位点MeI和HindⅢ之间,限制性内切酶酶切和测序鉴定。结果重组pBI-L-Smad7真核表达载体经限制性内切酶酶切分析和测序分析,与理论值相符。结论本实验成功构建鼠Smad7四环索诱导性真核表达载体pBI-L-Smad7,为今后临床开展组织器官纤维化Smad7基因治疗奠定实验基础。     

进展期结直肠癌合并的低蛋白血症与癌组织中细胞因子信号转导抑制因子-3表达的相关性研究

目的 研究细胞因子信号转导抑制因子-3(suppressor of cytokine signaling-3,SOCS-3)在进展期结直肠癌低蛋白血症发病中的作用及意义.方法 根据入院第2天用溴甲酚绿法(bromcresol green,BCG)测量空腹血白蛋白(Albumin,Alb)的浓度,将63例进展期结直肠癌组织分为两组:低蛋白血症组(Alb<35g/L)38例及非低蛋白血症组(Alb≥35g/L)25例,应用RT-PCR半定量的方法捡测socs-3 mRNA在低蛋白血症组以及非低蛋白血症组中的表达.结果 SOCS-3 mRNA在低蛋白血症组癌组织中的阳性表达率较非低蛋白血症组高,差异有统计学意义(P<0.05).结论 SOCS-3在进展期结直肠癌低蛋白血症的发生及发展中起到重要作用.     

野生型MLK3真核表达载体的构建及其表达

目的构建野生型MLK3真核表达质粒并转染至COS-7细胞中表达。方法以大鼠海马总RNA为模板,通过RT-PCR分段扩增MLK3的序列,采用酶切、链接的方法先将目的基因克隆至pGEM-T,筛选正确的质粒后,再亚克隆至pcDNA3.1（＋）。以脂质体转染法将构建好的重组质粒转染至COS-7细胞,通过免疫印迹鉴定重组质粒的表达。结果限制性内切酶酶切和测序结果表明,扩增出的野生型MLK3的序列正确。免疫印迹显示,转染的重组质粒在相对分子质量92×103处有相应条带出现。结论成功构建了MLK3的真核表达质粒,重组质粒在COS-7细胞中高效表达。