谷胱甘肽与N-乙酰半胱氨酸对谷氨酸诱导海马神经元损伤的影响

目的观察还原型谷胱甘肽(reducedglutathione,GSH)与N-乙酰半胱氨酸(N-Acetylcysteine,N-NAC)对不同浓度谷氨酸(glutamate,Glu)诱导的海马神经元损害的影响。方法选用新生Wistar大鼠原代培养海马神经元谷氨酸细胞毒性模型,采用台盼蓝活细胞拒染及TUNEL细胞凋亡原位检测等方法比较GSH与NAC对100μmol/L及500μmol/LGlu细胞毒性损伤的影响,并与MK-801比较。结果GSH与NAC能够降低100μmol/LGlu作用下神经元死亡率与凋亡率,NAC组细胞存活率高于同条件下GSH组,其中1mmol/LNAC组神经元存活率达到90.4%±5.2%,与10μmol/LMK-801组相比,差异无统计学意义;在500μmol/LGlu作用下,GSH与NAC则不能增加神经元的存活率,但1mmol/LNAC抗500μmol/LGlu诱导调亡的作用与MK-801相比无明显差异。结论GSH及NAC对轻度Glu细胞毒性神经损伤有保护作用。     

一种稳定阿尔茨海默病细胞模型的建立方法

目的旨在应用不同浓度Aβ_(1-42)诱导新生SD大鼠海马神经元,建立稳定阿尔茨海默病细胞模型。方法分离并培养新生24 h内SD大鼠原代海马神经细胞;分别加入不同浓度Aβ_(1-42)诱导,诱导后采用MTT法观察细胞活力,选取理想Aβ_(1-42)诱导的海马神经细胞作为阿尔茨海默病细胞模型;通过免疫荧光技术(IF)鉴定神经元特异性烯醇化酶(NSE)在海马神经元细胞的表达。结果 Aβ_(1-42)诱导后的海马神经细胞存活率下降,可导致海马神经元细胞胞体变形、收缩和细胞膜完整性破坏,胞间网络结构消失或断裂,细胞外基质乱不清,神经元大量凋亡;Aβ_(1-42)诱导后的海马神经细胞存活率下降与Aβ_(1-42)浓度成线性关系;加入不同浓度Aβ_(1-42)(0μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L、40μmol/L和50μmol/L)后实验各组细胞存活率分别为(100.00±0.00)%、(98.55±1.42)%、(90.37±3.25)%,(66.34±2.76)%、(53.23±3.41)%和(41.55±2.37)%,其中20μmol/L组与0μmol/L组相比P<0.05,30μmol/L、40μmol/L和50μmol/L组与对照组相比P<0.01。结论 Aβ_(1-42)可导致海马神经元大量凋亡;Aβ_(1-42)浓度为20μmol/L诱导的SD大鼠海马神经元可作为理想的阿尔茨海默病细胞模型。     

β-细辛醚对谷氨酸诱导损伤的脑皮层神经元凋亡线粒体膜电位和超微结构的影响

目的探讨β-细辛醚对谷氨酸(Glu)诱导损伤的脑皮层神经元凋亡、线粒体膜电位(mitochon-drial membrane potential,MMP)和超微结构的影响。方法体外培养乳鼠脑皮层神经元,β-细辛醚(7.5、15、30μg/ml)预给药4h,荡洗后加入终浓度为40mmol/L的Glu继续培养16h,采用流式细胞仪检测细胞凋亡率、MMP,并用透射电镜观察超微结构的变化。结果40mmol/L Glu组凋亡率明显增加(P<0.01),7.5、15、30μg/mlβ-细辛醚均能不同程度地抑制皮层神经元凋亡,30μg/mlβ-细辛醚抑制神经元凋亡的作用较7.5、15μg/mlβ-细辛醚明显(P<0.01),10μmol/L尼莫地平与30μg/mlβ-细辛醚抑制凋亡的作用相当(P>0.05);40mmol/L Glu组MMP明显低于正常对照组(P<0.01),10μmol/L尼莫地平组和30μg/mlβ-细辛醚组MMP明显高于40mmol/LGlu组(P<0.05,P<0.01),而与正常对照组比较无明显差别(P>0.05);电镜下40mmol/LGlu组的脑皮层神经元见染色质边聚、线粒体肿胀、部分内质网扩张,而30μg/mlβ-细辛醚组神经元则仅见少量内质网扩张、线粒体轻度肿胀。结论β-细辛醚可抑制Glu诱导的脑皮层神经元凋元,其作用机制可能与稳定细胞线粒体膜电位有关。     

刺五加皂甙对谷氨酸毒性神经元凋亡的保护作用

目的观察神经元在谷氨酸毒性损伤时一氧化氮(NO)的动态变化及其与凋亡的关系,探讨刺五加皂甙(ASS)的有效保护浓度。方法采用谷氨酸(Glu)诱导的皮质神经元凋亡模型。随机分成Glu组、正常对照组及ASS3组;用流式细胞仪检测神经元凋亡率,用硝酸还原酶法测定细胞培养上清液中NO的含量,用MTT法测定神经元存活率并在电镜下观察细胞形态学变化。结果(1)Glu呈剂量和时间依赖性增加神经元培养液中NO含量,ASS能不同程度地减少NO含量;(2)与Glu共培养的神经元,其存活率呈剂量和时间依赖性下降,ASS能增加神经元存活率;(3)经Glu处理的神经元发生凋亡,细胞超微结构呈现凋亡样改变,其凋亡率与正常对照组比较有显著性差异(P<0.01)。ASS能减少Glu毒性神经元凋亡。结论NO介导了Glu毒性神经元凋亡,ASS可能通过抑制NO的释放及其神经毒性作用,拮抗Glu引起的神经元凋亡。     

鼠骨髓间充质干细胞对神经元凋亡的影响

目的探讨体外培养鼠骨髓间充质干细胞对谷氨酸诱导大脑皮质神经元凋亡的影响。方法分离、培养、传代Wistar大鼠骨髓间充质干细胞，细胞融合达90％时更换培养基，继续培养24h，收集细胞培养液即为骨髓间充质干细胞条件培养基；培养新生Wistar大鼠大脑皮质神经元，第8d随机分为对照组、谷氨酸损伤组和骨髓间充质干细胞条件培养基处理组。采用台盼蓝染色计算神经元存活率，同时用流式细胞仪和透射电镜技术检测各组神经元凋亡情况。结果谷氨酸（0．8mmol／L）可诱导细胞凋亡，骨髓间充质干细胞条件培养基处理组较谷氨酸损伤组细胞成活率明显升高（P〈0．001）；流式细胞仪检测见骨髓间充质干细胞条件培养基处理组细胞凋亡率明显降低（P〈0．001）；而电镜检测发现对照组无明显的凋亡细胞，谷氦酸组有典型凋亡神经元，骨髓间充质干细胞条件培养基处理组凋亡细胞数明显减少。结论骨髓间充质干细胞条件培养基对谷氨酸神经元毒性具有拮抗作用。     

刺五加皂甙对神经元谷氨酸毒性损伤的保护作用

目的:观察不同谷氨酸浓度和谷氨酸作用不同时间对神经元活性的影响,探讨细胞损伤后刺五加皂甙(ASS)的有效保护浓度。方法:取孕13～15dICR小鼠,无菌条件下对胎鼠大脑皮层神经元进行原代分离培养,建立谷氨酸诱导的皮层神经元损伤模型。用MTT、LDH测定神经元活性,用硝酸还原酶法测定细胞培养上清液中NO的含量,用流式细胞仪检测细胞凋亡率,并在电镜下观察细胞形态学变化。结果:①经谷氨酸处理的神经元,其细胞存活率呈剂量和时间依赖下降、ASS能不同程度提高细胞存活率。②谷氨酸处理组的神经元凋亡率、LDH释放量和NO含量均升高,与正常对照组及ASS组比较有明显差异(P<0.01)。结论:一定浓度的ASS对谷氨酸引起的神经元损伤有保护作用;ASS可能是通过抑制NO的释放和稳定细胞膜,拮抗细胞元损伤。     

Aβ25-35寡聚体对大鼠海马神经细胞的活性影响及形态学观察

目的 研究以β淀粉样蛋白(Aβ25-35)损伤原代培养海马神经元建立Alzheimer病(AD)细胞模型的方法.方法 运用细胞原代培养的方法培养大鼠海马神经元并进行鉴定,以不同浓度Aβ25-35寡聚体建立海马神经元损伤模型,将培养的细胞分为Aβ25-35寡聚体致伤高、中、低剂量组,同时设立正常对照组,倒置显微镜观察细胞形态学变化及通过四唑盐(MTT)比色实验检测细胞存活率.结果 当Aβ25-35寡聚体终浓度为5.0 μmol/L、10.0μmol/L、20.0μmol/L时,作用于细胞24h,可使神经细胞的形态发生改变和活力显著下降,在显微镜下可见神经元形态有明显的变化,失去贴壁能力或易脱落、突起变短、细胞存活率明显下降,与对照组相比较差异有显著性(P＜0.01).结论 Aβ25-35寡聚体可导致原代培养海马神经元变性、死亡,且有剂量依赖关系,可用于构建AD的细胞模型;并筛选出5.0μmol/L Aβ25-35寡聚体为AD模型的适宜致伤浓度.     

骨髓间充质干细胞对酒精诱导海马神经元损伤的作用研究

目的通过体外观察骨髓间充质干细胞(BMMSC)对酒精诱导海马神经元损伤的作用,初步探讨BMMSC治疗酒精性痴呆(AAD)的可行性。方法取胎鼠海马进行原代神经元培养并进行神经元纯度鉴定。酒精组给予100mol/L酒精37℃培养24h,建立酒精诱导海马神经元损伤模型;BMMSC+酒精组在其培养液中同时加入BMMSC条件培养液(终浓度为50%)及100mol/L酒精,37℃培养24h;另设相同浓度的BMMSC条件培养液对照组(BMMSC组)及空白对照组(对照组)。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测各组细胞存活率,以碘化丙啶(PI)/Hoechst33342染色观察细胞形态及凋亡情况。结果原代培养的海马神经元高表达神经元特异性烯醇化酶(NSE),低表达神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP),提示成功培养了纯度较高的原代海马神经元。酒精组细胞存活率(0.80±0.09)低于对照组(1.00±0.11;t=4.128,P0.01)及BMMSC组(1.04±0.07;t=-6.052,P0.01);BMMSC+酒精组细胞存活率(0.92±0.11)高于酒精组(t=2.555,P0.05)。BMMSC组及BMMSC+酒精组细胞存活率与对照组比较差异无统计学意义(均P0.05)。酒精组可见较多的细胞核呈致密浓染及核碎裂的凋亡细胞,BMMSC+酒精组的凋亡细胞数量明显减少。结论 BMMSC可抑制酒精诱导的海马神经元凋亡发生,提示BMMSC移植治疗AAD可能具有一定可行性。     

雷沙吉兰(Rasagiline)对Aβ25-35诱导PC12细胞凋亡的防护作用

目的探讨雷沙吉兰(Rasagiline)对β-淀粉样蛋白(Aβ)诱导PC12细胞损伤阿尔茨海默病(AD)模型的保护作用及其机制。方法不同浓度的Aβ25-35(1μmol/L,10μmol/L,20μmol/L)作用于PC12细胞48h,MTT法检测细胞存活率,选用使细胞存活率降低到64%的Aβ浓度20μmol/L。用不同浓度的雷沙吉兰(0.1μmol/L,1μmol/L,10μmol/L)预孵育PC12细胞1h,再加入20μmol/L的Aβ共孵育48h,再测MTT活性,并用荧光染料丫啶橙和溴化乙啶染色,在荧光显微镜下计数凋亡细胞检测凋亡细胞百分率。结果Aβ在20μmol/L时使PC12细胞存活率降低至64%,与对照组差异显著,1μmol/L的雷沙吉兰可显著提高细胞存活率至85%。对照组细胞凋亡率为2%,20μmol/L Aβ作用48h后,PC12细胞凋亡率达13%,1μmol/L的雷沙吉兰使20μmol/L Aβ诱导的PC12细胞凋亡率下降到5%。结论雷沙吉兰对Aβ引起的PC12细胞损伤具有明显的保护作用,其机制可能与抑制Aβ诱导的凋亡有关。     

慢性脑缺血大鼠海马中APE的表达与神经元凋亡的实验研究

目的研究慢性脑缺血大鼠海马中DNA损伤修复相关蛋白脱嘌呤／脱嘧啶核酸内切酶／氧化还原因子-1(APE／Ref-1)的活性变化与神经元的凋亡,并探讨两者之间的相关性。方法成年雄性Wistar大鼠40只,随机分为假手术组,持久性双侧颈总动脉结扎(2-VO)1周组、3周组、8周组,每组各10只,用Western blotting检测其APE蛋白表达水平的变化,并用流式细胞仪定量检测海马神经元的凋亡程度。结果 2-VO 1周组APE蛋白的表达量明显下降,与对照组相比差异有显著性(P<0．01), 随后其蛋白表达水平逐渐上升,但仍低于对照组水平(P<0．05);用流式细胞仪检测各组的凋亡率发现 2-VO 1周组、3周组凋亡率较高,与对照组相比差异有显著性(P<0．01)。结论慢性脑缺血早期DNA 修复蛋白APE活性下降,同时其神经元凋亡率较高,后期蛋白表达水平逐渐上升,神经元的凋亡程度也逐渐下降,表明DNA损伤与修复失衡所致的神经元凋亡是慢性缺血性脑损伤发病的重要机制。