结核分支杆菌耐喹诺酮等四种耐药基因检测的临床应用和评价

目的：采用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR—SSCP)检测结核分支杆菌耐药基因(rPOB、katG、rPSL和gyrA)，评估它的临床应用价值。方法：通过Bactec-960快速培养，利用PCR-SSCP和药物敏感试验了解96例肺结核病人结核分支杆菌耐药情况，分析临床治疗效果。结果：利福平、异烟肼、链霉素和喹诺酮类耐药率分别为59．4％、52．1％、62．5％和51．0％。分离株rPOB、katG、rPSL和gyrA基因突变率分别为57．3％、45，8％、58，3％和47．9％，药敏试验联合耐药基因检测指导治疗效果满意。结论：结核分支杆菌耐药与基因突变有关，耐药基因检测指导治疗是一种新探索，与药敏试验联合应用可互相弥补，可成为临床指导用药的好方法。     

结核分枝杆菌km基因的突变情况分析

目的探讨结核分枝杆菌km基因突变的情况。方法通过传统梯度药敏试验和聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)分析248株分枝杆菌临床分离株耐药情况和km基因的变化。结果药敏试验耐药率为32.7%(81/248),248株分枝杆菌临床分离株的16S rDNA SSCP电泳图谱均与结核分枝杆菌标准株相同。81株耐卡那霉素分离株中,24株(29.6%)km基因SSCP泳动异常。结论其部分耐药原因可能是由于T.M耐KM药物的km基因突变所致。     

鲍氏不动杆菌对喹诺酮类药物的耐药机制及菌株同源性分析

目的探讨鲍氏不动杆菌对喹诺酮类药物耐药机制及菌株同源性分析。方法收集临床分离的喹诺酮类耐药鲍氏不动杆菌25株,采用纸片扩散法（K-B）检测其对常规药物的敏感性;采用聚合酶链反应（PCR）检测喹诺酮类耐药相关基因gyrA和parC基因,并经限制性内切酶酶切及测序方法验证;基因外重复回文序列（REP）-PCR分析菌株同源性。结果 25株鲍氏不动杆菌对12种抗菌药物呈现出多重耐药,仅对米诺环素和阿米卡星敏感,敏感率分别为48.0%和32.0%,对多黏菌素B全部敏感[最低抑菌浓度（MIC）≤2μg/mL];所有菌株检出gyrA和parC基因,25株菌株均存在gyrA基因第83位密码子TCA→TTA突变（Ser→Leu）,23株菌株存在parC基因第80位密码子TCG→TTG突变（Ser→Leu）,2株菌株存在parC基因第84位GAA→GGA突变（Glu→Gly）;REP-PCR显示,所测菌株具有很高的同源性。结论耐喹诺酮类鲍氏不动杆菌具有很高的同源性,存在gyrA和parC基因突变位点。     

耐左氧氟沙星结核分枝杆菌gyrA基因上新的突变位点

目的:分析耐左氧氟沙星结核分枝杆菌临床菌株gyrA基因的突变情况及其耐药机制.方法:用聚合酶链反应(PER)和DNA直接测序技术(DS)测定64株耐左氧氟沙星结核分枝杆菌gyrA基因的QRDR(quinolone resistance-determining regions)序列.结果:64株耐药菌株有47株QRDR序列发生突变,其中45株为单位点突变,另2株为双位点突变;突变分布为70位突变2株、89位1株、90位12株、91位4株、94位30株,其中70位和89位为新发现的突变位点.结论:结核分枝杆菌喹诺酮类药物耐受现象与gyrA基因QRDR的突变有关,包括新发现的70位和89位突变.     

应用不同引物检测耐氧氟沙星结核分枝杆菌gyrA基因点突变对结果判定的影响

目的探讨以PCR-SSCP技术为基础,应用不同引物检测耐氧氟沙星结核分枝杆菌gyrA基因点突变以及固定/终止液的组成对判定结果可能会产生的影响。方法采用2对引物,经PCR-SSCP检测,利用银染显色的方法显现耐氧氟沙星结核分枝杆菌gyrA基因点突变的DNA单链位移。结果对比标准株H37Rv及H37Ra gyrA基因的单链带位置,在被测试的89株菌株中发生位置变化的;对氧氟沙星的耐药程度〉10μg/ml的分别有4株与14株,约占89株检测总数的4.49%和87.5%,对氧氟沙星的耐药程度介于≥2且≤10μg/ml之间的26株中,有与标准株gyrA基因的单链带位置发生改变的分别有20株与7株,约占89株检测总数的22.47%和7.87%;对氧氟沙星的耐药程度〈2μg/ml的47株中分别有2株与11株,约占89株检测总数的2.25%和12.36%。用含5.0%乙醇和4.5‰冰醋酸配比的固定/终止液可为利用银染法显现核酸凝胶分离DNA提供温和的反应环境,操作过程方便,观测效果较为理想。结论应用不同引物检测耐氧氟沙星结核分枝杆菌gyrA基因点突变会对结果的判定产生影响,采用含5.0%乙醇、4.5‰冰醋酸的固定/终止液可为应用非变性聚丙烯酰胺凝胶分离核酸检测的银染着色法提供温和的反应环境,并产生清晰可辨的被检测标本的DNA单链条带。     

结核分枝杆菌对氧氟沙星的耐受程度与gyrA基因突变的相关性分析

目的以氧氟沙星为例,探讨阈值的划分对实验室早期检测出耐氧氟沙星结核分枝杆菌的影响。结合DNA序列分析探讨gyrA基因点突变与结核分枝杆菌对氧氟沙星耐受程度的相关性。方法 （1）在含氧氟沙星改良罗氏培养基上检测101株结核分枝杆菌临床分离株对氧氟沙星的敏感性。（2）测序以检测耐氧氟沙星结核分枝杆菌gyrA基因点突变的特征。结果 （1）52株耐氧氟沙星5.0μg/ml的临床分离株中,17株能在含氧氟沙星10.0μg/ml的改良罗氏培养基上生长（约占32.69%）,49株对氧氟沙星5.0μg/ml敏感的临床分离株中,有2株能在含氧氟沙星2.0μg/ml的改良罗氏培养基上生长（约占4.08%）。（2）基因扩增产物测序发现;耐氧氟沙星结核分枝杆菌gyrA基因点突变主要发生第90、91和94位点上,有10株在不同的gyrA基因位点上发生了碱基缺失或插入的变异,101株被检测的结核分枝杆菌临床分离株中,发生在第95位点的碱基突变率为100%。结论 （1）判定耐药结核分枝杆菌上、下限的阈值对耐药结核菌的早期检出具有重要的作用。（2）发生在耐氧氟沙星结核分枝杆菌gyrA基因上的点突变是多变的,但与结核分枝杆菌对氧氟沙星的耐受程度没有明显的相关性。     

肺结核病人痰标本中结核分枝杆菌检查结果分析

[目的]评价肺结核病人痰标本中结核分枝杆菌的直接涂片显微镜检和培养检查的临床效果。[方法]采用直接厚涂片萋-尼氏法抗酸染色显微镜检和BACTEC-TB960快速培养系统对1340例肺结核病人痰标本进行检测。[结果]快速培养法检测的阳性率为36.6％，直接涂片镜检的阳性率为24.6％，两种检测法的阳性率有显著性差异（P〈0.01）；两种方法联合检测的阳性率为4l％，高于培养法阳性率（P〈0.05）。痰标本的留取时间对培养法检出率有很大影响，晨痰检出率高于即时痰（P〈0.05）。[结论]提高肺结核病人痰标本中结核分枝杆菌检出率的有效方法是采用直接涂片镜检与培养法联合进行检测，同时应重视痰标本留取时间对检出率的影响。     

噬菌体裂解法快速检测痰中结核分枝杆菌的研究

目的探讨噬菌体裂解法快速检测痰中结核分枝杆菌对肺结核的诊断价值。方法对60例肺结核患者及16例对照组痰标本进行噬菌体裂解试验,并与浓缩涂片法、罗氏培养法相比较。结果噬菌体裂解法特异性100%,阳性率71.7%(43/60)与浓缩涂片法20%(12/60)罗氏培养法43.3%(26/60)相比差别有极显著意义(X2=32.2P<0.01,X2=9.86P<0.01)结论噬菌体裂解法检测痰中结核分枝杆菌,对肺结核具有很高的快速诊断价值。     

结核分枝杆菌耐氧氟沙星临床分离株gyrA基因突变的研究

目的了解结核分枝杆菌(MTB)临床分离株对氧氟沙星的耐药性与gyrA基因突变的关系。方法对20株随机筛选的耐氧氟沙星MTB临床分离株行gyrA基因喹诺酮类药物耐药决定区(QRDR)序列测定。结果18株发现了有义突变,其中2株第91位密码子由TCG(丝氨酸)→CCG(脯氨酸),3株第90位密码子由CCG(甘氨酸)→GTG(缬氨酸),10株第94位密码子由GAC(天冬氨酸)→GGC(赖氨酸),2株第94位密码子由GAC(天冬氨酸)→GCC(甘氨酸),1株第94位密码子由GAC(天冬氨酸)→GTC(缬氨酸)。6例既往未应用过氟喹诺酮类药物抗结核治疗,2例曾在结核诊断前应用氟喹诺酮类药物经验性抗感染治疗1周,12例曾应用氟喹诺酮类药物抗结核治疗。结论gyrA基因突变是MTB对氟喹诺酮类药物产生耐药的机制之一;gyrA基因的有义突变主要发生在第90位、91位、94位密码子上。     

两种结核分枝杆菌抗原在结核病血清学诊断中应用价值的比较

目的研究结核分枝杆菌脂多糖抗原(LAM)和结核分枝杆菌重组38KD蛋白抗原(r38KD)在结核病血清学检测中的效果,探索更有价值的结核血清学诊断方法。方法应用酶联免疫吸附试验对100例结核病患者血清、100例健康人血清中的抗结核抗体进行检测,并对检测结果进行统计分析。结果结核组中抗LAM抗体和抗38KD抗体均显著高于非结核对照组(P0.05),且两种抗原对结核病检测具有互补性。结论将LAM和38KD两种不同的结核分枝抗原进行组合可提高检测的特异度,有利于结核病的血清学诊断。     

聚合酶链反应杂交梳法鉴定结核杆菌

目的:探讨一种快速、简便、特异性较强的结核菌鉴定方法。方法:采用聚合酶链反应(PCR)结合反向探针膜杂交对痰液标本中的结核杆菌的特异性DNA片段进行检测。结果:32例阳性标本经过聚合酶链杂交结果与常规鉴定结果相符。结论:聚合酶链反应杂交梳法鉴定结核杆菌简便、快速、特异性强,有较高的临床应用推广价值。