骨髓基质干细胞与聚丙交酯/乙交酯/天冬氨酸/聚乙二醇体外复合培养的实验研究

目的探讨骨髓基质于细胞（marrow stromal stem cells，MSCs）与聚丙交酯／乙交酯／天冬氨酸／聚乙二醇[poly（lactic acid／glycolic acid／asparagic acid—co—polyethylene glycol），PLGA—ASP—PEG]的生物相容性，为构建组织工程骨进行骨缺损修复提供理论基础，以及为组织工程支架材料的优化提供实验依据。方法本体开环共聚法合成PLGA—ASP—PEG三嵌段共聚物。取4周龄新西兰大白兔骨髓，体外分离培养MSCs。将第3代MSCs以1．0×10^6／ml接种到PLGA—ASP—PEG材料上，测定细胞黏附力和黏附率；扫描电镜观察细胞的形态学特征；MTT法检测细胞增殖；流式细胞仪检测细胞周期、增殖指数、DNA指数及凋亡；通过考马斯亮蓝测定法和^3H-脯氨酸掺入实验观察细胞的蛋白合成和胶原合成情况。以PLGA支架材料作为对照。结果MSCs在PLGA—ASP—PEG支架材料上贴附、生长良好，其黏附、增殖和蛋白、胶原合成能力均显著高于PLGA组（P〈0.05），细胞凋亡率显著低于PLGA组（P〈0.05）。DNA指数显示两组细胞均为正常的二倍体细胞。结论PLGA—ASP—PEG的生物学性能与PLGA相比得到显著改善和提高，可作为MSCs的理想载体构建组织工程骨进行骨缺损修复研究。     

明胶-硫酸软骨素-透明质酸钠载体制备及复合骨髓基质干细胞成软骨的实验研究

目的探索明胶-硫酸软骨素-透明质酸钠多孔载体作为新型组织工程软骨载体的可行性。方法观察-80℃冷冻抽真空干燥制备的明胶-硫酸软骨素-透明质酸钠载体的孔径、孔隙率、交通孔和密度;分离、扩增兔骨髓基质干细胞(MSCs),MTT检测MSCs在载体上的黏附率及多孔载体对细胞增殖功能的影响;兔MSCs经转化生长因子β1(TGF-β1)诱导7d后免疫组化检测Ⅱ型胶原、S-100蛋白表达;诱导后的MSCs与载体复合后植入裸鼠肌袋内,分别于术后2、4周取材进行组织学观察。结果载体孔径为230±30μm,孔隙率为79%,密度为11.50±0.36(μg/mm3);细胞在载体上黏附率87.5%;载体可轻度促进MSCs增殖;经TGF-β1诱导7d后MSCsⅡ型胶原、S-100蛋白免疫组化染色阳性;诱导后的MSCs在体内生长增殖良好,4周时可见新生软骨组织形成。结论该载体具有良好的孔径、孔隙率,与MSCs具有较好的相容性,是软骨组织工程中的一种新型仿生载体。     

靶向性非病毒载体K16GRGDSPC寡肽的合成及转染骨髓基质干细胞的研究

目的设计合成新型靶向性非病毒载体K16GRGDSPC寡肽,探讨其作为载体介导外源基因转染骨髓基质干细胞(BMSCs)的可行性。方法用固相合成法合成K16GRGDSPC并用质谱仪和高压液相色谱仪进行检测。以其作为载体转染增强型绿色荧光蛋白质粒pcDNA3-EGFP并计数转染效率；转染转化生长因子(TGF)-β1质粒pcDNA3-TGF-β1并通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和TGF-β1敏感细胞株水貂肺上皮细胞(MV1)生长抑制法检测目的基因TGF-β1稳定表达情况及表达产物的生物学活性。结果质谱图显示合成肽的平均分子量为2741．3307 m/z,与理论上计算的平均分子量一致。高压液相色谱仪示合成肽的纯度为94%～95%,满足试验需求。以K16GRGDSPC寡肽为载体转染BMSCs的效率为(18．6±2．1)%,与脂质体(Lipofectamine)介导转染的效率(19．3±2．3)%差异无统计学意义(P＞0．05)；转染TGF-β1基因阳性细胞克隆经RT- PCR扩增有特异性产物,TGF-β1敏感细胞株MV1的增殖受到明显抑制,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0．05)。结论所合成的肽是设计的K16GRGDSPC寡肽,以其为载体介导外源基因转染BMSCS是确实可行的,为下一步构建载基因仿生基质材料奠定了基础。     

聚羟基烷酸酯与绵羊骨髓基质干细胞相容性的研究

目的评价聚羟基烷酸酯(PHBV)作为组织工程支架与绵羊骨髓基质干细胞(BMSCs)的生物相容性。方法原代培养绵羊BMSCs,传至2～3代后,接种至PHBV膜和泡沫样三维支架上,光镜和扫描电镜观察细胞形态,计数1、2、6 h时的细胞黏附率;并以接种至培养板上细胞为对照组,每日细胞计数,绘制生长曲线;按培养液量与支架体积10 mL／cm3为标准浓度制备浸提液,并制备标准浓度1／16～16倍的浸提液,以MTT法检测细胞毒性;流式细胞仪分析接种到材料上的细胞周期,计算增殖指数;BMSCs接种于PHBV三维支架上4、8、12 d,以Hoechst33258荧光法定量测定细胞内DNA含量, BCA法测定蛋白质含量。结果第3代BMSCs接种至PHBV膜上2 h后即大部黏附,黏附率75．6％,与对照组相比差异无统计学意义,绘制生长曲线见细胞生长与对照组无差异;MTT法检测见9个浓度梯度的浸提液毒性均为0级;光镜和扫描电镜观察见细胞接种于PHBV膜上2 h后大部分黏附,3 d后伸展良好,呈纺锤形或梭形,在三维支架的孔隙内立体生长,1周开始细胞间连接,3周广泛连接,分泌大量基质;流式细胞分析见接种于材料上的细胞周期无变化;接种至PHBV三维支架上的细胞内DNA、蛋白质浓度与对照组比较无差异。结论PHBV作为BMSCs的组织工程支架材料,具有良好的生物相容性。     

重组pcDNA3.1-hBMP-7真核表达载体的构建及转染兔骨髓基质干细胞的实验研究

[目的]构建人骨形态发生蛋白-7（human bone morphogenetic protein-7，hBMP-7）基因真核表达载体，评价其转染兔骨髓基质干细胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）的诱导成骨能力。[方法]从人类胎盘组织中克隆出hBMP-7基因，与真核表达载体pcDNA3．1连接，成功构建了重组pcDNA3．1-hBMP-7真核表达载体；从兔骨髓中分离培养BMSCs，分为3组：ApcDNA3，1-hBMP-7转染组；B空载体pcDNA3．1转染组；C未转染组。使用RT-PCR、免疫组织化学等方法检测hBMP-7在BMSCs中的表达。检测各组细胞碱性磷酸酶，胶原，骨钙蛋白合成情况。[结果]RT．PCR、免疫组织化学检测显示经hBMP-7转染的BMSCs中有BMP-7表达。经hBMP-7转染BMSCs的碱性磷酸酶于转染后第2d显著增高，到第8d达到最高；经hBMP-7转染的BMSCs合成胶原、骨钙蛋白能力也显著提高，与转染空载体、未转染的BMSCs相比有显著性差异（P〈0.05）。[结论]成功构建了pcDNA3，1-hBMP-7真核表达载体；外源的hBMP-7基因可在兔BMSCs中充分、高效的表达，并且这种外源性hBMP-7基因具备了促进兔骨髓基质干细胞向成骨细胞转化的能力，这为hBMP-7的基因治疗提供了坚实的理论基础。     

复合rhBMP-2壳聚糖微球可注射磷酸钙骨水泥制备及成骨性能研究

[目的]研究复合重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)壳聚糖微球的可注射磷酸钙骨水泥的成骨性能,从而构建一种具有骨传导和骨诱导性的新型可注射性植骨材料.[方法]制备负载rhBMP-2壳聚糖微球磷酸钙骨水泥材料,并将单纯磷酸钙骨水泥和单纯壳聚糖微球磷酸钙骨水泥材料作为对照.检测负载rhBMP-2壳聚糖微球骨水泥的rhBMP-2体外释药.在体外将青山羊骨髓干细胞(MSCs)与3种材料浸提液共同培养,通过检测碱性磷酸酶活性和骨钙素含量评价MSCs成骨分化.在体内,将3种材料植入青山羊骨缺损模型,通过组织学检测研究复合材料成骨能力.[结果]rhBMP-2在1 d时的释放量为12.6%,随后呈持续缓慢释放.在培养7、14 d,负载rhBMP-2壳聚糖微球磷酸钙骨水泥复合材料浸提液可显著提高MSCs的ALP活性和骨钙素含量,差异有统计学意义(P<0.05).组织学显示负载rhBMP-2壳聚糖微球磷酸钙骨水泥复合材料的新骨形成均优于其他组.[结论]复合rhBMP-2壳聚糖微球的可注射磷酸钙骨水泥复合材料是一种有应用前景的新型可注射骨移植材料.     

骨髓基质干细胞复合纳米羟基磷灰石/聚乳酸修复节段性骨缺损

目的了解骨髓基质干细胞(MSCs)复合纳米羟基磷灰石/聚乳酸(n-HA/PLA)构建的组织工程骨修复节段性骨缺损的可行性。方法选择30只新西兰白兔,制作15mm长的双侧桡骨节段性骨缺损模型,实验根据植入不同材料分为A、B组,A组分为A1组和A2组,A1组于动物左侧桡骨缺损区植入组织工程骨,A2组于右侧植入单纯材料。B组分为B1组和B2组,B1组于动物左侧桡骨缺损区植入自体髂骨,B2组右侧为空白对照。术后4、8、16周取材,行X线检查、组织学观察、计算机图像分析和生物力学测定。结果术后4、8、16周各组骨缺损区均有新骨生成,成骨量随着时间的推移而增加。经X线、组织学和生物力学评估,A1组与B1组比较未见差异(P>0·05),A1组或B1组分别与A2组或B2组比较,成骨能力依次为:A1或B1>A2>B2(P<0·001,P<0·05)。结论MSCs复合n-HA/PLA构建的组织工程骨可作为自体骨的替代材料修复节段性骨缺损。     

骨髓基质细胞在藻酸盐凝胶中的生物学行为

目的：探讨骨髓基质细胞（Bone Marrow Stromal Cells,MSC)在海藻酸盐（Alginate)中的生物学行为，为在组织工程研究中选用海藻酸盐做为骨髓基质细胞的载体提供理论依据。方法：将地塞米松诱导后的骨髓基质细胞种植在1%海藻酸盐中，以HE染色，BMP-2免疫组化染色，扫描电镜观察骨髓基质细胞在凝胶中的生物学行为。结果：凝胶中细胞呈“悬浮”生长状态，可见到细胞分裂和核分裂相；细胞在凝胶中增殖，4d后可以见到基质分泌；海藻酸盐中培养组与常规培养组MSC的BMP-2阳性表达率无显著差异。结论：在海藻酸盐中骨髓基质细胞的生物学行为表现良好。此特征适宜作为骨组织工程的载体。     

骨髓间充质干细胞复合聚乳酸-羟基乙酸材料治疗大鼠神经损伤的实验研究

目的 研究骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)及其分化的神经样细胞分别与聚乳酸-羟基乙酸(polylactic glycolic acid,PLGA)支架材料复合修复大鼠神经损伤的效果.方法 将BMSCs复合PIGA培养,通过扫描电镜观察BMSCs在PLG...     

rhBMP-2对不同培养时间骨髓基质干细胞成骨能力的影响

目的：探讨不同培养阶段骨髓基质干细胞成骨能力的变化及BMP-2对其成骨能力的影响。方法：培养兔骨髓基质干细胞，测定第3代和第18代细胞碱性磷酸酶及骨钙素活性；测定BMP-2对不同培养时间骨髓基质干细胞成骨能力的影响；测定rhBMP-2对细胞增殖的影响。结果：细胞传至第18代后，分泌的骨钙素（OC）水平及ALP活力明显降低，与第3代细胞相比，差异显著（P〈0．05）。第3代细胞在rhBMP-2的诱导下，分泌的OC水平及ALP活力在原基础上进一步升高，与对照组相比，差异显著（P〈0.05）。结第18代细胞在rhBMP-2的诱导下，分泌的OC水平及ALP活力在原基础上升高，与对照组相比，差异不显著（P〉0．05）；随培养时间的延长，各组细胞数量均有所增加，rhBMP-2诱导组与对照组细胞无显著性差异（P〉0．05）。细胞的传代次数对细胞增殖无明显影响（P〉0．05）。结论：rhBMP-2对细胞增殖无影响。随着传代次数的增加，骨髓基质干细胞的成骨能力下降，rhBMP-2促进其成骨的能力亦下降。     

骨髓间充质干细胞复合聚乳酸-羟基乙酸支架材料移植修复大鼠脊髓损伤后膀胱功能的实验研究

目的 研究骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)及其分化生成的神经样细胞分别复合聚乳酸-羟基乙酸(Polylactic Glycolic Acid,PLGA)支架材料移植治疗大鼠脊髓损伤的效果.方法 分别将单纯的PLGA、BMSCs-PLGA复合物以及神经样...     

3D打印PLA-HA复合材料与骨髓基质细胞的相容性研究

目的 探讨骨髓基质细胞与3D打印聚乳酸-羟基磷灰石(Three-dimensional printed polylactic acid-hydroxyapatite,3D printed PLA-HA)复合支架材料的相容性,为骨组织工程选择合适的支架材料提供理论依据。方法将标记绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)的骨髓基质细胞分别与3D打印PLA-HA复合材料和β-磷酸三钙(betatricalcium phosphate,β-TCP)材料体外复合培养,采用荧光显微镜观察细胞在支架材料上的生长黏附情况,并通过扫描电镜观察细胞在支架中的形态变化;CCK8(Cell Counting Kit8)法检测细胞于不同时间点在材料上的黏附率以及增殖情况;碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)活性测定法检测3 d、7 d、14 d的碱性磷酸酶活性变化。结果 骨髓基质细胞能够在3D打印PLA-HA复合材料和β-TCP材料上黏附生长;β-TCP组细胞黏附率高于3D打印PLA-HA组(P<0.05),但3D打印PLA-HA组在12 h细胞黏附率可达到60%以上;细胞增殖实验显示,3D打印PLA-HA组在体外培养第4天和第7天的细胞增殖量(OD值)均高于β-TCP组与对照组(P<0.05);3D打印PLA-HA组以及β-TCP组在第3天、第7天和第14天的ALP含量均高于对照组,且3D打印PLA-HA组第7天ALP含量较β-TCP组增多(P<0.05)。结论 3D打印PLA-HA复合材料具有良好的细胞相容性,可作为骨组织工程的支架材料。     

Expression of BMP-2 by Rat Bone Marrow Stromal Cells in Culture

To investigate the role of bone morphogenetic protein (BMP-2) in ossifying rat bone marrow stromal cell cultures, we determined the population of fibroblast-like stromal cells that expressed BMP-2 immunocytochemically (anti-rhBMP-2 monoclonal antibody), and compared that to alkaline phosphatase (AP) and collagen synthesis formed in culture over a 4-week period in control and dexamethasone-supplemented mineralizing media. In control media, the percentage of BMP-2-positive stromal cells (BMP-2⁺) increased from 12 to 25% within the first 4 days of culture. In mineralizing media, the level of BMP-2⁺ cells was significantly increased (43–44%). The intensity of immunostaining gradually increased with time. The levels of AP were undetectable at 1 week in both control and mineralizing media, but increased gradually over the next 2 weeks and peaked at 3 weeks. ALP levels were significantly greater in cultures grown in mineralizing medium (P < 0.05 at 3 weeks, P < 0.01 at 4 weeks). Collagen synthesis peaked and was significantly greater at 3 weeks (P < 0.05) in cultures grown in mineralizing medium. The levels of AP and collagen synthesis most closely reflected the changes in the percentage of BMP-2⁺ cells from 7 to 28 days. Though these changes may reflect a primary action of BMP-2 on marrow osteoprogenitor-like stromal cells, they do not exclude a mechanism that involves the induction of other members of the BMP family known to stimulate AP and collagen synthesis. We conclude that BMP-2 expression in cultures of fibroblast-like marrow stromal cells is enhanced when those cells are induced to become osteoblasts by exposure to dexamethasone. Received: 30 October 1997 / Accepted: 24 June 1998     

不同培养基对骨髓间充质干细胞免疫学特性的影响

目的比较ScienCell(SCI)干细胞培养基和低糖(LG)完全培养基培养下骨髓间充质干细胞(BMSC)的免疫学特性。方法利用流式细胞分析BMSC表面标志物的表达;通过体外成骨和成脂诱导,鉴定BMSC的多向分化能力;应用混合淋巴细胞反应实验,比较SCI组和LG组BMSC的免疫原性及免疫调节功能;采用流式细胞仪分析IFN-γ刺激前后BMSC表面免疫分子的表达情况。结果混合淋巴细胞反应结果显示,两组培养基培养的BMSC均具有低免疫原性和免疫抑制功能,但SCI组单向混合淋巴细胞增殖率显著高于LG组,而两组双向混合淋巴细胞增殖率未见显著差异。流式细胞仪分析结果显示,SCI组BMSC中免疫共刺激因子CD40阳性的细胞比例显著高于LG组,而HLA-DR以及免疫共抑制因子B7-H1和B7-DC阳性细胞比例均显著低于LG组。IFN-γ刺激后可显著上调两组BMSC中HLADR的阳性细胞比例至90%以上。低浓度的IFN-γ(10 U/mL)仅轻微上调LG组BMSCs的CD40的表达水平;而高浓度IFN-γ(1 000 U/mL)可显著提高两组BMSC中CD40和B7-H1的阳性细胞比例,以及SCI组BMSC中B7-DC的阳性细胞比例。结论在体外,含有不同成分的干细胞培养基可改变BMSC免疫分子的表达水平;SCI组BMSC的免疫原性显著高于LG组,但免疫抑制功能两组无明显差异。     

大鼠SERTOLI细胞对骨髓间充质干细胞体外诱导分化的影响

目的探索Sertoli细胞(SCs)对骨髓间充质干细胞(BMSCs)成脂、成骨和成神经诱导分化的影响。方法密度梯度离心法分离BMSCs,二步酶消化法分离SCs;对第3、4代BMSCs进行成脂、成骨及成神经诱导,并与SCs共培养,观察其形态学变化。结果油红O染色显示BMSCs成脂诱导后,胞浆出现折光性强的脂滴,加入SCs后,脂滴明显减少,染色不明显;茜素红S染色显示BMSCs成骨诱导后可显示钙结节,加入SCs后,钙结节更多,结节内红染更明显;成神经诱导在加入SCs前后没有明显差异。结论 SCs可促进BMSCs成骨分化,而抑制其成脂分化,对成神经分化则没有明显影响。     

Percoll法分离犬骨髓单个核细胞与体外成骨诱导培养的实验研究

目的建立犬骨髓单个核细胞(Bone marrow mononuclear cells,BMNCs)的分离培养、体外扩增和成骨诱导方法,为骨缺损的修复提供理想的骨组织工程种子细胞。方法用1.063g/ml percoll液分离2.5ml Beagle犬骨髓,利用细胞贴壁筛选法进行分离、培养、扩增和成骨诱导。结果采用1.063g/ml percoll液可获得纯度较高的BMNCs,接种细胞生长良好,平均倍增周期为1d,经成骨诱导培养后可定向分化为成骨细胞。结论采用1.063g/ml percoll液能够较好的进行Beagle犬BMNCs的分离培养和体外扩增,分离得到的细胞具备骨髓基质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的特性。