卵丘细胞线粒体移植对年老小鼠早期胚胎发育的影响

目的：探讨线粒体对早期胚胎发育的影响。方法：采用昆明白小鼠为动物模型，以其卵丘颗粒细胞、卵母细胞、受精卵为试验材料，提取年老小鼠卵丘细胞线粒体，将其注入年老小鼠卵母细胞和体内冲出的受精卵中，结论：通过卵丘细胞线粒体移植，给卵子补充了一定量的线粒体，可以部分弥补卵母细胞因变异引起的功能不足。为第二次减数分裂、受精卵和胚胎发育提供足够的能量，明显改善了胚胎的质量。     

卵泡刺激素和卵丘细胞对小鼠卵母细胞体外成熟的影响

目的：研究卵泡刺激素和卵丘颗粒细胞对体外培养的卵母细胞核成熟的影响。方法：未成熟卵母细胞来自人绝经期促性腺激素刺激后的小鼠卵巢。所得生殖泡期卵母细胞分成裸卵组和卵丘-卵母细胞复合物组，在分别添加0．1，0．5和1u／mL卵泡刺激素的合成人输卵管液培养液和不添加卵泡刺激素的合成人输卵管液培养液（对照组）中培养36h。培养过程中在倒置显微镜下观察各组卵母细胞生殖泡破裂和第一极体出现。出现第一极体的卵母细胞判为核成熟。结果：裸卵各卵泡刺激素组与对照组的卵母细胞生殖泡破裂发生率及第一极体排出率差别无显著性意义（P〉0．05）；卵丘-卵母细胞复合物各卵泡刺激素浓度组比对照组卵丘-卵母细胞复合物有更高的卵母细胞生殖泡破裂发生率及第一极体排出率（P〈0．05）；但各卵泡刺激素浓度组间卵丘-卵母细胞复合物的卵母细胞生殖泡破裂发生率及第一极体排出率差别无显著性意义（P〉0．05）。卵丘-卵母细胞复合物各组的卵母细胞生殖泡破裂发生率和第一极体排除率明显高于裸卵各组（P〈0．05）。结论：（1）卵丘细胞对卵母细胞的核成熟有重要作用。（2）卵泡刺激素对卵丘-卵母细胞复合物中卵母细胞核成熟有促进作用，其作用可能是通过颗粒细胞介导的。（3）卵泡刺激素对卵母细胞核成熟的促进作用可能主要是促进减数分裂的恢复。     

噪声对大鼠听力损伤及防治可能性的实验研究

目的：研究条件化噪声对噪声损伤的防治作用。并探讨酸性成纤维细胞生长因子（aFGF)对噪声性聋的防治作用。方法：一组动物先暴露于强度55-95dB SPL的条件化噪声10h，然后再暴露于105dB SPL的高强度噪声13h，观察听性脑干反应（ABR）阈值的变化，并做耳蜗铺片和扫描电镜观察。另一组动物暴露于不同强度噪声后，用免疫组化方法观察耳蜗核aFGF免疫样反应的变化。结果：先条件化噪声组动物噪声暴露后即刻产生20－35dB的暂时性阈移，3周后留有10dB左右的永久性阈移；而单独高强度噪声暴露组的暂时性阈移则达40dB,3周后仍留有20－30dB的永久性阈移。噪声暴露可造成蜗核神经元aFGF免疫样反应低下。结论：在大鼠内耳有“坚韧化”现象，且用较短时间的条件化噪声即可诱发。噪声可通过减少耳蜗核神经元中aFGF的合成和运动而影响听力，积极维护aFGF对听力防护有一定的积极意义。     

颗粒细胞凋亡对卵母细胞发育潜能的影响

未成熟卵体外培养成熟（IVM）是近十几年在辅助生殖领域新兴起来的一种助孕技术。其主要原理是模拟体内卵母细胞的发育成熟环境，使从卵巢采集的未成熟卵母细胞在体外培养成熟，然后予以受精，胚胎培养和移植，获得妊娠 。目前体外培养的卵母细胞的成熟率低及受精率低，形成的胚胎发育潜能差，常不能继续发育到囊胚阶段而导致着床失败。     

7种细胞因子在卵泡液和血清中浓度水平的对比分析

目的了解胰岛素样生长因子2(IGF-2)、白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)、白血病抑制因子(LIF)、血管内皮生长因子(VEGF)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和转化生长因子β1(TGF-β1)7种细胞因子对卵母细胞发育成熟的影响。方法用酶联免疫吸附双抗夹心法(ELISA)检测卵泡液、取卵日血清以及移植日血清中7种细胞因子浓度水平,比较分析7种细胞因子在卵泡液和血清中的浓度水平。结果 (1)IGF-2、IL-6和VEGF卵泡液中的浓度显著高于取卵日血清中的浓度,差异有显著性意义(P0.05),IGF-2和IL-6卵泡液中浓度与取卵日血清中浓度呈正相关(r=0.537,r=0.336,均P0.05),而VEGF卵泡液中浓度与取卵日血清中浓度无相关性(r=0.098,P0.05)。(2)TGF-β1在卵泡液中的浓度显著低于取卵日血清中的浓度,差异有非常显著性意义(P0.05),并且TGF-β1卵泡液中浓度与取卵日血清中浓度无相关性(r=0.021,P0.05)。(3)IL-1β、LIF和TNF-α卵泡液中的浓度和取卵日血清中的浓度差异无统计学意义(P0.05),IL-1β、LIF和TNF-α卵泡液中浓度与取卵日血清中浓度呈正相关(r=0.218,r=0.703,r=0.219,均P0.05)。结论 IGF-2、IL-6和VEGF对卵母细胞的发育成熟起关键性作用,而IL-1β、LIF、TNF-α和TGF-β1可能对卵母细胞发育成熟的生物活性较弱。     

牙齿修复相关转基因研究：显微注射法获得pTet-on-CX转基因工具小鼠G0代的实验观察

目的：为便于进行规模化的转基因研究，构建一种四环素调控性转基因体系中的工具小鼠系。方法：实验于2002—06／10在上海南方模式生物研究中心完成。以cβ—actin启动子取代pTet—on—NSE质粒中的NSE启动子，构建转基因载体pTet-on-CX；将XhoⅠ酶切线性化的载体DNA注射到小鼠受精卵的雄原核，移植到假孕母鼠的输卵管。仔鼠出生后，经PCR及Southern Blotting检测阳性小鼠。结果：注射的受精卵共存活603枚，移卵后产仔64只，阳性6只。阳性鼠分别传代开始建系。结论：通过显微注射的方法获得pTet—on—CX转基因工具小鼠的G0代，为规模化的转基因研究(包括与牙齿修复有关的基因，如牙本质涎磷蛋白基因)奠定了基础。     

左炔诺孕酮宫内缓释系统治疗子宫肌腺症的患者行超促排卵的结局分析

目的探讨左炔诺孕酮宫内缓释系统(LNG-IUS,曼月乐)治疗子宫肌腺症的同时行超促排卵,对卵母细胞和胚胎发育是否有不利影响。方法回顾性分析在我中心就诊的通过PPOS+LNG-IUS方案治疗的子宫肌腺症155个OPU周期,对照组仅PPOS治疗的267周期,比较两组患者的年龄、不孕年限、体重指数、基础FSH水平、基础LH水平,治疗结束时直径14mm的卵泡数、获卵数、成熟卵数、正常受精卵数、优质胚胎数、有效胚胎总数。结果PPOS+LNG-IUS方案治疗组和对照组相比,年龄、不孕年限、体重指数、基础FSH水平、基础LH水平,治疗结束时直径14mm的卵泡数、获卵数、成熟卵数、正常受精卵数、优质胚胎数、有效胚胎总数等组间比较均无统计学差异(P0.05)。结论 PPOS+LNG-IUS方案,利用左炔诺孕酮宫内缓释系统释放的LNG的浓度阶梯差极大的特性,在LNG持续治疗子宫肌腺症的同时,进行超促排卵和取卵的治疗,对促排卵结果无明显影响,可以得到有发育潜能的胚胎。     

噪声对大鼠听力损伤及防治可能性的实验研究

目的:研究条件化噪声对噪声损伤的防护作用,并探讨酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)对噪声性聋的防治作用。方法:一组动物先暴露于强度55～95dBSPL的条件化噪声10h,然后再暴露于105dBSPL的高强度噪声13h,观察听性脑干反应(ABR)阈值的变化,并做耳蜗铺片和扫描电镜观察。另一组动物暴露于不同强度噪声后,用免疫组化方法观察耳蜗核aFGF免疫样反应的变化。结果:先条件化噪声组动物噪声暴露后即刻产生20～35dB的暂时性阈移,3周后留有10dB左右的永久性阈移;而单独高强度噪声暴露组的暂时性阈移则达40dB,3周后仍留有20～30dB的永久性阈移。噪声暴露可造成蜗核神经元aFGF免疫样反应低下。结论:在大鼠内耳有“坚韧化”现象,且用较短时间的条件化噪声即可诱发。噪声可通过减少耳蜗核神经元中aFGF的合成和运输而影响听力,积极维护aFGF对听力防护有一定的积极意义。     

细胞移植过程中体细胞克隆提高卵母细胞去核率的最佳方法

目的：治疗性克隆应用于临床中需有效解决体细胞克隆及干细胞培养两大技术。观察注射人绒毛膜促性腺激素后不同时间体内成熟卵母细胞MⅡ期染色质与第一极体相对位置，确定以第一极体为标志，盲吸法去核时间和与染色质的位置关系，解决克隆过程中卵母细胞来源与去核率。方法：实验时间为2004-09／11，实验地点为哈尔滨医科大学组织学与胚胎学教研室组织工程研究中心层流实验室。4～6周雌性昆明小鼠在明暗循环的环境饲养，做超数排卵处理。卵母细胞用含10mg／L Hoechest33342的M2液染色5min，在Olymopus荧光显微镜下经紫外荧光激发，观察MⅡ期染色质与第一极体的相对位置，并且用不同的角度记录(0&;#176;～30&;#176;，30&;#176;～90&;#176;和90&;#176;～180&;#176;)。Moteic软件测量卵周隙，明确卵周隙变化规律。结果：①注射人绒毛膜促性腺激素12h，开始排卵，可见第一极体的卵母细胞占72．22％，23．08％第一极体已开始退化。排卵后，随着卵母细胞在体内的老化，退化的第一极体增多，到注射人绒毛膜促性腺激素19h退化第一极体的比率达到100％，可见第一极体的卵母细胞比率降到7．14％。②注射人绒毛膜促性腺激素12和14h MⅡ期染色质与第一极体位置比邻，在0&;#176;～30&;#176;区域的卵母细胞较其他时间段多，为61．54％和50％；注射人绒毛膜促性腺激素13和17h的卵母细胞MⅡ期染色质与第一极体位置以在30&;#176;～90&;#176;区域为主；注射人绒毛膜促性腺激素15hMⅡ期染色质与第一极体位置在0&;#176;～30&;#176;和90&;#176;～180&;#176;区域的卵母细胞数相等，为30．77％，且少于30&;#176;～90&;#176;区域的卵母细胞(38．46％)；注射人绒毛膜促性腺激素16，18和19hMⅡ期染色质与第一极体位置在90&;#176;～180&;#176;区域的卵母细胞逐渐增多，注射人绒毛膜促性腺激素19h达到最大值66．67％。③卵周隙随卵母细胞在体内的老化逐渐增大。结论：注射人绒毛膜促性腺激素12h可以进行小鼠卵母细胞去核操作，注射人绒毛膜促性腺激素14h为最佳去核时间。     

1例脐-坐骨连体婴分离后双成活的护理

连体罂是出生时有两个（或多个）胎儿未分开，一般只发生在同卵双胞胎的受精卵上。是一种极其罕见的妊娠现象。医学界认为受精卵在第12天～第14天分裂时由于某些原因造成不完全分裂，会形成连体婴儿，     

牙齿修复相关转基因研究:显微注射法获得pTet-on-CX转基因工具小鼠G0代的实验观察

目的为便于进行规模化的转基因研究,构建一种四环素调控性转基因体系中的工具小鼠系.方法实验于2002-06/10在上海南方模式生物研究中心完成.以cβ-actin启动子取代pTet-on-NSE质粒中的NSE启动子,构建转基因载体pTet-on-CX;将XhoI酶切线性化的载体DNA注射到小鼠受精卵的雄原核,移植到假孕母鼠的输卵管.仔鼠出生后,经PCR及Southern Blotting检测阳性小鼠.结果注射的受精卵共存活603枚,移卵后产仔64只,阳性6只.阳性鼠分别传代开始建系.结论通过显微注射的方法获得pTet-on-CX转基因工具小鼠的G0代,为规模化的转基因研究(包括与牙齿修复有关的基因,如牙本质涎磷蛋白基因)奠定了基础.     

干细胞向卵母细胞样细胞分化研究进展

胚胎干细胞和成体干细胞如骨髓间充质干细胞等在特定的培养条件下可向卵母细胞样细胞分化,但形成的卵母细胞样细胞能否进行减数分裂并进一步生成有受精能力和发育潜能的配子尚不清楚。若能在体外将成体干细胞向有功能的卵母细胞样细胞诱导分化,并通过体外受精的方式生成健康的子代,将为卵子缺乏所致不育女性提供一条新的治疗途径。本文对近年发表的有关干细胞体外向卵母细胞样细胞分化的文献进行综述,以探讨其临床应用的可行性。     

保留卵丘细胞对短时受精结果的影响

目的:探讨保留卵丘细胞对短时受精结果的影响。方法:行短时受精的患者47例,获卵数均大于10个,精卵结合后4h,根据是否去除卵丘细胞将患者的卵母细胞随机分为两组:无卵丘细胞组,共389个卵母细胞;有卵丘细胞组,共402个卵母细胞。观察卵丘细胞对短时受精的正常受精、多精受精、卵裂率、优质胚胎及胚胎利用率的影响。结果:无卵丘细胞组与有卵丘细胞组,多精受精率分别为11.6%及5.5%,两者比较,差异有统计学意义(P<0.01),两组的正常受精率(71.9%vs76.6%)、1PN受精率(4.9%vs5.2%)、未受精率(10.5%vs12.7%)比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。无卵丘细胞组与有卵丘细胞组的卵裂率(98.6%vs99.4%)、优质胚胎率(67.0%vs72.9%)、胚胎利用率(86.2%vs87.3%)比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:短时受精时,在保证患者受精的情况下,将剩余的卵母细胞保留卵丘细胞,可以降低多精受精的发生。     

卵母细胞的体外成熟

卵母细胞的体外成熟(in vitro maturation, IVM)是指将GV期或GV前期的卵母细胞在体外培养,达到次级卵母细胞(MII),能够正常受精、发育和着床,包括完整的卵泡培养[1]和单纯的卵丘复合体培养.目前应用于辅助生殖技术的主要限于后者.     

小鼠单个不同阶段卵母细胞新抑癌印迹基因RB1的表达

目的 研究新抑癌印迹基因RB1 在小鼠单个不同阶段卵母细胞中的表达.方法 采用改良 单细胞RT-PCR 方法检测RB1 在单个不同阶段卵母细胞中的mRNA 表达.结果 RB1 在小鼠单个卵母细胞 GⅤ、MⅠ、MⅡ均有检测到正常表达,不同卵母细胞的RB1 表达量不同,其中8 个MⅡ期卵母细胞,3 个卵母 细胞明显表达,1 个表达较弱,其余4 个无明显表达.结论 RB1 在小鼠不同阶段卵细胞中均有表达,但是不 同细胞RB1 存在明显表达的差异.新印迹基因RB1 的研究有助于研究卵母细胞成熟及胚胎生长发育,尤其 使用单细胞进行研究,更有利于对表观遗传学深入研究探讨.     

微创取卵术的护理

为获得成熟卵母细胞，实施微创技术经阴道超声监测下取卵术已成为体外受精-胚胎移植（IVF-ET）中的常规步骤之一。我院在开展辅助生育技术进行不孕、不育的诊治过程中，实施体外受精-胚胎移植，使不少病人受孕。2000年一2004年共实施取卵术222例，无一例发生并发症。取卵术是体外受精-胚胎移植治疗过程中的重要环节，     

细胞移植过程中体细胞克隆提高卵母细胞去核率的最佳方法

目的:治疗性克隆应用于临床中需有效解决体细胞克隆及干细胞培养两大技术。观察注射人绒毛膜促性腺激素后不同时间体内成熟卵母细胞MⅡ期染色质与第一极体相对位置,确定以第一极体为标志,盲吸法去核时间和与染色质的位置关系,解决克隆过程中卵母细胞来源与去核率。方法:实验时间为2004-09/11,实验地点为哈尔滨医科大学组织学与胚胎学教研室组织工程研究中心层流实验室。4～6周雌性昆明小鼠在明暗循环的环境饲养,做超数排卵处理。卵母细胞用含10mg/LHoechest33342的M2液染色5min,在Olymopus荧光显微镜下经紫外荧光激发,观察MⅡ期染色质与第一极体的相对位置,并且用不同的角度记录(0°～30°,30°～90°和90°～180°)。Moteic软件测量卵周隙,明确卵周隙变化规律。结果:①注射人绒毛膜促性腺激素12h,开始排卵,可见第一极体的卵母细胞占72.22%,23.08%第一极体已开始退化。排卵后,随着卵母细胞在体内的老化,退化的第一极体增多,到注射人绒毛膜促性腺激素19h退化第一极体的比率达到100%,可见第一极体的卵母细胞比率降到7.14%。②注射人绒毛膜促性腺激素12和14hMⅡ期染色质与第一极体位置比邻,在0°～30°区域的卵母细胞较其他时间段多,为61.54%和50%;注射人绒毛膜促性腺激素13和17h的卵母细胞MⅡ期染色质与第一极体位置以在30°～90°区域为主;注射人绒毛膜促性腺激素15hMⅡ期染色质与第一极体位置在0°～30°和90°～180°区域的卵母细胞数相等,为30.77%,且少于30°～90°区域的卵母细胞(38.46%);注射人绒毛膜促性腺激素16,18和19hMⅡ期染色质与第一极体位置在90°～180°区域的卵母细胞逐渐增多,注射人绒毛膜促性腺激素19h达到最大值66.67%。③卵周隙随卵母细胞在体内的老化逐渐增大。结论:注射人绒毛膜促性腺激素12h可以进行小鼠卵母细胞去核操作,注射人绒毛膜促性腺激素14h为最佳去核时间。     

卵母细胞形态及核质成熟度与体外受精结局相关性的研究进展

在体外受精操作中,受精率、卵裂率与卵母细胞质量密切相关。卵和胚胎的质量是影响植入率和妊娠率的重要因素。目前评价卵细胞的质量尚无明确的统一标准,但主要涵盖于对卵母细胞形态和成熟度的考察。非侵袭性方法以不损伤细胞为     

人类不成熟卵体外培养的应用

1935年Pincus和Enzmann在家兔的实验中发现,若将不成熟卵母细胞从卵泡中释放出来,它在体外适当培养基中可发育成熟.这一现象使人们开始联想到从体内抽取的不成熟卵母细胞可在体外培养成熟,并可用来挽救发育中即将退化的卵母细胞,同时可能应用于临床提供卵子用于体外受精.人不成熟卵细胞的体外成熟(in vitro maturation, IVM),由Cha[1]首先报道成功从手术穿刺卵巢获得不同成熟阶段的未成熟卵母细胞,在体外培养到成熟卵母细胞而进行体外受精和胚胎移植.随后Trounson等[2]报道在阴道B超引导下穿刺2～10 mm直径的卵泡,未接受促激素刺激的多囊卵巢综合征(PCOS)患者卵巢获得不成熟卵进行体外培养并获得成功妊娠.     

颗粒细胞凋亡对卵母细胞发育潜能的影响

未成熟卵体外培养成熟(IVM)是近十几年在辅助生殖领域新兴起来的一种助孕技术.其主要原理是模拟体内卵母细胞的发育成熟环境,使从卵巢采集的未成熟卵母细胞在体外培养成熟.然后予以受精,胚胎培养和移植,获得妊娠[1].