神经肽Y基因在COS—7细胞中的表达

构建大鼠ＮＰＹ基因的瞬时表达载体ｐＳＶＬ－ＮＰＹ，以Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ＾ＴＭ介导将其导入ＣＯＳ－７细胞中，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ和ＨＰＬＣ检测结果：ｐＳＶＬ－ＮＰＹ质粒转染的ＣＯＳ－７细胞可表达ＮＰＹ ｍＲＮＡ及成熟肽ＮＰＹ。     

人IL-18结合蛋白AcDNA的克隆及在COS-7细胞中的表达

目的：克隆人IL－18结合蛋白（hIL-18BPa)的cDNA，观察其在COS－7的表达。方法：采用RT－PCR自人白血病细胞株jukat中获得hIL-18 BPa的cDNA，将其克隆至T－vector中，经测序确证后，将该基因定向插入真核表达载体pcDNA3.1( )中，脂质体介导法将其转染COS－7细胞，72h后收集上清纯化，用BCA法测定hIL-18 BPa的含量，用ELISA法测定其活性。结论：获得的IL－18BPa的cDNA序列gene bank登录的cDNA序列一致。上清液中hIL-18BPa含量为1．4mg/L，并具有良好的生物学活性。结论：成功克隆hIL-18 BPa基因，并实现了COS－7细胞中的瞬时表达，为研究其活性奠定了基础。     

HLA—E cDNA克隆及在LcL721.221细胞的表达

目的 克隆HLA-E cDNA,并使其在HLA I类阴性的靶细胞LcL721.221细胞上获得稳定表达。方法 用RT-PCR方法从人外周血淋巴细胞扩增出HLA-E cDNA,并通过内核糖体进入位点（IRES）将目的基因亚克隆于已经载有HLA-A2的逆转录病毒表达载体pGCEN上,构建成HLA-A2/E 多顺反子表达载体（pG/A2E）,采用感染的方法将重组质粒转入LcL721.221细胞,最后经G418筛选及有限稀释,利用抗HLA-E特异的单克隆抗体3D12进行FACS检测,以观察HLA-E分子在靶细胞表面的表达情况。结果 HLA-E 分子在经pG/A2E转染的靶细胞表面获得明显的表达（88.79%）,且显著高于表达HLA-E的对照细胞株JAR（26.21%）,而经pG/A2载体转染的靶细胞则未获得表达。结论 成功构建了pG/A2E多顺反了表达载体,并使HLA-E分子在HLA I类阴性的LcL721.221细胞表面获得表达。     

突变型和野生型MBL基因在COS7细胞中的瞬时表达

采用PCR技术,从质粒pMBLm52、pMBLm54和pMBLm57中分别获取含CGT52TGT、GGC54GAC和GGA57GAA点突变的人甘露聚糖结合凝集素(MBL)突变体全长编码区cDNA序列,将其分别插入质粒pcDNA4/HisMax C中,构建成相应的3种真核表达载体。将各突变型MBL基因的真核表达载体和野生型MBL基因真核表达载体以脂质体法分别转染COS7细胞。72 h后,以双抗体夹心ELISA技术检测各细胞培养上清中目的蛋白的含量分别为0.980μg/ml、0.971μg/ml、0.900μg/ml和1.047μg/ml;用One-way ANOVA分析这些目的蛋白的含量无显著性差异(P>0.05)。因此,MBL结构基因的点突变并不影响MBL蛋白的合成与分泌。     

人CD81的克隆及在COS-7细胞中的表达

目的 从人外周血淋巴细胞中克隆出CD81基因，构建真核表达质粒，并在COS－7细胞中进行表达。方法 分离外周血淋巴细胞，提取细胞总RNA，采用RT－PCR扩增CD81基因。将CD81基因克隆至载体pcDNA3.1( )中，进行酶切及测序鉴定。以质粒pcDNA3.1-CD81转染COS－7细胞进行瞬时表达，并用免疫细胞化学染色法和流式细胞术检测蛋白的表达。结果 RT－PCR产物已插入载体pcDNA3.1( )构建成真核表达质粒pcDNA3.1-CD81。经双酶切和测序鉴定表明，克隆出的人CD81全长编码序列同GenBank收录的序列一致，并且真核表达质粒的构建正确。以脂质体转染COS－7细胞后，用免疫细胞化学染色法和流式细胞术检测表明，细胞可表达人CD81。结论 成功地构建真核表达载体pcDNA3.1-CD81，为进一步研究HCV和CD81的相互作用，以及建立可能的HCV细胞感染模型打下了基础。     

人补体C1—抑制物基因在COS—7细胞中的表达

利用全长人Ｃ１－ＩＮＨ ｃＤＮＡ片段构成建功可在ＣＯＳ－７细胞中瞬间表达重组人Ｃ１－ＩＮＨ的表达质粒ｐＳＶＬＣ１。通过ＤＥＡＥ－Ｅｅｘｔｒａｎ法转染ＣＯＳ－７细胞，经体外标记、免疫沉淀和Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹后发现，转染细胞可分泌一条分子量约１１０ｋＤ的免疫活性蛋白带。     

人β—NGF基因在COS—7细胞中的表达及其生物学活性的研究

目的 研究人β-神经生长因子（β-NGF）cDNA在真核细胞中的表达及其表达产物的活性。方法 将质粒pGEM-β-NGF进行酶切并回收β-NGFcDNA片段,构建重组真核表达载体pcDNA3-β-NGF。利用脂质体Lipofectamine方法转染COS-7细胞,对阳性克隆COS-7细胞的mRNA和培养上清分别进行Northern blot分析和观察对PC12细胞突起生长的作用,结果 β-NGF基因在COS-7细胞中获得表达,阳性克隆COS-7细胞培养上清能够促进PC12细胞突起生长,结论 目的基因在COS-7细胞中成功表达β-NGF蛋白,并具有良好的生物学活性。     

人FL基因高效真核表达载体的构建及其在COS—7细胞中的表达

目的：构建人FL真核表达载体－pIRS1neo/hFL,观察其在COS－7细胞 中的表达。方法：采用RT－PCR方法自人白血病细胞系TF－1中克隆可溶型FL（Flt3-ligand)cDNA片段,测序鉴定正确后,插入真核表达载体-pIRES1 neo中的EcoR Ⅰ和BamHI位点,构建hFL真核表达载体－pIRES1neo/hFL。脂质体介质法将其转染COS－7细胞,72h以RT－PCR检测转染细胞中外源hFL基因的转录、ELISA法及脐血CD34^ 细胞增殖实验测定转染细胞上清上hFL的含量和活性。结果：酶切鉴定表明成功构建了重组真核表达载体－pIRES1neo/hFL;外源hFL基因能在转染细胞中有效转录;ELISA法测得72h后培养上清中的hFL含量为每24小时251ng/10^6 cells,并且分泌的hFL具有良好的生物学活性。结论：构建hFL真核表达载体在COS－7细胞中具有良好的表达活性。     

人可溶性IL-6R及其突变体基因在COS7细胞中的表达及活性分析

目的 研究人可溶性ＩＬ－６Ｒ（ｈｓＩＬ－６Ｒ）的空间构效关系，为小分子拮抗设计提供理论依据。方法：首先利用ＰＣＲ技术扩增天然人ｓＩＬ－６Ｒ基因片段，然后将第２８０位Ｈｉｓ残基突变成Ｉｌｅ。天然基因和突变体基因分别转染ＣＯＳ７细胞，经ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｂｌｏｔ检测证实转染细胞上清中的表达产物，并利用ＢｉｎｄｉｎｇａｓｓａｙＥＬＩＳＡ和生物学功能分析法检测表达产物与ＩＬ－６的结合能力以及它们所介     

A PCR-SSP method to specifically select HLA-A*0201 individuals for immunotherapeutic studies

HLA-A*0201 is an important restriction element for peptide presentation to T cells in disease and cancer. Mutation studies and analyses using cytotoxic T lymphocytes have shown the functional relevance of subtype-specific differences in HLA-A2 molecules for peptide binding and T-cell receptor recognition. Therefore, many immunotherapeutic studies need to accurately select HLA-A*0201-positive individuals. We designed an easy, robust approach based on the polymerase chain reaction using sequence-specific primers (PCR-SSP) to specifically distinguish A*0201-positive individuals from other HLA-A2 subtypes described to date. The first step includes reactions that give information whether the sample donor is HLA-A2 and, if so, whether the individual is homozygous or heterozygous for HLA-A2. Further, it is determined whether the sample has an HLA-A*0209 or an HLA-A*0201 sequence at the corresponding position in exon 4. Samples that may contain an HLA-A*0201 allele according to the results of this first step are subtyped in a second step nested PCR. Here the strategy is focussed on the discrimination of HLA-A*0201 from the other subtypes by considering divergent nucleotide positions in two ways. One SSP combination amplifies the HLA-A*0201 sequence while a corresponding SSP combination specifically amplifies the subtype or group of subtypes differing from HLA-A*0201 at this position. Thus, at relevant polymorphic nucleotide positions the HLA-A*0201 sequence is both directly and indirectly confirmed. This strategy strongly enhances the reliability of the subtyping and allows better verification of HLA-A*0201-positive patient selection for clinical studies.     

sHLA-A*0201-抗原肽四聚体的构建与功能检测

目的：构建有功能的sHLA-A＊0201-抗原肽四聚体，建立一套HLA Ⅰ类分子／抗原肽的四聚体制备技术。方法：利用基因工程及体外折叠技术构建sHLA-A＊0201-LMP2A426-434复合物分子，并在BirA酶的作用下生物素化。与荧光标记的亲和素衍生物以分子数4：1结合而形成HLA-A＊0201-LMP2A426-434四聚体。获得的四聚体对长期混合淋巴细胞培养中增殖的抗原特异性CTL进行检测，同时用细胞毒实验验证。结果：荧光标记的亲和素与生物素化的HLA-A＊0201-抗原肽复合物分子正确结合，制备的四聚体能够与长期混合淋巴细胞培养出的特异性T细胞结合。结论：从结构与功能上证实成功地获得有功能的HLA-A＊0201-抗原肽复合物四聚体。为进一步研究T细胞识别机制与功能奠定了基础，也为过程复杂的HLA-抗原肽四聚体制备提供了可行的免疫学监控方法。     

整合法预测HBV相关抗原的HLA-A* 0201限制性结合肽

目的 预测HBV的相关抗原HBsAg、HBcAg、DNA polymerase新的HLA-A*0201限制性结合肽.方法 选取SYFPEITHI、BIMAS、SVMHC、IEDB、EpiJen预测工具以及整合法预测抗原对应蛋白序列P03146,P03138,P03156的HLA-A*0201限制性结合肽,并与现有表位数据库中的结合肽比较.结果 整合法与单个预测算法相比提高了预测的灵敏度和特异性,对3种抗原的预测准确性均有提高,MR(misclassification rate)值分别降为1.14%、3.41%、1.46%;利用此方法发现3种抗原尚未得到实验验证的HLA-A*0201结合肽,分别为,HBcAg:ELMTLATWV(64-72)、LMTLATWVGV(65-74);HBsAg:LMT-LATWVGV(246-254)、IIFLFILLL(244-252)、FLFILLLCU(246-255)、SLYSILSPFL(367-375)以及LLCLIFLLvL(251-260);DNA polymerase:SLFTAVTNFL(513-522)、GLLGFAAPFT(554-563);在HBsAg蛋白序列中发现了31个氨基酸的免疫热点区域FIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLI(243-273).结论 整合法比单个预测算法性能更好,能够更准确地预测抗原的HLA限制性结合肽,采用该方法所发现的9条可能表位和1个免疫热点区域为后续HBV新表位的鉴定及其功能研究提供了有价值的线索.     

基于SCORE函数估算HLA-A*0201限制性CTL表位亲和性

目的 建立HLA-A*0201限制性CTL表位亲和性的定量预测方法。方法基于SCORE打分函数,运用定量构效关系的理论和方法研究了HLA-A*0201限制性CTL表位九肽结构与亲和性间的定量关系,并建立了SCORE得分与亲和性的定量关系模型,并用外部样本(5个HLA-A*0201限制性CTL表位九肽)作为预测集用于检验模型的预测能力。结果基于SCORE打分函数建立的定量模型具有较好的相关性(r=0．9165,RMS=0．38)和对外部样本的预测能力(rpred=0.9847,RMS=0.135)。结论基于SCORE打分函数,运用定量构效关系研究的理论和方法建立了HLA-A*0201限制性CTL表位亲和性的定量预测方法,为实验鉴定高亲和性HLA-A*0201限制性CTL表位提供了理论依据。     

HLA-A*0206-BSP和-A*0207-BSP融合基因的构建与表达

采用RT-PCR技术从HLA-A*0206和-A*0207阳性个体的PBMC中分别克隆出HLA-A*0206和-A*0207基因的全长cDNA序列,构建HLA-A*0206和-A*0207克隆载体。再利用PCR技术从构建的克隆载体中扩增HLA-A*0206和-A*0207的α链(重链)胞外段序列,分别经双酶切置换本室保存的HLA-A*0201-BSP重组体中的HLA-A*0201胞外段序列,使HLA-A*0206和-A*0207与BirA酶底物肽(BirA substrate peptide,BSP)序列融合,构建HLA-A*0206-BSP和-A*0207-BSP融合基因的表达载体,经限制性酶切和DNA测序证实。然后将该表达载体转化E.coliBL21(DE3)后获得表达产物,通过体外稀释复性,初步纯化的表达产物通过ELISA和Western blot检测证明能够与β2微球蛋白(HLA I类分子轻链)及HLA-A2限制性抗原肽(HBV core 18-27)折叠形成具有HLA I类分子天然构象的抗原肽/HLA-A2复合物单体。为进一步构建HLA-A*0206和-A*0207四聚体,探讨相应HLA-A2亚型的功能特点提供了物质基础。     

慢性髓系白血病bcr-abl融合基因的克隆及其在COS-7细胞中的表达

目的克隆慢性髓系白血病(CML)融合基因bcr abl的cDNA序列 ,并在真核细胞中表达。方法以设计的两条引物扩增bcr abl融合位点两侧的cDNA ,测序后克隆至真核表达载体 pcDNA3.1 ,转染COS 7细胞。取常规培养的细胞进行RT PCR鉴定。结果①PCR扩增出490bp大小的cDNA ,其序列测定除第452位的碱基C突变为T外 ,其余序列均正确。②RT PCR法检测到转染细胞系中 ,有bcr ablmRNA的表达。结论成功地克隆了CML融合基因bcr abl融合位点两侧的490bp 序列并表达 ,为研制bcr abl基因疫苗治疗CML奠定了基础。     

The quantity of naturally processed peptides stably bound by HLA-A*0201 is significantly reduced in the absence of tapasin

Tapasin plays a critical role in promoting peptide binding by major histocompatibility complex (MHC) class I molecules in the endoplasmic reticulum. In its absence, cell surface expression of most allotypes is significantly reduced. Two exceptions are HLA-A*0201 and HLA-B*2705. In this study, the repertoire of peptides bound endogenously by these allotypes in the absence of tapasin was examined and stability of the HLA class I/peptide complexes assessed. Similar quantities of peptides were recovered from B*2705 complexes expressed in the absence and presence of tapasin and the composition of the peptide pools were not radically different. However, the stability of B*2705 molecules expressed at the surface of tapasin-deficient cells was found to be reduced which suggests there are subtle changes to the peptide repertoire. The impact of the absence of tapasin was more dramatic for A*0201. Although equivalent levels of cell surface A*0201 are expressed in the presence and absence of tapasin, very little A*0201 glycoprotein was recovered from tapasin-deficient cells suggesting the complexes readily dissociate. Consistent with reduced stability, A*0201 complexes were found to be rapidly lost from the surface of tapasin-deficient cells. Analysis of the small quantity of endogenously bound peptides recovered from A*0201 expressed in the absence of tapasin revealed a complex mixture typical of A*0201 molecules expressed in normal cells. Therefore these molecules are unable to exploit the alternative supply of TAP-independent A*0201-binding peptides present in the endoplasmic reticulum. Loading of A*0201 with peptides from both TAP-dependent and TAP-independent sources is significantly compromised without tapasin.