Hes1基因启动子的克隆及活性研究

目的:获取人Hes1基因的启动子并对其进行活性分析。方法:以人Hela细胞基因组DNA为模板,利用PCR技术扩增Hes1基因5’侧翼序列,将扩增的片段与pMD18-T载体连接,然后利用双酶切进行鉴定,并送测序;将测序正确的启动子插入pGL3-Basic,双酶切并测序鉴定。将测序正确的重组DNA质粒瞬时转染宫颈癌细胞,运用双荧光素酶报告基因检测系统检测其启动子的活性。结果:PCR扩增到的人Hes1基因启动子与基因库的序列完全一致,双荧光素酶报告基因检测系统显示其在宫颈癌细胞中具有启动子活性。结论:成功得到人Hes1基因启动子并且其具有活性。     

SRY基因启动子不同模块的克隆及功能分析

采用报告基因分析的方法 ,构建SRY基因 5′旁侧具有启动效应的 5 44bp以内不同长度片段与荧光素酶报告基因载体PGL2 Enhancer的重组子 ,并通过脂质体转染技术导入Hela细胞 ,检测各重组子报告基因的瞬间表达 ,由此分析启动子不同模块对基因转录效率的影响。结果显示 :位于起始密码子ATG上游nt.- 35 3～ - 174之间的 179bp片段内含有某种抑制子元件 ,nt.- 112～ - 6 3之间的 49bp片段内含有某种增强子元件 ,nt.- 174～ - 112之间的 6 3bp片段中含有基因转录所必须的启动子序列。进一步定位这些顺式作用元件 ,并研究与之相互作用的反式作用因子 ,对阐明SRY基因的表达调控机制具有重要意义     

EOLA1基因启动子序列的鉴定

目的 鉴定EOLA1基因启动子序列,为深入研究EOLAl的转录调控机制奠定基础.方法 通过PCR反应进一步缺火突变EOLAI基因5'侧翼区-1672～+51(1723 bp)序列,将产物插入到含荧光素酶报告基因的载体pGL3-Basic中,转染ECV304细胞,瞬时表达后测定荧光素酶活性.采用生物信息学分析该1 723 bp片段可能存在的转录因子结合位点.结果 缺失到785 bp片段仍具有肩动子活性,进一步缺欠到717 bp片段后活件消失,从而确定启动子位于-738～ -676 bp序列,其附近含Spl和Myf顺式作用元件.结论 确定了EOLAI启动子范围和转录因子结合位点.     

EOLAl基因启动子序列的鉴定

目的 鉴定EOLA1基因启动子序列,为深入研究EOLAl的转录调控机制奠定基础.方法 通过PCR反应进一步缺火突变EOLAI基因5'侧翼区-1672～+51(1723 bp)序列,将产物插入到含荧光素酶报告基因的载体pGL3-Basic中,转染ECV304细胞,瞬时表达后测定荧光素酶活性.采用生物信息学分析该1 723 bp片段可能存在的转录因子结合位点.结果 缺失到785 bp片段仍具有肩动子活性,进一步缺欠到717 bp片段后活件消失,从而确定启动子位于-738～ -676 bp序列,其附近含Spl和Myf顺式作用元件.结论 确定了EOLAI启动子范围和转录因子结合位点.     

小鼠STING基因启动子的克隆鉴定及功能初步分析

目的:克隆小鼠干扰素基因刺激因子(STING)基因启动子,并对其启动子活性和转录调控机制进行初步探讨?方法:利用PCR方法扩增小鼠STING基因5′上游1 005 bp(-927~+77)的片段,亚克隆至pGL3-basic质粒,然后通过步移缺失构建不同缺失片段的重组质粒?双荧光素酶报告活性分析检测重组质粒在NIH3T3中的活性,并利用生物信息学方法预测转录因子结合位点?结果:经酶切?测序鉴定,成功构建了小鼠STING启动子荧光素酶报告基因重组质粒?与pGL3-basic质粒相比,STING启动子重组质粒的相对荧光素酶活性增加(P < 0.05)?通过生物信息学软件预测小鼠STING启动子区域(-177~-48)可能含有GATA?IK2?MZF1?SP1/SP3?STAT等转录因子结合位点?结论:成功构建小鼠STING不同缺失片段的启动子荧光素酶报告基因重组质粒?通过活性比较,推测小鼠STING的核心启动子区位于-177~+77区域,其中可能含有多个潜在的转录因子结合序列?     

食管癌组织RASSF1A基因启动子区甲基化检测及其临床意义

目的探讨Ras相关结构域家族基因1A（RASSF1A）启动子区异常甲基化与食管癌发生发展的关系。方法采用甲基化特异性PCR方法,检测66例食管癌组织及相应的癌旁正常组织RASSF1A基因启动子区异常甲基化。分析食管癌组织中RASSF1A基因启动子区异常甲基化与临床病理特征的关系。结果在食管癌组织、癌旁正常组织中RASSF1A基因启动子区异常甲基化的发生率分别为48．5％（32／66）、6．1％（4／66）。淋巴结转移者食管癌组织中RASSF1A基因启动子区异常甲基化的发生率（61．1％）明显高于无淋巴结转移者（33．3％）（χ^2=5．055,P=0．025）;晚期（Ⅲ～Ⅳ期）食管癌组织中RASSF1A基因启动子区异常甲基化的发生率（69．2％）明显高于早期（Ⅰ～Ⅱ期）（35．0％）（χ^2=7．392,P=0．007）;食管癌组织中RASSF1A基因启动子区异常甲基化与肿瘤分化程度无相关性（P〉0．05）。结论食管癌组织中存在RASSF1A基因启动子区的异常甲基化,甲基化与食管癌病理分期和淋巴结转移有关。     

原癌基因USP22启动子的克隆及转录活性分析

 目的克隆原癌基因USP22部分启动子序列,探讨其转录活性。方法应用cDNA 5忆末端快速扩增（5'RACE）方法定位
USP22基因转录起始点;在此基础上针对其5'端非编码区处包括转录起始点在内的-2 828~+52片段进行PCR扩增,产物克隆
入荧光素酶表达载体pGL3-Basic。重组质粒与内参质粒pRL-TK共转染HepG2 与Hela 细胞,双荧光素酶活性检测确定其转录
活性。结果成功确定USP22基因转录起始位点,酶切及测序结果证实USP22基因5'端非编码区2 880 bp 序列正确插入到荧
光素酶报告基因载体pGL3-Basic。重组质粒pGL3-USP22 promoter 转染HepG2 细胞和Hela 细胞后,检测到荧光素酶的高表达
（ P<0.05）。结论成功构建具有转录活性的USP22启动子片段,为进一步研究USP22表达调控机制奠定基础。     

DAPK基因启动子区过甲基化与颈段食管癌的关系

目的 探讨死亡相关蛋白激酶基因启动子区过甲基化与颈段食管癌的关系.方法 采用甲基化特异性PCR(MSP)法和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法分析颈段食管部正常黏膜、颈段食管癌及相应癌旁组织中DAPK基因启动子区过甲基化及其mRNA表达状况.结果 42例颈段食管癌组织中,有27例(64.3%)DAPK基因启动子区过甲基化,其在各病理分级和T分级之间差异无统计学意义(P>0.05),而在N分级之间差异有统计学意义(P<0.05).25例癌旁组织中,有6例过甲基化,且均为颈段食管癌组织中有过甲基化的病例.颈段食管部正常组织、非甲基化的颈段食管癌组织和癌旁组织中均有DAPK mRNA表达.结论 颈段食管癌中DAPK基因启动子区过甲基化与mRNA失表达有关,可能是颈段食管癌发生、发展的原因之一.     

IPO8基因启动子的克隆及转录活性分析

目的：克隆IPO8基因5'端非编码序列,探讨其转录活性。方法：应用cDNA 5'末端快速扩增(rapid amplication of cDNA ends,5'CE)方法定位IPO8基因转录起始点;在此基础上针对其5'端非编码区包括转录起始点在 内的–3302 ~ +134区域分段进行PCR扩增,将产物克隆入荧光素酶表达载体pGL3-Basic。经酶切鉴定后,将重组质粒与 内参质粒pRL-TK共转染人骨肉瘤细胞Saos-2,用双荧光素酶活性检测以确定其转录活性。结果：成功确定IPO8基因 转录起始位点,酶切结果证实IPO8基因5'端非编码区6条续减片段正确插入到荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic。重组 质粒转染Saos-2细胞后检测到荧光素酶的高表达(P<0.05)。结论：成功构建具有转录活性的IPO8启动子片段,为进一 步研究IPO8表达调控机制奠定了基础。     

食管癌细胞中T钙黏蛋白基因启动子区异常甲基化的研究

目的 探讨食管癌细胞中T钙黏蛋白( T-cadherin)基因启动子区甲基化状态,以及5-杂氮-2’-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)作用对食管癌细胞生长、侵袭以及T-cadherin基因甲基化状态与表达的影响.方法 采用甲基化特异性PCR分析经5-Aza-CdR处理前后食管癌细胞EC1和EC109中T-cadherin启动子甲基化状态,Western印迹检测经5-Aza-CdR处理前后两种细胞中T-cadherin蛋白表达,以MTT比色法与侵袭实验测定细胞增殖与侵袭能力的变化.结果 EC1和EC109细胞中T-cadherin基因启动子区域存在异常甲基化现象,经5-Aza-CdR作用后可逆转启动子异常甲基化,显著上调食管癌细胞中T-cadherin的蛋白表达,同时显著抑制肿瘤细胞的增殖与侵袭能力(P＜0.01).结论 启动子区异常甲基化是导致食管癌细胞中T-cadherin表达水平下调的重要机制,应用5-Aza-CdR可恢复T-cadherin表达并抑制肿瘤细胞的恶性表型.     

食管鳞状细胞癌组织中肌动蛋白交联蛋白的表达和临床意义

摘要：目的探讨食管鳞状细胞癌组织及正常食管粘膜组织中肌动蛋白交联蛋白（FASCIN）的蛋白表达情况,并分析其与
食管鳞状细胞癌临床病理及患者5年生存率的关系。方法241例食管癌患者均来自河南林州市。利用组织微阵列技术,
采用免疫组化ABC法,分析241例食管鳞癌组织（观察组）和相应正常食管粘膜组织（对照组）中FASCIN蛋白的表达情
况。结果食管鳞癌组织中FASCIN蛋白表达阳性率明显高于正常食管粘膜组织中的表达阳性率（68.9% vs 15.5%,P<
0.05）;FASCIN蛋白高表达与淋巴结转移、TMN分期有关,而与年龄、性别、肿瘤细胞分化程度、和大体分型无关;FASCIN
蛋白高表达的食管鳞癌患者的5年生存率明显低于FASCIN蛋白未高表达的食管鳞癌患者。结论FASCIN蛋白的异常
表达可能与食管鳞状细胞癌的发生、发展相关,检测FASCIN可能为食管癌预后判断提供依据。     

含人SOD_2基因启动子的荧光素酶报告基因质粒的构建和鉴定

目的:从人基因组中克隆SOD2基因的启动子并插入到荧光素酶报告基因载体中并进行基因测序鉴定。方法:以人基因组DNA为模板,用PCR的方法扩增出人SOD2基因启动子片段后,将其插入到pGL3-basic载体的荧光素酶报告基因上游,将构建的重组质粒通过双酶切片段的凝胶电泳分析和DNA测序以确定插入位置和序列的正确性。结果:双酶切反应和测序结果显示SOD2基因启动子插入的位置和序列是正确的。结论:成功克隆了SOD2基因启动子,为后续SOD2转录调控机制的研究提供重要的实验基础。     

fascin蛋白在经典型霍奇金淋巴瘤R-S细胞中的表达及其意义

目的 探讨经典型霍奇金淋巴瘤(CHL)R-S细胞中fascin蛋白的表达和意义.方法 收集27例CHL,采用免疫组化SP法标记fascin抗体,观察fascin蛋白在CHL中R-S细胞的表达,并比较其与CD30、CD15表达的差异性.结果 R-S细胞fascin的表达强度明显高于CD30和CD15.fascin蛋白在全部27例CHL R-S细胞胞浆中弥漫强阳性表达,阳性率为100%(27/27);CD30、CD15的表达强弱不等,阳性率分别为96.3%(26/27)、74.1%(20/27).结论 fascin蛋白是经典型霍奇金淋巴瘤R-S细胞高度敏感的标记物,它有助于诊断CHL,它的阴性表达具有排除CHL的意义.     

人食管鳞癌细胞株中RIZ1基因启动子区甲基化状态的研究

目的:探讨6种人食管鳞癌细胞株KYSE150,KYSE510,TE13,EC9706,CaEs17和EC109中RIZ1基因启动子区的甲基化状态;观察特异性DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR对存在甲基化的细胞株RIZ1基因的转录调控作用及其对该细胞生长增殖的影响。方法:甲基化特异PCR(MSP)法检测6种人食管鳞癌细胞株中RIZ1基因启动子区的甲基化状态;实时定量PCR法检测5-Aza-CdR处理前后RIZ1基因启动子区CpG岛高度甲基化的人食管鳞癌细胞株TE13中RIZ1 mRNA表达量的变化;MTT法检测5-Aza-CdR对TE13细胞生长增殖的影响。结果:(1)6种人食管鳞癌细胞株中TE13,CaEs17,EC109三株细胞RIZ1基因启动子区存在甲基化;(2)5-Aza-CdR处理细胞株TE13后,RIZ1 mRNA表达量上调;(3)5-Aza-CdR能抑制TE13的生长增殖,并随时间的延长和浓度的增加抑制作用变明显。结论:启动子区CpG岛高度甲基化是人食管鳞癌细胞株TE13 RIZ1基因表达沉默的重要原因;5-Aza-CdR能使TE13 RIZ1 mRNA表达上调;并能抑制TE13细胞的生长增殖,并呈时间和浓度依赖性。     

Fascin蛋白、表皮生长因子受体及上皮型钙粘着蛋白在结直肠癌中的表达及意义

目的:探讨fascin蛋白、表皮生长因子受体(EGFR)及上皮型钙粘着蛋白(E-cad)在结直肠癌中的表达及其临床病理意义.方法:用免疫组织化学方法检测45例结、直肠癌中fascin蛋白、EGFR及E-cad的表达,fascin蛋白及EGFR肿瘤细胞染色>5%的病例定为阳性,E-cad肿瘤细胞染色<50%的病例为异常表达(表达减少或丧失).结果:45例结、直肠癌中22例(48.9%)fascin蛋白阳性,24例(53.3%)EGFR阳性,29例(64.4%)E-cad异常表达,而且都与肿瘤分化程度、浆膜侵犯、淋巴结转移、TNM分期相关(均P<0.05),fascin蛋白表达与EGFR表达及E-cad异常表达也都具相关性(均P<0.05).结论:fascin蛋白、EGFR及E-cad可以作为评价结直肠癌预后的参考指标.     

不同活性的survivin基因启动子片段的克隆及鉴定

目的 检测survivin在成体干细胞等细胞中的表达差异,克隆并比较3种不同片段长度survivin启动子的活性.方法 取成纤维母细胞10T1/2、成肌母细胞C2C12、真皮多能干细胞DMSC、人骨髓间充质干细胞BMSC、结肠腺癌细胞HT29、人胚肾母细胞293FT进行培养.用RT-PCR和免疫细胞化学染色检测survivin在成体干细胞和肿瘤细胞中的表达;用基因组DNA PCR和分子克隆等方法,构建不同长度的survivin基因启动子驱动荧光素酶报告基因表达的载体,经脂质体转染293FT细胞,测定相对荧光素酶活性以反映启动子活性.结果 survivin基因在正常成体干细胞中低表达,在成肌母细胞中中度表达,在结肠腺癌细胞HT29中高表达.克隆了不同片段长度的survivin基因启动子,并连接到荧光素酶cDNA 上游.在293FT细胞中,987 bp和160 bp的 survivin基因启动子活性高于270 bp的survivin启动子的活性.结论 survivin基因启动子由于肿瘤特异性和泛肿瘤表达的特点,可通过载体构建应用于监控和治疗移植后干细胞的恶性转化.用高活性survivin基因启动子构建的载体可能会提高其在监控和治疗中的效果.     

人食管癌相关基因cDNA片段的克隆、筛选与初步鉴定

目的 :筛选和鉴定人原发性食管癌组织的相关基因 ,揭示食管癌的癌变机理。方法 :用高效、灵敏的荧光mRNA差异显示技术 ,以食管癌及相应的正常食管粘膜组织为对照 ,通过对其基因表达的比较 ,找出差异条带 ,利用ReverseNorthernDotBlot、DNA序列分析和NorthernBlot,并结合mRNA原位杂交技术对被筛片段进行鉴定。结果 :①在实验中分离、鉴定了 74条差异片段 ,其中包括正常组织表达而癌组织中不表达的差异片段 5 4个 ,癌组织中表达而正常组织不表达的差异片段 2 0个。②其中 1个片段C5 7(337bp)在GenBank数据库中没有发现同源的已知基因或片段 ,推测其可能为食管癌相关基因。③经NorthernBlot检测C5 7在癌组织中有表达信号。④原位杂交技术检测C5 7在癌组织中具有较高的阳性表达率 (74% )。结论 :食管癌组织中C5 7可能是新的食管癌相关的候选癌基因 ,它与食管癌的发生发展可能有关     

成束蛋白、细胞角蛋白14在食管鳞癌中的表达

目的 检测和分析食管鳞癌组织、癌旁正常鳞状上皮及食管鳞癌细胞系中成束蛋白（fascin）和细胞角蛋白14（CK14）的表达情况,探讨这两种细胞骨架蛋白及相关蛋白在食管鳞癌发生发展中可能的作用及在食管鳞癌诊断中的应用前景。方法 收集116例食管鳞癌组织标本,构建组织芯片。用免疫组化方法检测鳞癌组织与癌旁正常鳞状上皮中成束蛋白、CK14的表达情况,并分析它们与临床病理特征、预后的关系及两种蛋白之间的相关关系。用Western印迹方法检测12种食管鳞癌细胞系中成束蛋白、CK14的表达情况,并分析它们与生长和侵袭特点的关系。结果成束蛋白和CK14在食管正常鳞状上皮阴性（基底细胞除外）,在食管鳞癌组织明显上调,阳性率分别为79．3％和67．0％,两者联合阳性率高达86,2％。成束蛋白和CK14在高、中分化鳞癌中表达更高（成束蛋白在高、中、低分化鳞癌阳性率为87．1％、83．9％、62．1％,P=0．054;CK14在高、中、低分化鳞癌阳性率为87．1％、76．4％、27．6％,P〈0．01）。两种蛋白表达与预后无明显关系（P=0．8980和P=0,2610）。两种蛋白表达呈正相关（r=0．487,P〈0．01）。成束蛋白在绝大多数细胞系高表达,仅在生长和侵袭能力弱的TE12细胞系中无表达,而CK14仅在KYSE180细胞系中表达。结论 成束蛋白、CK14在食管鳞癌普遍表达上调,可能在食管鳞癌发生发展中起重要作用。联合应用还有望成为食管鳞癌诊断的有效标志物。     

子宫颈癌候选抑癌基因Syk表达及其启动子甲基化的测定

采用逆转录PCR（RT-PCR）法检测60例宫颈癌、50例宫颈上皮内瘤变（CIN）和20例正常宫颈组织中SykmRNA的表达,采用甲基化特异性PCR（MSP）检测Syk基因启动子甲基化情况。正常宫颈组织和CINⅠ组织中均有Syk基因表达,CINⅡ-Ⅲ组织56％（18／32）、宫颈癌组织35％（21／60）表达;有淋巴结转移的宫颈癌组织表达比例为1／13,无淋巴结转移者为43％（20／47）。宫颈癌组织中Syk基因启动子甲基化率57％（34／60）,明显高于CIN组织[18％（9／50）,X^2值为7．13,P〈0．01],正常宫颈组织和CINⅠ组织中均无Syk基因启动子的甲基化,淋巴结转移的宫颈癌组织比例为11／13;Syk基因及其启动子甲基化程度与患者年龄、肿瘤大小、临床分期、组织学类型及病理类型无明显相关性（P〉0．05）,与Syk基因表达缺失明显相关（P〈0．05）。Syk基因启动子甲基化可能是导致Syk基因失活的原因之一,可能与宫颈癌发生发展有关。     

fascin蛋白在76例胃癌中的表达及其与临床、病理因素的关系

目的:探讨fascin蛋白在胃癌组织中的表达及其临床意义。方法:收集76例胃癌病例的临床病理资料,用免疫组织化学方法检测胃癌组织及自身对照正常胃壁组织中fascin蛋白表达。结果:正常胃壁组织无fascin表达,76例胃癌中有24例(31.6%)fascin表达阳性,而且其表达与胃癌WHO病理组织学分类、TNM分期、浆膜侵犯、淋巴结转移及远处转移相关,与年龄、性别无统计学相关性。结论:fascin蛋白在部分胃癌中呈阳性表达,并与胃癌局部侵袭和转移相关;它有助于胃癌患者的预后判断。