人脐带间充质干细胞生物学特性及向类肝细胞的分化

目的: 研究脐带间充质干细胞(umbilical cord-mesenchymal stem cells, UC-MSCs)生物学的特性及向肝细胞分化的可能性.方法:从脐带中分离间充质干细胞, 体外行传代培养, 检测脐带间充质干细胞表面免疫标志、细胞周期和生长活性等, 利用肝细胞生长因子、成纤维生长因子4和抑瘤素等细胞因子诱导脐带间充质干细胞向肝细胞分化, 用免疫细胞方法对诱导和未诱导的细胞进行免疫学检测, 糖原染色进行功能鉴定.结果: 从人脐带中可分离到贴壁生长的间充质干细胞, 细胞形态类似成纤维细胞,可在体外进行长期稳定培养; CD29、CD105和Vimentin表达阳性, 基本不表达CD34、CD31, 经加入细胞因子可成功将间充质干细胞向肝细胞诱导分化, 分化的细胞表达肝细胞表面标志物ALB、AFP、CK18和CK19, 糖原染色呈现阳性.结论:人脐带中可成功分离到间充质干细胞, 细胞可实现体外长期培养, 表达脐带间充质干细胞的表面标志, 在体外脐带间充质干细胞诱导分化为肝细胞, 有望成为细胞替代治疗的理想来源之一.     

人脂肪干细胞诱导转化为心肌细胞的时期选择

目的:研究人心包外脂肪干细胞生物学性状,并探讨向心肌细胞诱导时期的情况。为脂肪干细胞移植治疗心肌梗死提供优良的种子细胞。方法:通过胶原酶消化法,由人心包外脂肪组织获得脂肪干细胞,通过细胞免疫学方法检测人心包外脂肪干细胞细胞表面抗原的表达,并定量分析;利用RT-PCR、real-time PCR法定量检测人心包外脂肪干细胞细胞多能性基因(Pluripotent mRNA)的表达;采用血细胞计数板计数并比较诱导获得的心肌细胞数量;免疫组织化学法检测诱导获得的心肌细胞表达心肌特异性抗α-actin、cTnT,进行表型鉴定。结果:人心包外脂肪干细胞体外培养过程中贴壁生长,通过形态学特征以及脂肪干细胞特异性相关抗原检测证实,得到高纯度人心包外脂肪干细胞。其表面标记物CD44、CD90表达阳性,并在3、4代传代细胞中荧光强度达峰值。多能性基因(Oct-4、Rex1、Nanog)的表达随细胞传代而下降。经心肌诱导培养基体外诱导培养后,分化的细胞大多呈肌细胞样,且在3、4代细胞数量达峰值。细胞免疫化学检测证实心肌特异性抗α-actin、cTnT表达阳性。结论:细胞表面荧光强度及多能性基因(Pluripotent mRNA)表达量的变化可影响脂肪干细胞向心肌细胞的诱导,脂肪干细胞处于传代早期时向心肌诱导的可能性大,因此可选择早期向心肌细胞的诱导,这可能为脂肪干细胞移植治疗心肌梗死奠定基础。     

人胚胎胰腺组织干细胞的分离鉴定和纯化

分离人胚胎胰腺组织中的胰岛细胞于体外培养,应用免疫细胞化学及RT-PCR的方法对其中的胰腺干细胞进行鉴定,并应用免疫磁珠的方法纯化其中的干细胞。结论是人胚胎胰腺组织中存在一定比例的干细胞,可以作为体外向胰岛素分泌细胞诱导分化的细胞来源。     

人骨髓间充质干细胞体外向血管内皮细胞诱导分化的研究

目的 体外研究人骨髓间充质干细胞(hMSCs)分化为血管内皮细胞的潜能,探讨作为血管组织工程种子细胞来源的应用前景.方法 用人淋巴细胞分离液通过密度梯度离心法分离出成人骨髓单个核细胞,经贴壁法获取 MSCs ,体外扩增培养并进行鉴定.在内皮细胞生长培养基(DMEM)中以血管内皮细胞生长因子(VEGF) 、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)定向诱导 hMSCs 向血管内皮细胞分化,观察细胞形态学变化,扩增培养后经流式细胞仪进行细胞表型鉴定和超微结构观察.结果 形态学观察显示,培养的人骨髓间充质干细胞经 bFGF 、VEGF 诱导后的 hMSCs 可见类似内皮细胞样改变,向血管内皮诱导分化24 d后,经流式细胞仪检测, CD34 表达转为阳性,而CD106、HLA-DR 表达明显上调.结论 在血管内皮细胞生长因子及碱性成纤维细胞生长因子诱导作用下, hMSCs 具有向内皮细胞分化潜能,产生功能性内皮细胞.     

人羊水来源c-kit+与c-kit-间充质干细胞生物学特征及体外心肌诱导分化能力的比较

目的比较人羊水来源c-kit＋与c-kit-间充质干细胞的生物学特征及体外心肌分化能力。方法通过常规产前诊断或自愿引产,以羊膜腔穿刺术获取14份孕中期羊水（15～31周）,通过流式细胞仪分选c-kit＋间充质干细胞,比较c—kit＋干细胞与c-kit-干细胞的细胞形态及生长曲线。流式细胞仪及免疫细胞化学分析对两种细胞进行表型鉴定,比较其体外向成骨、成脂及心肌样细胞诱导分化能力。RT-PCR和Westonblot检测相关基因及蛋白的表达。结果14份羊水标本中,有5份标本可以分选到c—kit＋羊水干细胞,分布在孕16-22周,分选的细胞数量占贴壁细胞的（3．30±1．24）％。羊水干细胞以成纤维状为主,可以稳定传代,体外培养可增殖到50代以上。经过c—kit分选后,细胞呈均匀一致的长纤维状,排列规律。C-kit＋及c-kit-羊水干细胞具有相似的生长曲线。两种细胞均具有间充质干细胞特征,表达间充质干细胞标记（CD29,CD44,CD73,CD90,CDl05）,不表达造血细胞系标记（CD34,CD45）,表达I类人类组织相容性抗原（HLA—ABC）,不表达II类人类组织相容性抗原（HLA—DR）。Oct-4及SSEA-4胚胎干细胞标记在c-kit＋干细胞的表达比率明显高于c．kit-干细胞。两种细胞在体外均可以向成脂细胞、成骨细胞分化。成脂细胞诱导后,可以看到细胞内脂滴聚集,油红0染色阳性。成骨细胞诱导后,可以看到钙盐沉积,VonKossa染色阳性。两种细胞分别与新生乳鼠心肌共培养,体外向心肌细胞诱导,c—kit＋羊水干细胞可以检测到GATA-4,α-actin,Cx43和cTnT基因及蛋白的表达。而c-kit-干细胞在诱导后只表达GATA-4的基因及蛋白。结论羊水来源c—kit＋及c—kit-干细胞均表达间充质干细胞表型特征,体外可以向成脂、成骨细胞分化。然而,c—kit＋干细胞的心肌样细胞分化能力明显强于c—kit-干细胞,可能与c—kit＋干细胞具有某些胚胎干细胞特征有关。     

间充质干细胞与慢性阻塞性肺疾病的治疗

自20世纪90年代以来,随着细胞生物学技术的发展及体外分离、培养人胚胎干细胞的成功,干细胞经适当诱导分化可发育为不同类型的细胞、组织和器官,成为移植供体的新来源。作为＂种子细胞＂的干细胞可以通过细胞工程的方法在体外发育为各种特异性的细胞供移植和细胞替代所需,并可作为基因疗法的靶细胞用于治疗和研究。     

shR-377联合细胞因子诱导人脂肪间充质干细胞向神经干细胞定向分化

目的探索sh R-377联合细胞因子诱导人脂肪间充质干细胞(HADMSCs)向神经干细胞(NSCs)定向分化。方法采用吸脂术获取健康青年人腹部大网膜脂肪组织,胶原酶消化法分离HADMSCs,行表型鉴定和细胞周期检测。sh R-377转染第三代HADMSCs,48 h后流式检测nestin表达率,72 h后行RT-q PCR和免疫细胞化学测定nestin和musashi,并对转化后细胞增殖培养分析。结果流式结果显示HADMSCs表面标志CD45及CD117表达呈阴性,CD29及CD44呈阳性,诱导24 h后nestin表达率为(64.6±3.2%);RT-q PCR结果表明诱导72 h后神经干样细胞球nestin、musashi表达阳性,免疫细胞化学染色可见nestin染色阳性。神经干样细胞球增殖培养7 d可见多个克隆球。神经干样细胞球进一步分化培养,可见到很明显的细长突触,双极或多极神经元样形态。结论 sh R-377联合细胞因子的诱导方法可以使HADMSCs定向分化为NSCs,诱导时间约48 h。转化时间和转化率比传统方法有较大提高,为体外大量获得NSCs提供了实验依据。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为心肌样细胞的实验研究

目的研究大鼠骨髓间充质干细胞的体外培养及向心肌样细胞转化的条件。方法获取成年大鼠胫骨干骨髓,采用贴壁法进行间充质干细胞的培养、传代,观察经5-氮胞苷诱导后骨髓间充质干细胞的生长和分化。结果大鼠骨髓基质细胞贴壁呈集落生长,5-氮胞苷诱导骨髓基质细胞转化为心肌样细胞。结论骨髓基质细胞能够在体外被诱导分化为心肌样细胞,为自体心肌细胞移植提供了一种良好的来源。     

骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为心肌样细胞的实验研究

目的 研究大鼠骨髓间充质干细胞的体外培养及向心肌样细胞转化的条件。方法 获取成年大鼠胫骨干骨髓，采用贴壁法进行间充质干细胞的培养、传代，观察经5-氮胞苷诱导后骨髓间充质干细胞的生长和分化。结果 大鼠骨髓基质细胞贴壁旱集落生长，5-氮胞苷诱导骨髓基质细胞转化为心肌样细胞，结论 骨髓基质细胞能够在体外被诱导分化为心肌样细胞，为自体心肌细胞移植提供了一种良好的来源。     

体外培养成人脂肪间充质干细胞及向平滑肌细胞诱导分化

目的 体外培养成人脂肪间充质干细胞,并应用转化生长因子β将脂肪间充质干细胞诱导分化为平滑肌细胞.方法 采用酶消化法和贴壁培养法分离培养脂肪间充质干细胞,流式细胞仪对第3代和第5代细胞进行表面抗原检测,对第5代细胞进行转化生长因子β诱导,于诱导后第10天进行免疫化学鉴定.结果 体外培养的脂肪间充质干细胞呈扁平的长梭形,细胞形态均一,传代稳定.干细胞相关标志CD29和CD44表达阳性,造血干细胞相关标志CD34随传代次数的增加由弱阳性逐渐转为阴性,内皮细胞相关标志CD31表达阴性.流式细胞仪检测结果 发现脂肪间充质干细胞中G0/G1、S和G2/M期的细胞分别占90.14%、3.77%和6.09%.转化生长因子β定向诱导后倒置显微镜下观察细胞呈"峰"、"谷"样形态,免疫荧光化学检测发现诱导组细胞α平滑肌肌动蛋白表达阳性.结论 成人脂肪组织中含有间充质干细胞,且可在转化生长因子β诱导后分化为平滑肌细胞.     

传代和冻存对胎肺间充质干细胞生长及分化的影响

目的 观察传代和冻存对胎肺间充质干细胞（MSCs）生长及分化的影响.方法 以胶原酶消化法自流产胎儿肺组织中分离MSCs,在体外进行传代扩增、冻存、复苏;然后,以相差显微镜观察细胞形态学变化,以流式细胞仪检测表型变化,以神经分化诱导方案研究其向神经元样细胞分化的潜能.结果 经传代和冻存后,人胎肺MSCs的增殖能力、形态和表面标志物的表达均无明显变化,高表达MSCs特异性标志物,不表达造血和内皮细胞标志物,在适宜的神经诱导方案作用下可高效分化为神经元样细胞.结论 传代和冻存对人胎肺MSCs的形态、表型和向神经样细胞的分化潜能无明显影响,胎肺MSCs可作为细胞移植治疗神经系统疾病的备选来源.     

用单层培养法诱导兔骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的实验研究

骨髓间充质干细胞(MSCs)因其具有多向分化潜能，易于分离，且体外扩增能力强，便于自体移植的特点，近年来被认为是最有希望的种子细胞来源。2000年以来，我们在体外培养条件下采用单层培养方式分阶段研究MSCs这一分化机制，研究骨髓间充质干细胞向成软骨诱导的条件、分化模型及其相互关系，从而为气管、甲状软骨等组织工程重建提供种子细胞的可能性。     

人胎肝干细胞的体外培养及诱导分化

为体外分离培养和诱导分化人胎肝干细胞 ,从原代分离培养人胎肝干细胞集落 ,免疫细胞化学鉴定细胞集落分子标志物的表达 ;在体外特定细胞因子作用下诱导干细胞定向分化为成熟肝脏细胞 ,对其生物学特性进行初步鉴定。结果 ,从人胎肝组织中成功分离表达AFP、Albumin、Cytokeratin等标志物的胎肝干细胞集落 ,在体外特定细胞因子作用下肝干细胞可定向分化为成熟肝脏细胞。因此人胎肝中同样存在具有干细胞特性的原始细胞 ,体外可定向分化为成熟肝细胞。人胎肝干细胞的分离培养对于生物型人工肝的制备及其深入研究奠定了良好的基础     

脐带间充质干细胞体外诱导分化为肝细胞样细胞的研究

目的探讨人脐带间充质干细胞（UC-MSCs）体外诱导分化为肝细胞的可行性和方法,观察分化后的细胞白细胞表面抗原表达的改变。方法采用酶学法从脐带全层组织中分离UC-MSCs,采用改良的肝分化培养体系体外诱导UC-MSCs向肝细胞分化。诱导后2、4周,观察细胞形态,免疫荧光细胞化学染色法检测甲胎蛋白（AFP）、白蛋白（ALB）;RT-PCR检测肝细胞标志性基因AFP、ALB和CK19 mRNA。ELISA法检测诱导后的细胞培养液中ALB水平。流式细胞仪检测诱导后细胞白细胞表面抗原HLA-Ⅰ和HLA-Ⅱ。结果从人脐带基质中分离培养的UC-MSCs在向肝细胞诱导分化培养体系的培养下,细胞形态由长梭形逐渐转化成为多角形或类圆形,并且表达AFP、ALB mRNA和蛋白,诱导后的UC-MSCs以时间依赖方式产生ALB,诱导后的细胞不表达HLA-DR。结论UC-MSCs具有向肝细胞分化的潜能,分化后的M细胞仍具有低免疫原性。     

胚胎及成年大鼠神经干细胞体外诱导向多巴胺能神经元分化

目的对来源于胚胎和成体大鼠中脑的神经干细胞体外诱导分化成多巴胺能神经元的能力进行比较研究。方法胚胎和成年大鼠神经干细胞分别培养于含有细胞因子IL-1、IL-11、GDNF、LIF的诱导分化液中,诱导分化6d后经流式细胞仪检测比较其分化的多巴胺能神经元的比率。结果免疫细胞化学染色均显示部分分化细胞呈TH染色阳性,流式细胞仪检测其诱导分化成多巴胺能神经元的比率分别为(17.8±4.2)%、(5.6±2.8)%,两者比较有显著性差异(P<0.01)。结论来源于不同发育阶段脑组织的神经干细胞其分化特性不同,胚胎大鼠神经干细胞较成年大鼠神经干细胞更易于向多巴胺能神经元分化。     

人骨髓间充质干细胞的体外多向分化潜能

目的体外观察人骨髓间充质干细胞(hMSCs)向成骨细胞、脂肪细胞及心肌细胞的分化。方法体外培养扩增hMSCs,流式细胞仪分析其免疫表型。取稳定传代的hMSCs,分别在体外向成骨细胞、脂肪细胞及心肌细胞分化,并采用碱性磷酸酶染色、油红O染色及PTAH染色鉴定3种诱导分化后的细胞。结果 hMSCs传代后形态上为典型的成纤维细胞样结构;流式细胞仪检测表明,hMSCs表达CD44、CD105,不表达CD31、CD34和CD45;hMSCs诱导分化后,细胞化学染色显示呈阳性表达的成骨细胞、脂肪细胞和心肌细胞。结论 hMSCs具有多向分化潜能,可向成骨细胞、脂肪细胞和心肌细胞分化。     

人骨髓间充质干细胞体外长期传代培养及恶性转化趋势实验研究

目的 探讨人骨髓间充质干细胞体外长期传代培养、扩增及其生物学特性,观察其恶性转化趋势的可能性.方法 采用密度梯度离心差速贴壁法对人骨髓来源的间充质干细胞进行分离纯化,并进行体外长期传代,观察细胞形态及生长方式;鉴定细胞分化能力;相关癌标志P53、Ki67的表达与成瘤性检测.结果 经过长期体外培养的人间充质干细胞,至36代时,细胞逐渐老化;成骨分化诱导能力丧失;相关癌标志表达阴性;无成瘤性.结论 人骨髓间充质干细胞在体外可以有限传代,无显著恶性转化趋势.     

大鼠脊髓神经干细胞的分离培养与鉴定

探讨胚胎大鼠神经干细胞（NSCs）的分离培养和鉴定方法。采用无血清培养液，从胚胎大鼠脊髓分离和培养NSCs，应用^3H-TdR掺入技术和免疫荧光技术进行细胞自我更新能力、巢蛋白表达和多向分化潜能的鉴定。结果表明，从E16胚胎大鼠脊髓分离培养的细胞具有NSCs特征，可在体外增殖存活，经1％胎牛血清诱导可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。认为从胚胎大鼠脊髓成功分离培养的NSCs可在体外稳定地培养和传代，是研究细胞移植和基因治疗的理想细胞来源。     

成人脂肪干细胞分离培养与鉴定

目的探讨成人皮下脂肪组织提取脂肪干细胞(ADSCs)的可能性。方法取健康成年人皮下脂肪组织,经酶消化法获得含有ADSCs的细胞悬液,差速贴壁法分离ADSCs、红细胞及少量脂肪细胞。体外培养第3代,噻唑蓝(MTT)法检测细胞生长曲线,免疫细胞化学法检测CD29、CD44、CD34及CD106,脂肪细胞诱导分化后进行油红O染色。结果倒置显微镜下观察原代培养细胞呈长梭形、漩涡状生长。免疫化学法检测结果显示细胞表面抗原CD44、CD29阳性表达,CD106、CD34阴性表达,说明分离培养的细胞是ADSCs。脂肪细胞诱导后进行油红O染色证明所得细胞具有向成熟脂肪细胞分化的能力。结论成人皮下脂肪组织可作为ADSCs种子来源,并且所得ADSCs具有分化能力。     

小鼠胚胎干细胞体外定向心肌细胞分化的研究

目的：小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cell,ES细胞）体外定向心肌细胞分化模型的建立。方法：通过悬滴培养技术定向诱导ES细胞分化为拟胚体,进而分化为心肌细胞,并用RT－PCR对四种肌肉肌动蛋白在EBs中的表达进行了鉴定。结果：在拟胚体和进一步分化的ES细胞中观察到自发节律性收缩的心肌细胞,α－平滑肌肌动蛋白（血管和胃肠道平滑肌）以及纹状肌肉肌动蛋白（心肌和骨骼肌）在这些心肌细胞样的细胞中均能表达。结论：小鼠胚胎干细胞体外定向心肌细胞分化模型的建立,可用于研究相关基因在心肌发育过程中的直接或间接作用,有助于胚胎干细胞衍生的心肌细胞用于临床治疗作用的研究。