SD大鼠骨髓间充质干细胞原代培养条件的选择

目的探讨分离及培养SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的最佳条件。方法选取不同周龄(2、3、4、8 w)的SD大鼠;采用全骨髓贴壁筛选法对不同的培养基(L-DMEM、DMEM/F12),血清体积分数(7.5%、10%、12.5%、15%、17.5%),首次换液时间(48、72、96 h),换液方法(全换液、半换液)分组进行培养,每日于倒置显微镜下观察细胞形态、数目的变化,细胞融合80%~90%时进行消化计数,记录达到传代要求的时间,取第三代细胞绘制BMSCs生长曲线,各组间免疫荧光检测CD34、CD44的表达率。结果 1第2~3周SD大鼠达到传代要求时BMSCs数目最多、所需时间最短,第8周BMSCs含量明显减少,难以形成集落生长,细胞融合不到50%;DMEM/F12培养基中的细胞贴壁早、活性强,L-DMEM培养基中的细胞生长缓慢,两组相比差异显著(P<0.05);72 h全换液和48 h半换液组细胞数目多,二者相比无统计学意义(P>0.05),24 h全换液细胞数目少,72h半换液杂细胞多,细胞呈全分布,二者增值速度慢,与前者相比差异显著(P<0.05);体积分数越高细胞生长分化越快,时间越短,但各组间比较无统计学意义(P>0.05),传代培养中高体积分数的细胞易老化。2接种圆形BMSC培养6 h后贴壁,分化成圆形、类圆形或多角形;72 h后有少量短梭形、星形细胞分散、贴壁生长,部分细胞伸出一支或多支伪足,类似于成纤维细胞;约6 d后BMSCs细胞集落呈放射状排列,伸出长短及粗细均不规则,伴形态各异的伪足、细胞胞核大、核仁清晰;约10 d细胞能融合80%~90%培养面;传代后24 h内可见细胞已完全贴壁,3 d可见以梭形为主的细胞铺满80%~90%培养面;经过1~2次传代后,细胞呈放射状或平行排列,形态趋于一致。3传代2 d后,细胞缓慢生长,处于生长停滞期;3 d起细胞转入对数生长期,4~5 d至高峰后转入平台期,细胞倍增时间约39.5 h。4传代BMSc存在CD44抗原表达,阳性率98.3%,而CD34呈阴性表达。结论全骨髓贴壁筛选法是一种获得高纯度BMSCs简单、有效的方法;在适宜的培养条件下(SD大鼠育龄为2~3 w,接种密度80%~90%培养面,培养基为DMEM/F12,合适血清体积分数为10%,72 h首次全换液)BMSCs在体外生长状态良好,增殖速度快,DAPI可作为标记BMSCs的一种有效手段,也可作为细胞免疫组化的基础染色。     

不同年龄人骨髓间充质干细胞体外培养增殖的研究

目的本研究分析不同年龄段人骨髓间充质干细胞的生长和增生情况,探讨年龄对于骨髓间充质干细胞的影响。方法采集61例不同年龄人的骨髓,分为少年组、中青年组和老年组,分离间充质干细胞,进行体外培养,观察其形态变化,对比分析其首次传代和每次传代时间、细胞克隆形成数量、细胞增长曲线的变化情况。结果体外培养的干细胞在形态上无年龄差异,均成梭形纤维状,早期呈克隆状生长。细胞的首次传代时间从少年到老年呈逐渐增加的趋势,老年组明显长于另外两组;3组的体外培养倍增时间无明显差异,但老年组的干细胞克隆数量减少（差异尚未达到统计学意义）,细胞的增殖显著低于另外两组（P<0.05）。结论人骨髓间充质干细胞的生长增殖能力随着增龄而逐渐减退,尤其在老年组呈现出更明显的变化。     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定

目的 探讨体外分离和培养大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的生物学特性,对其表型和生长曲线进行初步鉴定.方法 采用全骨髓培养法提取培养MSCs,绘制原代及三代细胞生长曲线,利用免疫组化法检测表面标志物CD34、CD44;流式细胞分析法检测表面标志物CD90.结果 成功培养出MSCs,免疫组化CD44阳性表达,CD34阴性表达;流式细胞术CD90阳性表达.结论 该实验分离培养的细胞群与MSCs的生物学特性相吻合,说明MSCs易于体外分离、培养和扩增.     

SD大鼠骨髓间充质干细胞的体外培养及表型、纯度鉴定

目的探索获得高纯度MSCs简单、系统的实验方法。方法采用贴壁培养法体外培养SD大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）,确定最佳接种密度,经数次传代后纯化,以表面抗原CD29、CD44作为标志分子,CD34作为阴性对照,免疫荧光法鉴定MSCs的生物学特性及纯度。结果以0．5—1×10^10个／L的细胞密度接种骨髓细胞原代培养时间明显缩短,免疫荧光法鉴定MSCs生物学特性好,第3代时已达较高纯度。结论本实验建立了较为理想的MSCs体外培养体系,纯化速度快,鉴定方法简单,为进一步研究MSCs生物学行为及临床应用奠定了基础。     

人骨髓间充质干细胞体外培养及其生物学特性分析

目的探讨人骨髓间充质干细胞（MSC）的体外分离培养方法,并分析其生物学特性。方法无菌条件下抽取健康志愿者骨髓,采用密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞,培养在含10%胎牛血清的DMEM培养基中,用贴壁筛选法纯化获得MSC。相差显微镜下观察细胞形态学变化,细胞计数法绘制生长曲线,流式细胞仪检测细胞表面抗原及细胞周期。结果原代和传代培养的细胞呈梭形,具有较强的生长增殖能力。细胞表面CD90、CD105表达阳性,CD34、CD11b阴性。第1、3、5代MSC生长曲线呈S形,均经历潜伏期、对数生长期和平台期。第3代MSC中,G0/G1期细胞约占77.42%,S＋G2/M期细胞约占22.58%。结论采用密度梯度离心结合贴壁筛选培养法可获得纯度较高的MSC,且该细胞增殖活性较强。密度梯度离心结合贴壁筛选培养法是一种简单、有效的分离纯化MSC的方法。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外向心肌细胞诱导分化的机制

目的 研究大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外向心肌细胞(CM)定向诱导分化的机制.方法 全骨髓贴壁法体外获取大鼠BMSC,流式细胞术检测CD44、CD45和CD105的表达率对其进行鉴定,以未加一抗只加二抗的BMSCs作为平行对照组.选用生长良好、纯度达到95％的P5代BMSCs,用5-氮杂胞苷(5-Aza)10 μmol/L进行诱导,对诱导后的细胞进行心肌特异性标志TroponineI的免疫组化检测.在诱导前及诱导2e以RT-PCR方法检测RhoA的表达变化.结果 体外分离纯化培养扩增出大鼠BMSCs,表达CD44、和CD105.经10 μmol/L 5-Aza诱导分化的BMSCs表达心肌特异性标记TroponineI;RT-PCR的结果显示,诱导后的BMSCs表达RhoA.结论 BMSCs可体外分离培养扩增,并具有向心肌细胞分化的潜能,5-Aza最佳诱导浓度为10 μmol/L.5-Aza体外可能通过RhoA途径在BMSCs分化为心肌细胞过程中起着重要调控作用.     

大鼠骨髓间充质干细胞培养方法改良与鉴定

目的纯化骨髓间充质干细胞(MSC),提高分离培养MSC的成功率。方法取清洁级健康Wistar成年雄性大鼠,应用体外细胞培养技术将成年大鼠MSC自股骨中分离、纯化和培养,采用免疫组织化学染色鉴定培养MSC表型。结果经培养存活的MSC呈长梭形或多角形,似成纤维细胞,免疫组织化学染色显示细胞表达CD29、CD44阳性,但CD34、CD45、胶原蛋白Ⅱ表达阴性。结论改良的培养方法能够提高分离培养大鼠骨髓MSC的纯度和成功率,可以为进一步研究其分化及应用提供实验基础。     

贴壁法体外培养纯化鼠骨髓间充质干细胞

目的 研究贴壁法体外分离、纯化及增殖鼠骨髓间充质干细胞(MSCs),并进行鉴定.方法 取出生5 d的Wistar乳鼠的股骨及胫骨,冲取骨髓,采用贴壁法分离筛选分离鼠的MSCs,通过传代进行纯化,增殖,测定其生长曲线,检测生长周期,流式细胞仪分析表面抗原.结果 贴壁培养法能够有效地分离鼠的MSCs,MSCs形态为均一的梭形,生长曲线呈S型,细胞周期显示第三代细胞约有80.89%处于G0/G1期,第三代以后细胞表面抗原CD90阳性,CD34、CD45阴性.结论 建立了一种较好的体外培养、纯化及扩增鼠MSCs的方法,适用于MSCs的进一步研究.     

大鼠骨髓间充质干细胞培养、鉴定及神经样细胞分化

目的建立稳定的大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外培养、纯化、扩增的实验体系,并进行细胞表面抗原的鉴定及定向诱导分化检测。方法采用全骨髓贴壁培养法分离、纯化大鼠BMSCs;观察细胞形态,采用细胞免疫化学染色及流式细胞术检测细胞表面CD90、CD29、CD34和CD45表达;分别使用β-巯基乙醇及碱性成纤维细胞生长因子诱导细胞向神经样细胞分化,采用Western印迹法检测诱导后神经标志蛋白[神经巢蛋白(Nestin)、神经元特异烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)]表达。结果培养至第3代的BMSCs,CD90、CD29表达阳性,CD34和CD45表达阴性;经诱导后,神经标志蛋白表达显著增高(P<0.05)。结论全骨髓贴壁培养法可分离、培养得到高纯度、具备相关生物学特性的BMSCs,且经诱导可定向分化为神经样细胞。     

一种改良大鼠骨髓间充质干细胞培养方法

目的建立大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的分离、改良培养、纯化方法,并进行细胞形态学观察、表面标志物鉴定及多向分化能力检测。方法通过改良全骨髓贴壁法对4周龄SD雄性大鼠脱颈处死,无菌条件下分离出骨髓进行原代培养、消化传代培养及纯化。对BMSCs进行形态学观察,收获第四代BMSCs进行流式细胞仪检测其细胞表面标记物CD90、CD29、CD34、CD45的表达率及向成脂方向诱导分化。结果 BMSCs的原代培养形态学观察可见骨髓细胞接种于培养皿后,细胞呈圆型,大小不一,悬浮于培养液中。24 h后部分细胞开始贴壁,呈圆形、梭形或多角形。通过换液去除未贴壁的杂质细胞,可见短梭形、星形细胞分散贴壁生长,四五天可见放射状排列的细胞集落,伸出长短不一、粗细不均的突起,梭形细胞为主,胞浆丰富,胞核大、核仁清晰。7~8 d细胞呈集落生长,融合80%~90%,呈漩涡状,同向排列,9~10 d细胞排列紧密,逐渐融合成片。传代培养可见消化传代后,传代细胞24 h完全贴壁生长。细胞形态均一,呈梭形生长,细胞生长旺盛。四至五天可传代1次。可稳定连续传代7代以上,细胞形态及生长速度未见明显变化。BMSCs表面标记物的表达通过流式细胞仪检测结果显示,培养的第4代大鼠BMSCs均一表达CD90,CD29,阳性率分别为96.9%,96.6%;而CD34,CD45,呈阴性,阳性率分别为0.395%,7.56%。BMSCs加入成脂诱导剂后18 d,诱导而成的脂肪细胞累积脂质,脂滴变大,合并呈串珠状,经油红O染色呈鲜红色。结论与传统全骨髓贴壁法相比,改良后的全骨髓贴壁法操作步骤简单,降低离心对细胞的损害,减少了污染机会,节省经费,且分离的BMSCs细胞活性高,可大量分离、纯化、扩增,所获细胞具有间充质干细胞的一般生物学特性,经诱导培养后具有多向分化潜能。可为组织器官缺损性疾病、恶性肿瘤等的治疗和组织工程提供充足的种子细胞来源,具有重要的现实意义。     

体外冲击波诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化

目的观察体外冲击波(ESW)对人骨髓间充质干细胞增殖活性的影响,为体外冲击波和hMSCs的临床应用提供理论依据。方法采用密度梯度离心法提取hMSCs。观察EJW诱导前、后细胞形态及生长状态变化,进行细胞内碱性磷酸酶(ACP)活性测定,X-线衍射分析细胞的矿物质沉积物情况。结果 5 kV、100频次的EJW可以明显促进hMSCs的生长。干预后的hMSCs贴壁率升高,钙结节形成增多;ALP总体水平高于对照组。干预后的hMSCs体外培养有大量的羟基磷灰石形成。结论低能冲击波在适宜强度下可诱导hMSCs向成骨细胞分化。     

骨髓间充质干细胞体外诱导神经干细胞分化的观察

来源于人胚脑组织的神经干细胞及来源于16岁非造血系统疾病患者的胸骨骨髓间充质干细胞(BMSCs),采用Transwell培养板在体外共同培养(共培养组),观察神经干细胞的形态变化,在共培养第7天用免疫荧光染色检测神经干细胞中神经元细胞特异性标志物特异性烯醇化酶(NSE),并与单纯低糖DMEM培养基培养的神经干细胞(对照组)进行比较.结果显示,共培养组中的NSE阳性细胞达32.7%±11. 5%,而对照组未见NSE阳性细胞,两组相比,P＜0.05.认为BMSCs在体外可诱导神经干细胞分化为神经元.     

小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养新方法

目的探讨一种新的小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养方法。方法分离小鼠3 d乳鼠双后肢,剔除肌肉筋膜组织,剪碎后接种于含10%胎牛血清的α-MEM中,观察细胞形态学变化,采用CCK8检测细胞增殖能力,绘制细胞生长曲线,采用流式细胞技术鉴定细胞表面抗原,并进行多向分化潜能鉴定。结果原代分离培养的小鼠骨髓间充质干细胞呈长梭形,从骨片周围爬出,传代后,细胞形态一致,生长良好;绘制的细胞生长曲线呈S型,流式细胞表型鉴定结果显示,培养的细胞高表达CD90、CD29,低表达CD11b、CD45,成脂油红O染色和成骨茜素红染色均呈阳性。结论采用小鼠3 d乳鼠骨片法能够成功培养出骨髓间充质干细胞,骨髓间充质干细胞可作为肝脏组织工程的种子细胞。     

骨髓间充质干细胞的研究进展及其应用前景

干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞群体,最新的分类方法是根据其来源将其分为四类:成体干细胞、胎儿干细胞、胚胎干细胞和核移植干细胞。胚胎性干细胞和成体干细胞除了来源不同,其最大的区别在于增殖能力和分化潜能的不同:胚胎性干细胞可无限增殖,而成体干细胞的增殖能力则有限;胚胎性干细胞分化潜能要较成体干细胞宽。成体干细胞的可塑性已经成为研究热点,目前有越来越多的实验结果都证实成体干细胞确实具有分化为多种细胞类型的潜能,因此成体干细胞成为生物医学领域中一个很好的研究手段,同时具有广阔的临床应用前景。成体骨髓来…     

大鼠骨髓间充质干细胞对胶质瘤的趋向性

目的 探讨大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)在体外和体内对胶质瘤细胞的趋向性.方法 免疫组织化学方法检测BMSCs和C6细胞CXCR4和SDF-1的表达.在体外应用Transwell试验检测BMSCs向C6胶质瘤细胞的迁移特性;BMSCs移植到荷瘤大鼠健侧脑内21 d后,荧光显微镜观察其迁移.免疫组织化学方法检测脑组织及肿瘤组织中CXCR4和SDF-1的表达.结果 仅少数BMSCs表达CXCR4,阳性率为0.86%;C6胶质瘤细胞表达CXCR4和SDF-1,阳性率分别为63.53%和48.42%.BMSCs在体外表现出明显的向胶质瘤细胞的迁移特性;免疫组织化学检测肿瘤组织CXCR4和SDF-1表达均呈强阳性,移植21 d后,BMSCs表现了明显的向脑内胶质瘤迁移的特性,广泛分布于肿瘤和正常脑组织之间的胼胝体、皮层和血管.结论 CXCR4和其配体SDF-1参与大鼠BMSCs向胶质瘤细胞的迁移.     

大鼠胎血与骨髓间充质干细胞分化能力的体外研究

目的：比较大鼠胎血和骨髓中间充质干细胞（MSC）体外培养过程中的生长特性及体外诱导两者向神经元样细胞分化的异同。方法：采用标准Ficoll-hypague技术分离大鼠胎血骨髓的单个核细胞（MNC），收获MSC传代培养，流式细胞仪检测细胞的免疫表型。β-巯基乙醇、二甲基亚砜、叔丁基对羟基茴香醚诱导MSC向神经元分化，免疫细胞化学法检测其特异性标志巢蛋白（Nestin）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、胶原纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。结果：2种MSC细胞形态、免疫表型无明显差异。定向诱导后，2种细胞均表达Nestin、NSE，但GFAP阴性。结论：大鼠胎血和骨髓MSC的细胞形态、生物学特性无明显差别；两者诱导分化为神经元碰细胞的能力无显著差异。胎血应是MSC的又一来源。     

两种成人骨髓间充质干细胞体外分离方法的比较研究

目的比较两种体外分离方法获得的成人骨髓间充质干细胞的形态、增殖能力和纯度。方法分别采用直接贴壁法和密度离心法分离成人骨髓间充质干细胞,观察细胞形态;采用MTT法绘制第3代细胞的生长曲线并计算对数期倍增时间;将1×105个第3代细胞连续培养扩增至第30天并计数细胞总数;采用流式细胞仪检测第3代细胞CD31、CD34、CD73、CD105和CD166等表型。结果两种方法获得的MMSCs均呈长梭状成纤维样细胞形态;直接贴壁法获得的细胞首次传代时间为10d,对数生长期倍增时间为30±5.6h,而密度离心法细胞首次传代时间为18d,对数生长期倍增时间为38±7.2h;连续培养至第30d时,直接贴壁法细胞总数约为密度离心法细胞的15倍;直接贴壁法第3代细胞表达CD73、CD105和CD166的阳性率均低于密度离心法（P〈0.05）。结论应用直接贴壁法和密度离心法均可有效分离成人骨髓间充质干细胞,直接贴壁法分离的细胞增殖能力更强,而密度离心法分离的细胞纯度更高。     

老龄兔骨髓间充质干细胞体外培养影响因素的研究

目的研究体外培养老龄兔骨髓间充质干细胞(MSCs)的影响因素。方法以密度梯度离心技术及贴壁筛选法相结合,在体外分离检测MSCs表面CD29、CD34、CD44、CD45的表达;诱导分化反向证明部分细胞可分化为成骨细胞及脂肪细胞,具有分化潜能,鉴定该细胞群为干细胞。细胞记数法计算MSCs倍增时间;观察供体自然老龄情况下,不同换液时间、不同血清浓度、不同种植密度等因素对MSCs生长的影响。结果MSCs CD29和CD44表达阳性,不表达造血干细胞标志CD34和CD45。高密度接种(3×106~4×106个/cm2),低浓度(8%~10%)血清的低糖DMEM培养,在体外可保持MSCs未分化增殖状态,并获得纯度较高同源性较好的干细胞群,高浓度血清(20%)并不加速细胞生长,而促进分化。结论MSCs具有体外多分化潜能,老龄供体骨髓中MSCs的生长、增殖特性受不同换液时间、不同血清浓度及不同种植密度等因素的影响。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为心肌样细胞的实验研究

目的研究大鼠骨髓间充质干细胞的体外培养及向心肌样细胞转化的条件。方法获取成年大鼠胫骨干骨髓,采用贴壁法进行间充质干细胞的培养、传代,观察经5-氮胞苷诱导后骨髓间充质干细胞的生长和分化。结果大鼠骨髓基质细胞贴壁呈集落生长,5-氮胞苷诱导骨髓基质细胞转化为心肌样细胞。结论骨髓基质细胞能够在体外被诱导分化为心肌样细胞,为自体心肌细胞移植提供了一种良好的来源。     

不同培养方法对骨髓间充质干细胞贴壁和纯度的影响

目的 探讨骨髓间充质于细胞(MSCs)理想的分离、培养方法.方法 将MSCs分别于普通培养瓶、Co60培养瓶、胶原培养瓶中培养,观察三批标本细胞贴壁情况;将3个批次标本细胞分别用IMDM、1640和Mesencult培养液培养,观察细胞纯化情况;流式细胞术检测细胞表面标志.结果 胶原培养瓶及Co60培养瓶细胞贴壁,情况明显好于普通培养瓶,且后者费用低;MesenCult培养体系能获得高纯度MSCs,且传代后细胞不易分化.流式细胞术示三种培养体系中细胞表型均表现为CD34(-)、CD45(-)、CD71(++)、CD44(++)、CD90(++).结论 应用Co60照射处理的培养瓶结合MesenCult培养基可以收获大量、高纯度的MSCs;本实验为MSCs进一步的研究及其用于临床提供了实验方法及依据.