IRF4逆转录病毒表达载体的构建及鉴定

目的将小鼠IRF4基因定向克隆入MSCV-IRES-GFP质粒,得到长期稳定表达IRF4的逆转录病毒载体.方法以含IRF4 cDNA质粒作为模板,PCR扩增所需目的片段;将该片段连接入MSCV-IRES-GFP质粒;以磷酸钙法转染293T细胞,收集病毒上清感染GP+E86细胞后,流式细胞术和蛋白印迹技术检测IRF4的表达.结果经琼脂糖凝胶电泳鉴定,目的片段成功连接到逆转录病毒MSCV载体上.逆转录病毒上清成功感染GP+E86细胞系.结论成功构建了小鼠IRF4逆转录病毒表达载体,并实现了IRF4在GP+E86细胞系中的外源性表达.     

小鼠骨生成诱导因子基因逆转录病毒载体的构建及其在293T细胞中的表达

目的 构建小鼠骨生成诱导因子(OIF)基因重组逆转录病毒载体,鉴定其在293T细胞中的表达。方法 PCR法扩增OIF-3FLAG基因,测序后克隆入逆转录病毒载体pMSCV PIG（Puro-IRES-GFP）的相应位点,构建重组逆转录病毒表达载体pMSCV PIG-OIF-3FLAG,并对重组体进行测序鉴定。应用脂质体分别将PMSCV PIG-OIF-3FLAG和VSVG、GAG-POL辅助病毒包装载体共转染至293T包装细胞,48 h后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（GFP）表达;收集包装细胞上清液,进一步用含有包装病毒的上清液再感染293T细胞,48 h后加入3 μg/mL嘌呤霉素（puromycin）,连续7 d,筛选病毒感染的稳定表达pMSCV PIG-OIF-3FLAG 的293T细胞株,分别采用Real-time PCR技术和Western blotting方法检测293T细胞OIF mRNA及其蛋白表达。结果 构建OIF基因逆转录病毒表达载体PMSCV PIG-OIF-3FLAG,经酶切及测序鉴定证实目的基因插入位点和读码框架正确;病毒感染293T细胞,经嘌呤霉素筛选稳定表达小鼠OIF的293T细胞株;Real-time PCR和Western blotting鉴定证实OIF mRNA和蛋白在该细胞株中呈高表达。结论 成功构建小鼠OIF基因的逆转录病毒载体,并获得稳定高表达OIF基因的293T细胞株。     

小鼠骨生成诱导因子基因逆转录病毒载体的构建及其在293T细胞中的表达

目的构建小鼠骨生成诱导因子（OIF）基因重组逆转录病毒载体,鉴定其在293T细胞中的表达。方法 PCR法扩增OIF-3FLAG基因,测序后克隆入逆转录病毒载体pMSCV PIG（Puro-IRES-GFP）的相应位点,构建重组逆转录病毒表达载体pMSCV PIG-OIF-3FLAG,并对重组体进行测序鉴定。应用脂质体分别将PMSCV PIG-OIF-3FLAG和VSVG、GAG-POL辅助病毒包装载体共转染至293T包装细胞,48h后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（GFP）表达;收集包装细胞上清液,进一步用含有包装病毒的上清液再感染293T细胞,48 h后加入3μg/mL嘌呤霉素（puromycin）,连续7d,筛选病毒感染的稳定表达pMSCVPIG-OIF-3FLAG的293T细胞株,分别采用Real-time PCR技术和Western blotting方法检测293T细胞OIF mRNA及其蛋白表达。结果构建OIF基因逆转录病毒表达载体PMSCV PIG-OIF-3FLAG,经酶切及测序鉴定证实目的基因插入位点和读码框架正确;病毒感染293T细胞,经嘌呤霉素筛选稳定表达小鼠OIF的293T细胞株;Real-time PCR和Western blotting鉴定证实OIF mRNA和蛋白在该细胞株中呈高表达。结论成功构建小鼠OIF基因的逆转录病毒载体,并获得稳定高表达OIF基因的293T细胞株。     

BALB/c小鼠MHCI类基因的克隆与逆转录病毒载体的构建

目的　构建BALB/c小鼠MHCI类分子的逆转录病毒表达载体。方法　用RT -PCR从BALB/c小鼠脾细胞基因组中扩增BALB/c小鼠MHCI类分子H -2Dd的编码基因 ,克隆于载体pGEM -T中。经EcoRI和XhoI双酶切后 ,亚克隆于逆转录病毒载体pMSCV ,构建pMSCV -H2Dd重组逆转录病毒表达质粒 ,并进行酶切和序列测定鉴定。结果　用EcoRI和XhoI双酶切鉴定证实 ,H -2Dd基因正确插入载体pMSCV。H -2Dd的编码基因经序列测定证实 ,与文献报道完全一致 ,阅读框架与设计相符。结论　成功构建BALB/c小鼠MHCI类分子编码基因的逆转录病毒载体 ,为进一步研究MHC分子在移植免疫中的作用奠定了基础     

标记基因在造血干/祖细胞基因转导中的研究

造血干细胞的研究和应用,为一些血液系统疾病,恶性肿瘤和遗传病的治疗带来了希望.造血干细胞能自我更新,能多向分化,是永不枯竭的造血源泉,是基因转移最理想的靶细胞,然而,显微镜无法分辨造血干细胞,而只能借助单克隆抗体等免疫学方法.     

人p58.2重组逆转录病毒载体的构建及稳定包装细胞系的鉴定

目的　构建并鉴定携带人p5 8 2基因的重组逆转录病毒载体及稳定的包装细胞系。方法　用PCR技术从pSPORT1-p5 8 2扩增出编码p5 8 2N端 1～ 3 45个氨基酸的全长基因 ,定向克隆入逆转录病毒载体pMSCVneo中 ,酶切鉴定 ;脂质体法将重组逆转录病毒转入包装细胞系PT67,G418筛选建立稳定产病毒的细胞株。结果　双酶切鉴定 ,成功构建重组逆转录病毒载体 ;重组逆录病毒载体转入包装细胞 ,经G418筛选 ,形成了抗性克隆 ,并测得病毒滴度为 3×10 5cfu/ml,提示构建携带人p5 8 2基因的逆转录病毒载体及稳定的包装细胞系成功。结论　构建人p5 8 2基因的逆转录病毒载体可行 ,并且可望成为一种很好的对血液系统疾病进行基因治疗的方法     

小鼠Ar18a基因逆转录病毒载体MSCV-GFP-Ar18a的构建

目的:克降小鼠Ar18a(mAr18a)cDNA,构建带有检测标签的逆转录病毒载体系统,并检测由该病毒系统介导的mAr18a基因在骨髓来源树突状细胞中的表达.方法:从培养的小鼠骨髓来源树突状细胞中提取总RNA,通过RT-PCR扩增出mAr18a基因片段,再将其克隆入pDrive克隆载体并测序.然后将mAr18a目的基因插入逆转录病毒载体MSCV-GFP中,以磷酸钙法转染294T包装细胞,收集病毒卜清感染树突状细胞后,通过流式细胞术检测mAr18a的表达.结果与结论:成功克隆了mAr18a的cDNA,并成功构建其重组逆转录病毒载体MSCV-GFP-Ar18a,该载体可有效将Ar18a基因转移到骨髓米源的树突状细胞中,转染效率达28.3%.     

MHC Ⅰ类基因逆转录病毒表达载体的构建及其在造血细胞中的表达

目的构建BALB/c小鼠MHC Ⅰ类基因的逆转录病毒表达载体并探讨该基因在C57BL/6小鼠造血细胞中的表达.方法由逆转录病毒载体pMSCV介导,将BALB/c小鼠的H-2Dd基因导人C57BL/6小鼠的造血细胞中,并用逆转录聚合酶链反应和流式细胞仪检测转染后基因的表达.结果用EcoRⅠ和Xho Ⅰ双酶切鉴定证实,H2Dd基因正确插入载体pMSCV.重组逆转录病毒感染的C57BL/6小鼠造血细胞整合了BALB/c小鼠的H2Dd基因,且能转录为mRNA,在其细胞膜上有H2Dd分子的表达.结论成功构建小鼠H-2Dd编码基因的逆转录病毒载体,该基因已稳定地整合进C57BL/6小鼠造血细胞的基因组内,且在细胞中得到表达.     

基因调控表达技术的建立及在多潜能造血干／祖细胞扩增调控中的应用

干细胞是一种原始多潜能的细胞,具有自我更新和定向分化的基本特征.为了克服干细胞数量少的不足,众多学者已经在积极探索干细胞的扩增方法.目前国内外采用不同细胞因子的组合方案来进行干细胞的扩增,但其扩增的结果存在很多问题,主要体现在:扩增的时间短,倍数低,扩增体系难于调控,扩增后的干细胞自我更新能力,可塑性及造血重建的功能均较扩增前下降.     

Islet-1基因逆转录病毒表达载体的构建

目的：分离大鼠胰岛素基因增强结合蛋白1（Islet-1）基因,构建plEGFP-C1-Islet-1逆转录病毒表达载体。方法：利用RT-PCR技术钓取大鼠Islet-1基因,克隆到测序载体PGET-1 TA 中,测序后再亚克隆到逆转录病毒载体plEGFP-C1中,通过脂质体2000将其导入包装细胞PA317中,经G418筛选后,获得阳性克隆。结果：RT-PCR产物为1 050 bp条带,经测序鉴定与GenBank中Islet-1基因的序列相同;构建的plEGFP-C1-Islet-1载体经酶切鉴定,证实Islet-1基因片段正确插入逆转录表达载体中。用共聚焦激光扫描显微镜观察导入Islet-1基因的PA317细胞,可见细胞发出绿色荧光。结论：分离得到了大鼠Islet-1基因并成功构建了plEGFP-C1-Islet-1表达载体。     

NK4基因重组慢病毒载体的构建及在肝癌细胞中的表达

目的 构建共表达人NK4基因和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的重组慢病毒载体,转染人高侵袭转移肝癌细胞LM3(HCCLM3),观察其转染效率及表达情况.方法 采用DNA重组技术,将NK4基因克隆至带EGFP的慢病毒表达载体pLenti6.3-内部核糖体进入位点序列(IRES)-EGFP中,并用脂质体介导法将慢病毒包装系统和带NK4基因的质粒pLemi6.3-NK4-IRES-EGFP共转染293T细胞,包装慢病毒并测定滴度.以不同感染复数(MOI)的重组慢病毒感染293T细胞,筛选最适MOI,以最适MOI重组慢病毒感染HCCLM3细胞,观察转染效率.Western blot法测定细胞中NK4蛋白表达水平.结果 成功构建共表达NK4基因和EGFP基因的慢病毒载体pLenti6.3 -NK4 -IRES-EGFP,并对其包装、纯化及浓缩后测定病毒滴度为1.08×108 TU/mL.重组慢病毒感染HCCLM3细胞筛选其最适MOI为7.转染后HCCLM3细胞中可见明显的NK4蛋白表达,而未转染细胞中无NK4蛋白的表达.结论 成功构建了NK4基因的重组慢病毒载体,有效地转染HCCLM3细胞后可高表达NK4蛋白.     

新抑癌基因PIG11高表达HepG2细胞株的建立

目的 构建人PIG11逆转录病毒载体,建立高表达PIG11基因的HepG2细胞,为进一步研究PIG11基因在肝癌细胞中的功能提供一个理想的试验平台.方法 将已有的peDNA3.1/NT-GFP-PIG11质粒用PCR法扩增出PIG11片段,构建含人PIG11 cDNA的重组质粒pLXSN-PIG11.重组载体经PCR鉴定和DNA测序分析.将该重组质粒用lipofeetamineTM2000转染包装细胞PA317,获得pLXSN-PIG11逆转录病毒.用病毒感染HepG2细胞,获得PIG11高表达的HepG2细胞株.结果 获得384 bp人PIG11基因,测序证明PIG11cDNA编码序列与Genbank中报道的一致,转染PA317细胞后用病毒上清感染HepG2细胞,经RT-PCR检测发现HepG2细胞中PIG11 mRNA表达明显升高.结论 成功构建了高表达PIG11基因的HepG2细胞株,为进一步研究其生物学行为奠定了基础.     

新抑癌基因PIGl1高表达HepG2细胞株的建立

目的构建人PIGll逆转录病毒载体，建立高表达PIGll基因的HepG2细胞，为进一步研究PIGll基因在肝癌细胞中的功能提供一个理想的试验平台。方法将已有的peDNA3，1／NT—GFP—PIGll质粒用PCR法扩增出PIGll片段，构建含人PIGllcDNA的重组质粒pLXSN—PIGll。重组载体经PcR鉴定和DNA测序分析。将该重组质粒用lipofeetamine^TM 2000转染包装细胞PA317，获得DLXSN—PIGll逆转录病毒。用病毒感染HepG2细胞，获得PIGll高表达的HepG2细胞株。结果获得384bp人PIGll基因，测序证明PIGlleDNA编码序列与Genbank中报道的一致，转染PA317细胞后用病毒上清感染HepG2细胞，经RT—PcR检测发现HepG2细胞中PIGllmRNA表达明显升高。结论成功构建了高表达PIGll基因的HepG2细胞株，为进一步研究其生物学行为奠定了基础。     

GM-CSF基因腺病毒表达载体的构建及其在树突状细胞的表达

目的构建人GM-CSF基因的重组腺病毒载体,探讨其在树突状细胞(DC)中的表达。方法设计一对GM-CSF基因上下游引物,以质粒pBlu-hGM-CSF为模板,经PCR扩增获得GM-CSF基因全部序列。片段回收后经酶切,定向插入腺病毒穿梭质粒,获得重组质粒pshuttle-CMV-GM-CSF。经双酶切、PCR及插入片段测序鉴定后,将正确重组体转化包含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183菌。同源重组后用选择性培养基筛选阳性克隆,提取质粒,将2种重组腺病毒质粒分别进行酶切、线性化、纯化,用脂质体转染293细胞。制备病毒上清并测定其滴度,并感染人树突状细胞。结果完成构建含有人GM-CSF基因的重组腺病毒,病毒滴度Ad-GM-CSF 5.2×109pfu/mL。RT-PCR及ELISA检测证实GM-CSF在DC中表达。结论构建重组腺病毒载体,并在DC表达GM-CSF抗原蛋白。     

小鼠4-1BBL基因真核表达载体构建及其在前列腺癌细胞中的表达

目的:构建含小鼠4-1BBL编码区cDNA序列的真核表达载体,并检测其在前列腺癌细胞株(PC-3)中的表达。方法:将目的基因m4-1BBL全长cDNA克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+),获得m4-1BBL定向插入重组子pcDNA3.1(+)m4-1BBL,采用限制性内切酶和测序鉴定是否成功构建。用脂质体法将重组质粒转入PC-3细胞,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测m4-1BBL在PC-3中的表达。结果:酶切鉴定和序列分析证实,重组质粒含有小鼠4-1BBL全长cDNA编码序列,转染实验表明m4-1BBL基因能在PC-3细胞中表达。结论:小鼠4-1BBL全长cDNA基因真核表达载体构建及其在PC-3细胞中的表达均获成功,为进一步研究莫定了基础。     

HMGB1基因真核细胞表达载体的构建及其在人脐静脉血管内皮细胞中的表达

  目的 构建HMGB1基因真核细胞表达载体并检测其在真核细胞中的表达?方法 提取人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)mRNA,反转录为cDNA?PCR 扩增HMGB1全长编码基因,构建成pcDNA-3.1-myc-his-B-HMGB1真核细胞表达载体?转染HUVEC,Western blot 检测转染后HMGB1基因的表达改变?结果 构建HMGB1全长基因真核细胞表达载体成功,酶切鉴定及测序鉴定表明载体构建正确,转染HUVEC后可检测到外源性蛋白的表达,对照组无外源性蛋白表达?结论 成功构建了HMGB1全长基因真核细胞表达载体并可转染至HUVEC中     

人胰岛素样生长因子-1逆转录病毒载体的构建及其在骨髓基质干细胞中的表达

目的构建人胰岛素样生长因子-1的逆转录表达载体,建立逆病毒介导的IGF-1基因转移系统。方法用逆转录-多聚酶链反应（RT-PCR）从人肝细胞克隆IGF-1的基因;经DNA测序分析证实后将目的基因插入逆转录病毒载体LXSN,制备pLXSN-IGF-1表达载体;借助阳离子脂质体转染包装细胞PA317,G418筛选阳性克隆,获取病毒上清;培养人骨髓基质干细胞,用病毒上清感染骨髓基质干细胞;采用RT-PCR及Western blot法检测目的基因在靶细胞的表达。结果经酶切电泳和DNA测序表明成功构建了IGF-1逆转录病毒表达载体,转染包装细胞后可以产生IGF-1逆转录病毒,病毒感染人骨髓基质干细胞后能够表达IGF1-1重组蛋白。结论成功建立逆转录病毒载体介导的IGF-1体外表达体系,能够快速、稳定地将IGF-1基因转入骨髓基质干细胞。     

含脂氧素A4受体同源基因真核表达载体的构建与转染系膜细胞

目的构建小鼠脂氧素A4受体同源基因(LRHG)的真核表达载体,克隆后转染小鼠肾小球系膜细胞,观察LRHG编码的脂氧素A4受体样蛋白(LRLP)在系膜细胞中的表达.方法应用PCR方法,以小鼠睾丸cDNA为模板,扩增出LRHG基因片段,插入质粒pGEM-T中,转化入大肠杆菌JM109.扩增阳性重组质粒,经酶切后纯化并测序鉴定目的片段.构建含6×组氨酸(His)基因的真核表达载体pcDNA3.1/LRHG-his,转化入大肠杆菌JM109扩增,酶切后再测序鉴定目的片段,抽提质粒后转染系膜细胞,进行Western blot鉴定LRLP的表达.结果测序鉴定表明,克隆的LRHG序列与GenBank中LRHG原序列100%符合,应用抗6×His抗体进行Western blot鉴定系膜细胞中有LR-LP的表达.结论成功地构建了真核表达载体pcDNA3.1/LRHG-his,并转染了肾小球系膜细胞,获得了稳定的表达.     

人midkine基因重组逆转录病毒载体构建及鉴定

目的 构建人中期因子(MDK)基因重组逆转录病毒载体,转染人胃癌SGC7901细胞株,为探讨MDK的生物学功能奠定基础.方法 扩增人MDK编码序列基因片段,经限制性内切酶酶切后将目的 片段插入pLXSN逆转录病毒载体.经酶切及测序鉴定后与pVSVG共转染GP293包装细胞,收集病毒上清感染人胃癌SGC7901细胞,G418筛选获得阳性细胞株.,结果酶切及DNA测序证实MDK基因重组逆转录病毒载体构建正确.病毒上清感染SGC7901细胞,G418筛选出阳性克隆,经实时定量PCR及Western blot检测发现SGC7901细胞中MDK mRNA及蛋白表达水平明显上调.结论 成功构建了高表达MDK的SGC7901细胞株,为进一步探讨其生物学功能奠定实验基础.