人白细胞介素24基因的克隆及在大肠杆菌中的高效表达

目的：构建人白细胞介素24（hIL-24）基因原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达hIL-24蛋白,并测定其生物学活性。方法：用PCR方法从含有hIL-24的质粒中扩增hIL-24 cDNA序列,测序鉴定正确后,应用基因重组技术构建PQE/hIL-24,并转入大肠杆菌(E.coli)M15。IPTG诱导表达目的蛋白,镍凝胶亲和层析纯化目的蛋白,SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析鉴定结果,应用外周血单核细胞（PBMCs）,通过ELESA法分别在48和72 h检测rhIL-24刺激的PBMCs中 IL-6、IFN-γ及TNF-α产生情况。结果：获得与GenBank中报道一致的hIL-24基因片段。SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析显示,获得具有hIL-24免疫原性、相对分子质量约为18 400目的蛋白。Ni²⁺-NTA agarose纯化得到单一条带蛋白, 获得rhIL-24蛋白刺激的PBMCs,PBMCs分泌IL-6、IFN-γ、TNF-α的水平显著高于未刺激前分泌水平(P<0.05),rhIL-24具有与天然hIL-24蛋白相同的生物学活性。结论 成功地构建了hIL-24的原核表达载体,在E.coli中高效表达了rhIL-24蛋白,获得了与天然hIL-24蛋白具有相同生物学活性的rhIL-24。     

小鼠白细胞介素-18高效真核分泌表达载体的构建及活性测定

目的克隆小鼠白细胞介素-18（mIL-18）基因，构建重组表达质粒，在结肠癌中表达重组小鼠白细胞介素-18（mIL-18），并对其生物学活性进行初步鉴定。方法利用RT-PCR方法从小鼠腹腔巨噬细胞（Mψ）扩增出成熟肽编码区cDNA（474bp），克隆到表达载体pSecTag2B（含有分泌信号肽Igc）中；然后转染成纤维细胞，培养上清用小鼠的IL-18 ELISA试剂盒检测分泌有活性的mIL-18。结果构建的pSecTag2B-mIL-18可在成纤维细胞中分泌表达，mIL-18可诱导T淋巴细胞分泌IFN-γ。结论成功构建pSecTag2B—mIL-18表达载体，表达的IL-18刺激T淋巴细胞分泌IFN-γ。     

prk基因非融合表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的：构建prk基因的非融合表达载体，并诱导表达。方法：PCR扩增并回收prk基因片段，将其与亚克隆载体pMDl8-T重组，通过蓝／白斑筛选、酶谱分析和序列测定鉴定出重组质粒，然后从该重组质粒上切下prk基因片段，再克隆至非融合表达载体pBV220中，酶谱分析鉴定出正向重组质粒，诱导含有正向重组质粒的宿主菌表达蛋白，提取全菌总蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。结果：成功构建并筛选出pBV220正向重组质粒，经热诱导表达，得到一可溶性的相对分子质量为65ku的重组蛋白。结论：pBV220-prk表达载体的成功构建和表达，说明扩增所得的基因具有正确的阅读框架，使获得天然Prk蛋白成为可能．为进一步研究prk基因的生物学功能奠定了基础。     

人白细胞介素-18在大肠杆菌中的高效表达

目的 在大肠杆菌中实现人IL－18成熟蛋白（mhIL-18）的高效表达。方法 采用RT－PCR由人肝脏Kupffer细胞中扩增mhIL-18基因，构建非融合型原核表达质粒petTT/mhIL-18，转化至大肠杆菌DH5α，用IPTG诱导热处理重组蛋白表达，超声裂解细胞提取包涵体，采用SDS－PAGE及Western blot分析重组蛋白的表达，包涵体蛋白经8mol/L尿素溶解，透析复性，ELISA检测重组蛋白诱导人外周血单个核细胞（PBMC）产生IFN－γ的能力。结果 所扩增的mhIL-18基因与GenBank公布的序列一到，经IPTG诱导，mhIL-18在大肠杆菌中的表达量占菌体蛋白的40％以上，，在细胞中以包涵体形式存在，复性的重组蛋白具有诱生IFN-γ的能力。结论 mhIL-18可在大肠杆菌中高效表达。     

人白细胞介素16的基因克隆及其表达载体的构建

目的通过从人外周血单个核细胞(PBMC)中克隆编码人IL-16的cDNA基因,构建人IL-16的原核高效表达系统。方法从组胺刺激的正常人外周血单个核细胞中分离总RNA,利用半巢式RT-PCR、T-A克隆等技术得到特异的cDNA片段;将含有IL-16 cDNA的质粒IL-16-PUC18和原核表达载体PMAL-C2经酶切、目的DNA片段的分离、重组连接、筛选、序列分析等系列操作,获得重组质粒PMAI-C2-IL-16,将重组质粒转化至大肠杆菌DH5α,用IPTG诱导表达工程菌,Westem blotting检测表达产物。结果经序列测定证实,所得片段为IL-16cDNA;Western blotting检测重组体中确有抗IL-16抗体的融合蛋白表达。结论成功克隆了中国人IL-16 cDNA,并表达了IL-16融合蛋白。     

hBDNF原核表达载体的构建及其表达

目的:利用基因重组技术构建人脑源性神经营养因子(human brain-derived neurotrophic factor,hBDNF)的原核表达载体pBV220/mhBDNF,诱导表达融合基因,鉴定BDNF的生物学活性。方法:制备重组质粒pGEM-T/hBDNF及hBDNF的成熟肽基因片段,经限制性内切酶联合酶切,将hBDNF亚克隆到原核表达载体pBV220,诱导表达克隆基因,培养鸡胚背根神经节,检测表达蛋白的活性。结果:重组原核表达质粒pBV220/mhBDNF构建正确,表达框架未发生改变。成功诱导表达了融合基因并成功地分泌表达hBDNF蛋白。表达蛋白组可见大量神经突起自神经节组织块外周缘向四周呈放射状长出,损伤组未见明显神经突起长出。结论:成功构建了原核表达载体pBV220/mhBDNF,重组质粒可分泌表达hBDNF蛋白,而且hBDNF蛋白有良好的生物活性。本实验为进一步开展hBDNF基因治疗感音神经性耳聋提供了可能。     

hBDNF原核表达载体的构建及其表达

目的：利用基因重组技术构建人脑源性神经营养因子（human brain-derived neurotrophic factor, hBDNF）的原核表达载体pBV220／mhBDNF,诱导表达融合基因,鉴定BDNF的生物学活性。方法：制备重组质粒pGEM-T／hBDNF及hBDNF的成熟肽基因片段,经限制性内切酶联合酶切,将hBDNF亚克隆到原核表达载体pBV220,诱导表达克隆基因,培养鸡胚背根神经节,检测表达蛋白的活性。结果：重组原核表达质粒pBV220／mhBDNF构建正确,表达框架未发生改变。成功诱导表达了融合基因并成功地分泌表达hBDNF蛋白。表达蛋白组可见大量神经突起自神经节组织块外周缘向四周呈放射状长出,损伤组未见明显神经突起长出。结论：成功构建了原核表达载体pBV220／mhBDNF,重组质粒可分泌表达hBDNF蛋白,而且hBDNF蛋白有良好的生物活性。本实验为进一步开展hBDNF基因治疗感音神经性耳聋提供了可能。     

霉酚酸对21例系统性红斑狼疮患者细胞因子释放及Th细胞亚群的作用研究

目的：研究霉酚酸(MPA)对系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血Th细胞亚群平衡的作用。方法：分离2l例SLE患者及14例健康对照的外周血单个核细胞(PBMCs)，分别加或不加MPA培养48h，用ELISA法测培养上清中IL-10、IL-12和IFN-γ的水平，用三色流式细胞术检测培养细胞中CD4^ IFN-γ^ IL-10-T细胞、CD4^ IFN-γ-IL-10^ T细胞及CD4^ IFN-γ-IL-10^ T细胞百分率。结果：SLE患者PBMCs培养上清中IL-10、IL-12、IFN-γ等细胞因子水平显著升高，MPA可使SLE患者PBMCs自发产生或PHA刺激产生的IL-10、IL-12和IFN-γ的水平显著降低；SLE患者培养的PBMCs中CD4^ IFN-γ^ IL-10^ T细胞亚群和CD4^ IFN-γ^ IL-10^ T细胞亚群百分率显著增高，而MPA可导致用或未用PHA刺激培养的PBMCs中CD4^ IFN-γ^ IL-10-T细胞、CD4’IFN-γ-IL-10^ T细胞及CD4^ IFN-γ^ IL-10^ T细胞阳性率下降，尤其是可使SLE异常升高的CD4^ IFN-γ-IL-10^ T细胞亚群和CD4^ IFN-γ^ IL-10^ T细胞亚群百分率显著降低。结论：MPA治疗SLE的疗效作用可能与抑制IL-10、IL-12和IFN-γ等细胞因子的异常释放及抑制CD4^ IFN-γ^ IL-10-T细胞、CD4^ IFN-γ-IL-10 T细胞及CD4^ IFN-γ^ IL-10^ T细胞亚群的活化增殖有关。     

弓形虫P30基因非融合蛋白表达的研究

目的：构建弓形虫主要表面抗原P30基因的原核表达载体并在E.coli中进行表达。方法：采用定向克隆的方法。将PCR扩增得到的P30片段，插入原核表达质粒pBV220上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，于氨苄LB培养平板上筛选阳性克隆，经过酶切及PCR扩增鉴定重组子，将含阳性重组子pBV220-P30的工程菌经温度诱导表达，SDS-PAGE电泳及免疫印迹分析。结果：成功构建了pBV220-P30重组质粒；SDS-PAGE电泳及Western-blot显示表达P30非融合蛋白的分子量为29kD，且能被弓形虫高免鼠血清识别。结论：从弓形虫基因组DNA中获取P30基因。并成功构建了pBV220-P30重组质粒，诱导表达了P30非融合蛋白，对弓形虫病基因疫苗研制奠定了基础。     

可溶性重组人睾丸前列腺素D合成酶的原核表达及活性鉴定

目的 得到纯化的、可溶性的、且有活性的重组人睾丸前列腺素D合成酶（rhtL-PGDS)。方法 通过降温诱导重组质粒pGEX-2T/htL-PGDS表达，获得了可溶性重组融合蛋白。用谷胱甘肽琼脂糖珠纯化和凝血酶酶切重组融合蛋白制备纯化的rhtL-PGDS。根据L－PGDS与视黄酸结合后发生波谱红移鉴定其活性。结果 诱导温度从37℃降至15℃，重组融合蛋白以可溶性形式表达。通过凝血酶酶切和谷胱甘肽琼脂糖珠纯化获得了纯化的rhtL-PGDS。rhtL-PGDS与视黄酸结合后波谱从342nm迁移至374nm，证实rhtL-PGDS具有生物学活性。结论 降温诱导重组质粒pGEX-2T/htL-PGDS可避免包涵体形成，获得可溶性的具有生物学活性的rhtL-PGDS。