IL-21单独或联合IL-15／IL-2对G-CSF动员人外周血单个核细胞体外增殖和抗肿瘤活性作用研究

本研究探讨IL-21单独或联合IL-15／IL-2对G—CSF动员的人外周血单个核细胞（G-PBMNC）体外增殖和抗瘤活性的影响，评价IL-21及相关细胞因子组合在肿瘤免疫治疗方面的可行性。应用IL-21单独或联合IL-15／IL-2体外培养G—PBMNC，用CCK-8法进行细胞增殖分析；以白血病细胞株K562为靶细胞。用CFSE／PI流式双染法检测其对肿瘤的杀伤作用；用流式细胞术分析免疫细胞表型。结果显示：培养72小时后单独IL-21因子组对靶细胞杀伤活性与IL-2结果相近；当效靶比为25：1时IL21＋IL15／IL21＋IL15＋IL2组与IL21＋IL2组相比杀伤能力有显著增强（P〈0．05）；效靶比50：1时，细胞因子联合应用组均显著高于细胞因子单独应用组（P〈0．05），以IL21＋IL15＋IL2诱导效果最佳。复苏冻存的G-PBMNC处理结果与新鲜的G—PBMNC结果基本-致。细胞因子组和对照组相比CD3、CD4和CD8抗原表达有所增加，以IL21＋IL15组的CD4、CD3^- 56^＋和CD3^＋56^＋抗原表达增加最为显著（P〈0．05）。结论：IL-21可增强G—PBMNC的体外杀伤活性，联合IL-15可更显著提高G—PBMNC的抗瘤活性。     

白细胞介素12单独或联合白细胞介素2对人脐血单个核细胞抗肿瘤活性的研究

目的　探讨白细胞介素 12 (IL 12 )单独或联合白细胞介素 2 (IL 2 )对人脐血单个核细胞(CBMC)抗肿瘤作用的影响。方法　采用3 H TdR释放法测定经IL 12和 (或 )IL 2刺激的CBMC和人外周血单个核细胞 (PBMC)的抗肿瘤活性 ,及在电镜下观察激活的CBMC所杀伤的K5 6 2细胞的形态特征。结果　① 10IU/mlIL 12激活的CBMC即产生较强的杀伤活性 ,对K5 6 2及Raji细胞的杀伤率分别为 (2 7.2 3± 4.92 ) %和 (2 9.12± 3.46 ) % ;10IU/ml的IL 12、IL 2共用能产生明显的协同作用 ,对两靶细胞的杀伤率分别达 (47.6 0± 4.6 0 ) %和 (38.6 9± 4.86 ) %。②CBMC经IL 12和IL 2刺激不同时间 ,对K5 6 2及Raji细胞的杀伤率不同 ,短时间培养增强对K5 6 2细胞的杀伤活性 ,较长时间则增强对Raji细胞的杀伤活性。③未经细胞因子刺激的CBMC无明显的NK活性 ;经 10IU/mlIL 12刺激后 ,其NK活性与经相同剂量IL 12刺激的PBMC相当 ;两细胞因子合用均能协同增强CBMC和PBMC的NK活性 ,但前者低于后者。④激活的CBMC与K5 6 2细胞作用后 ,后者呈现明显凋亡特征。结论　IL 12激活的CBMC具有显著的抗肿瘤活性 ,与IL 2合用则效果更佳。     

未动员的外周血造血干细胞采集效果及影响因素

目的探讨未动员的外周血造血干细胞(PBSC)采集效果及影响因素。方法应用血细胞分离机对112例未经重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)动员的健康供者进行PBSC采集,并分析年龄、体质量指数(BMI)、采集前血常规指标、采集循环血容量、处理血量及循环次数等因素对男女两组供者所采集获得的单个核细胞(MNC)、CD34+计数的影响,同时比较分析男女两组供者采集前血常规指标及采集过程、采集物等指标。结果男性组年龄,BMI,采集前血细胞比容(Hct)、血红蛋白(Hb)、MNC计数、白细胞(WBC)计数,总循环血量高于女性组,而采集处理血量、采集物中MNC计数低于女性组,差异均有统计学意义(P<0.05)。在男性组中,采集物中MNC计数的影响因素为采集循环数(P=0.018),CD34+计数的影响因素为采集前血小板(PLT)计数(P=0.048)。女性组年龄、采集前PLT计数、WBC计数、MNC百分比、MNC计数是采集物中MNC计数的影响因素(P<0.05),采集前Hct、PLT计数及采集处理血量是采集物中CD34+计数的影响因素(P<0.05)。结论未经rhG-CSF动员的健康供者其外周血中存在一定数量的MNC、CD34+细胞,并能采集到满足临床嵌合抗原受体T细胞疗法所需要的MNC阈值。健康供者不同年龄、性别、总循环血量等可致采集效果不一致;采集前关注血常规中PLT计数有助于预测PBSC采集效果。     

G－CSF对化疗后外周血干细胞动员作用的影响

通过对１１例急性白血病患者单独化疗与化疗后加用粒细胞集落刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）的对比，动态观察了Ｇ－ＣＳＦ对外周血造血干细胞（ＰＢＳＣ）的动员作用。发现化疗后加用Ｇ－ＣＳＦ比单用化疗的粒－巨噬细胞集落形成单位（ＣＦＵ－ＧＭ）增加５．１倍，红系爆式集落形成单位（ＢＦＵ－Ｅ）增加４．５倍。Ｇ－ＣＳＦ还可使ＣＦＵ－ＧＭ＞１００／ｍｌ和ＢＦＵ－Ｅ＞２００／ｍｌ的持续时间延长；化疗后ＣＦＵ－ＧＭ的最高值提早出现，而不影响ＢＦＵ－Ｅ／ＣＦＵ－ＧＭ比值。结果表明，化疗后加用Ｇ－ＣＳＦ可明显提高ＰＢＳＣ的收集效率，Ｇ－ＣＳＦ是一种有效的ＰＢＳＣ动员剂。     

IL—12单独或联合应用IL—2对脐血单个核细胞增殖及杀瘤活性的影响

目的 观察白细胞介素１２（ＩＬ－１２）和／或白细胞介素－２（ＩＬ－２）对脐血单个核细胞（ＣＢＭＣ）增殖和抗肿瘤活性的影响。方法 分别以＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入法和＾３Ｈ－ＴｄＲ释放法测定增殖作用及抗瘤活性。结果 ＩＬ－１２单不能促进ＣＢＭＣ增殖,但能与ＩＬ－２协同增强ＣＢＭＣ的增殖作用。１０ＩＵ／ｍｌ ＩＬ－１２和同浓度ＩＬ－２合用能使ＣＢＭＣ产生较强的抗肿瘤作用,对Ｋ５６２及Ｒａｊｉ细胞的杀经分别是（     

rhIL-11联合rhG-CSF动员小鼠外周血造血干/祖细胞的研究

目的　研究rhIL 11对小鼠巨核系造血干 /祖细胞的动员作用。方法　rhIL 112 5 0μg·kg-1·d-1或联合rhG CSF 2 5 0 μg·kg-1·d-1给C5 7BL/ 6小鼠皮下注射 1～ 7d ,观察用药前和用药第 3,5 ,7,9天小鼠外周血白细胞、血小板计数 ,CD34 +细胞比例 ,CFU GM、CFU MK、CFU E的数量变化。结果　单用rhIL 11或与rhG CSF联合使用时 ,外周血白细胞、血小板、CD34 +细胞比例及各种造血细胞集落数明显高于对照组 (P <0 .0 1)。在含有IL 11的实验组中 ,CFU MK明显高于rhG CSF组 (P <0 .0 1)。结论　rhIL 11可升高外周血白细胞、血小板 ,同时增加外周血CD34 +细胞的比例 ,提高粒、红、巨核系造血细胞集落形成单位的数量 ,特别是对CFU MK作用较强 ;与rhG CSF联合使用对动员骨髓造血干 /祖细胞进入外周血有明显的协同作用。     

母乳单个核细胞IL－6，G－CSF分泌水平的研究

目的探讨母乳单个核细胞IL -6 ,G -CSF的分泌水平及其对新生儿的免疫保护作用。方法用ELISA法测定 5 0名健康产妇的初乳、过渡乳及外周静脉血活化的单个核细胞培养上清IL -6浓度 ,用酶标法测定各组粒细胞集落刺激因子 (G -CSF)浓度。结果①母乳单个核细胞经激活后能分泌IL-6和G -CSF。②初乳单个核细胞IL -6的分泌水平明显高于过渡乳 (P <0 .0 5 )。③初乳 ,过渡乳单个核细胞G -CSF分泌水平无显著性差异 (P >0 .0 5 )。④母乳与母外周血IL -6 ,G -CSF的分泌水平无明显相关 (P >0 .0 5 )。结论母乳单个核细胞经活化后产生的IL -6和G -CSF可能对新生儿产生免疫保护作用     

G-CSF动员供者外周血单个核细胞输注治疗异基因造血干细胞移植后复发白血病的临床研究

目的观察重组人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员的供者外周血单个核细胞输注治疗异基因造血干细胞移植后,白血病复发的有效性及安全性。方法对2009年7月至2011年2月该科20例异基因造血干细胞移植后复发的白血病患者,予以输注G-CSF动员后供者外周血单个核细胞。其中5例急性淋巴细胞白血病-CR2,8例急性髓系白血病-CR2,2例急性髓系白血病-CR3,3例急性混合细胞白血病,2例加速期慢性髓系白血病。在异基因造血干细胞移植后,半年内,20例患者均复发,予G-CSF动员后,供者外周血单个核细胞输注,每次输注细胞量按1×105/kg、2×105/kg、4×105/kg逐级增加,每次输注间隔4周。结果 12例患者再次完全缓解,8例患者未缓解。输注后,3例患者发生了Ⅰ~Ⅱ度急性移植物抗宿主病,12例患者发生了慢性移植物抗宿主病,5例未发生并发症,未观察到输注相关的全血细胞减少。结论 G-CSF动员供者外周血单个核细胞输注治疗异基因造血干细胞移植后,白血病复发有较好的疗效,不良反应小,值得临床进一步推广。     

人外周血树突状细胞的体外诱导培养

目的研究rhGM-CSF和rhIL-4培养体系对树突状细胞(DendriticCell,DC)的诱导培养。方法分离正常人或多发性骨髓瘤(MM)患者外周血中单个核细胞,体外培养树突状细胞。观察培养的DC的形态变化,并应用流式细胞仪分析DC表面的免疫分子的表达。结果100ng/mlrhGM-CSF和500U/mlrhIL-4能使正常人或多发性骨髓瘤患者外周血中单个核细胞分化发育为高表达CD80、CD86、HLAⅠ类和HLAⅡ类抗原的DC。结论rhGM-CSF和rhIL-4能使树突状细胞定向分化成为抗原提呈细胞,为DC疫苗治疗肿瘤感染性疾病奠定了基础。     

人外周血树突状细胞的体外诱导培养

目的研究rhGM-CSF和rhIL-4培养体系对树突状细胞(Dendritie Cell,DC)的诱导培养.方法分离正常人或多发性骨髓瘤(MM)患者外周血中单个核细胞,体外培养树突状细胞.观察培养的DC的形态变化,并应用流式细胞仪分析DC表面的免疫分子的表达.结果100ng/ml rhGM-CSF和500U/ml rhIL-4能使正常人或多发性骨髓瘤患者外周血中单个核细胞分化发育为高表达CD80、CD86、HLAⅠ类和HLAⅡ类抗原的DC.结论rhGM-CSF和rhIL-4能使树突状细胞定向分化成为抗原提呈细胞,为DC疫苗治疗肿瘤感染性疾病奠定了基础.     

急性白血病病人外周血单个核细胞端粒酶活性定量分析

为建立一种简便，定量检测端粒酶活性的方法应用于白血病病人外周血单个核细胞（MNC）端粒酶活性分析，在应用端粒重复序列扩增法后在扩增产物内加入荧光染料PicoGreen ,并在激光480nm和发射光520nm下检测荧光强度。对20例正常人和25例急性白血病病人外周血单个核细胞的端粒酶活性进行了定量分析，结果表明，PicoGreen能特异结合双链DNA，荧光强度随双链DNA量的增加而增加。结论：该方法简单、快速，能定量，可用于急性白血病病人外周血单个核细胞端粒酶活性分析，并提示急性白血病病人外周单个核细胞的端粒酶活性明显高于正常人。     

利用外周血单个核细胞生产成熟红细胞

体外制备红细胞的方法大多使用脐血、骨髓或外周动员的CD34＋细胞或胚胎干细胞作为起始材料.本研究利用外周血单个核细胞为原料在体外生产成熟红细胞.以血液滤涂白细胞后剩余的白膜层为原料,从中分离出单个核细胞,然后通过4步培养法制备成熟的红细胞.结果表明：经过不同细胞因子组合的诱导以及小鼠基质细胞系MS-5的支持培养,外周血单个核细胞的扩增倍数达到约1 000倍,其中约90％的细胞是与正常红细胞形态相似的无核成熟红细胞.集落形成能力分析显示,本研究培养体系可使单个核细胞中的祖细胞增殖并且只向红系方向分化.结构和功能分析结果表明,体外培养出的红细胞的平均细胞体积（MCV）为118±4fl,比正常红细胞（80-100 fl）稍大.平均血红蛋白含量（MCH）为36±1.2 pg,比正常的红细胞水平（27-31 pg）稍高.红细胞的最大变形指数（DImax）为0.46,接近正常红细胞水平.葡萄糖6磷酸脱氢酶及丙酮酸激酶的含量与年轻红细胞的特性一致.结论：利用外周血白膜层中含有的造血干祖细胞,通过体外培养能够生产出成熟红细胞,它是一种取材方便、成本低廉的红细胞生产原料,本研究培养体系适于利用单个核细胞生产成熟红细胞.     

IL-10 对 IL-6诱导外周血单个核细胞组织因子表达的调节作用

为了观察抗炎因子白细胞介素10(IL10)对炎症因子白细胞介素6(IL6)诱导人外周血单个核细胞(PBMNC)组织因子(TF)表达的影响,以探讨抗炎因子在急性冠状动脉综合征(acutecoronarysyndrome,ACS)发病机制的作用,用一期凝固法、ELISA和细胞发色底物分析检测不同浓度的人重组IL10(rhIL10)作用下,人重组IL6(rhIL6)诱导PBMNC的促凝活性(procoagulantactivity,PCA)、TF表达及活性的改变。结果表明:rhIL6培养PBMNC的PCA、TF表达及活性均较对照组显著增加(P<0.01);不同浓度的rhIL10作用PBMNC后,可对PBMNC的PCA、TF表达和活性起不同的抑制作用;在500ng/LrhIL10的作用下,rhIL6诱导的PBMNC的PCA、TF表达和活性均显著降低(P<0.01)。结论:IL10对PBMNC的TF表达和活性抑制可能是ACS重要保护机制,炎症因子和抗炎因子的平衡失调可能是冠状动脉血栓形成的重要因素。     

白介素12降低白血病和骨髓增生异常综合征患者外周血单个核细胞WT1基因的表达

有研究证实,白细胞介素12（IL-12）可以增强自然杀伤细胞的细胞毒性,还可以促进细胞毒T细胞对原代白血病细胞及白血病细胞株的细胞毒反应.此外,Wilms癌基因WT1 mRNA作为微小残留病变的标志已被广泛用于监测急性白血病（AL）和骨髓增生异常综合征（MDS）的疗效.为了研究IL-12能否降低AL和MDS患者外周血单个核细胞WT1基因的表达,分别收集了30例恶性血液病患者和5例健康志愿者的外周血单个核细胞（PBMNC）进行体外培养,在培养体系中加入IL-12.培养前和培养后第3天,用竞争性RT-PCR方法分别测定各标本中WT1 mRNA的表达量.结果显示,在6例慢性粒细胞性白血病患者,WT1 mRNA由104.8降至104.2拷贝/微克总RNA;在12例MDS患者,WT1 mRNA由105.4降至104.8拷贝/微克总RNA;在5例完全缓解期AL患者,WT1 mRNA由105.0降至104.2拷贝/微克总RNA;但在7例未缓解的AL患者,WT1 mRNA的表达无变化.结论：IL-12可以显著降低大部分恶性血液病患者WT1 mRNA的表达水平,IL-12有望用于去除恶性血液病患者体内的微小残留病变.     

隐球菌脑膜炎患者外周血单个核细胞中microRNA-31表达及相关免疫分子水平研究

目的 探讨隐球菌脑膜炎患者外周血单个核细胞中micorRNA-31表达情况及与疾病的相关性.方法 收集2007年9月-2012年8月期间,在上海长海医院和上海长征医院确诊的隐球菌脑膜炎患者和同期健康对照各30例,使用密度梯度离心法,分离30例隐球菌脑膜炎患者和30例健康对照外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）,采用实时荧光定量PCR检测microRNA-31（miR-31）的表达,并分析其与患者临床特征（血清中IgG,IgA,IgM）和细胞因子（IL-4,IL-10,IFN-γ,TNF-α）的相关性.结果 与健康对照相比,隐球菌脑膜炎患者PBMCs中miR-31表达（0.856±0.231 vs 0.470±0.242）增高,差异有统计学意义（t=6.320,P＜0.001）且与血清IL-4水平正相关（r=0.644,P＜0.001）,与IgG,IFN-γ负相关（r=0.645, 0.671;P值均＜0.001）.结论 提示miR-31可能通过调节炎症性细胞因子的产生,参与了隐球菌脑膜炎的发病机制,这为进一步研究隐球菌脑膜炎患者的表观遗传学调控提供了新的线索.     

福莫妥罗、孟鲁斯特和扎鲁斯特对哮喘患者外周血单核细胞分泌活性的影响

目的：通过体外培养的方式。观察长效β2-受体激动剂福莫妥罗（formoterol)，白三烯受体拮抗剂盂鲁斯特（montelukast)和扎鲁斯特（zafirlukast)3种药物对哮喘患外周血单个核细胞（PMBC）分泌白介素-4（IL-4），白介素-5（IL-5）的影响。方法：哮喘患26例。正常对照组10名，分离受试对象之外周血单个核细胞并接种于细胞培养板。药物孔相应加入montelukast,zafirlukast或formoterol预培养2h后，所有培养孔加植物血凝素（PHA）刺激培养48h，收集上清液，用ELISA法测定培养上清液中IL-4，IL-5的浓度并进行相应的统计学处理。结果：（1）哮喘组PBMC单纯经PHA刺激后，平均IL-4，IL-5的分泌水平高于健康组。（2）Montelukast,zafirlukast可导致哮喘组IL-5分泌下降，且有统计学意义。结论：Montelukast和zafirlukast均能抑制IL-5的分泌，前还可能对IL-4的分泌也具有抑制作用，因而有利于纠正哮喘患Th1/Th2的不平衡，本研究未见formotrol对IL-4，IL-5的分泌有影响。     

TRAIL在原发免疫性血小板减少症患者外周血单个核细胞中的表达及临床意义

目的：探讨原发免疫性血小板减少症（primary immune thrombocytopenia,ITP）中TRAIL的表达及其在发病机制中的作用。方法使用Ficoll密度梯度离心法,收集28例ITP患者和30例健康对照的外周血单个核细胞（PBMC）。采用实时荧光定量PCR检测TRAIL基因的表达,采用 ELISA方法检测血清中细胞因子TNF-α,IFN-γ,IL-4和 IL-10的量,并分析TRAIL与患者TNF-α,INF-γ,IL-10和血小板计数的相关性。结果与健康对照组相比,ITP患者 PBMC中 TRAIL表达显著增高（2.80±0.43 vs 1.00±0.24,t＝19.72,P＜0.001）。与健康对照组相比,ITP患者血清中IFN-γ和TNF-α升高（52.43±11.04 pg/ml vs 23.26±8.15 pg/ml;69.14±10.89 pg/ml vs 36.14±13.17 pg/ml,t＝10.36～11.50,P值均＜0.001）,IL-10降低（11.18±6.13 pg/ml vs 33.28±9.85 pg/ml,t＝10.17,P＜0.001）,IL-4的变化差异无统计学意义（35.75±12.52 pg/ml vs 40.16±14.26 pg/ml,t＝1.25,P＞0.05）。且ITP患者TRAIL的表达与血清中IFN-γ,TNF-α正相关（r＝0.432,0.541,P 值均＜0.05）,与 IL-10,血小板计数负相关（r＝-0.424,-0.553,P 值均＜0.05）。结论TRAIL可能通过介导细胞因子免疫紊乱,参与了 ITP的发生与发展,这为进一步研究 ITP的免疫干预治疗提供了新的线索和思路。     

Ag85B/IL-2融合蛋白在体外对PBMC增殖及Th1型细胞因子分泌的影响

[目的]研究Ag85B/IL-2融合蛋白对人外周血单个核细胞（PBMC）增殖及Th1型细胞因子分泌的影响.[方法]MTT法测定不同浓度的Ag85B/IL-2融合蛋白在不同时相对人PBMC的增殖活性,ELISA法检测Ag85B/IL-2融合蛋白作用人PBMC不同时间后IL-12和IFN-γ的分泌水平,并与Ag85B和BCG作对比.[结果]以0.8 μg/ml Ag85B/IL-2融合蛋白刺激组的人PBMC增殖活性为最强,此组在各时段均显著高于空白对照组（P〈0.01,P〈0.05）;各浓度Ag85B/IL-2融合蛋白刺激48 h后的IL-12水平均显著高于空白对照组（P〈0.01,P〈0.05）,以0.8 μg/ml的浓度刺激PBMC 72 h时,IL-12的分泌达最高;0.8 μg/ml和1.6 μg/ml刺激组的IFN-γ浓度在各个时相点均显著高于空白对照组（P〈0.01,P〈0.05）.Ag85B/IL-2融合蛋白刺激PBMC 分泌IL-12和IFN-γ的作用,均显著强于Ag85B和BCG（P〈0.01）.[结论]Ag85B/IL-2融合蛋白具有促人PBMC增殖和Th1型细胞因子分泌的作用.