人心肌肌钙蛋白T胶体金免疫层析法的建立

目的 建立一种简便,快速,准确检测人心肌肌钙蛋白Ｔ（ｃＴｎＴ）的胶体金免疫层析法（ＧＩＣＡ）。方法 制备的胶体金标记抗ｃＴｎＴ单克隆抗体３Ｆ７,生物素标记另一株抗体２Ｈ８,链霉亲和素结合于硝酸纤维素膜上,制成免疫层析试纸条,血清中ｃＴｎＴ与测试条两种抗体结合后,沿硝酸纤维素膜移动,与链霉亲和素交联形成肉眼可见的红色线条。结果 测试条灵敏度可达０．５ｎｇ／ｍｌ。检测３０例急性心肌梗塞（ＡＭＩ）患者血     

人心肌肌钙蛋白T单克隆抗体的研制及鉴定

以人心肌肌钙蛋白Ｔ（ｃＴｎＴ）为抗原，采用脾内免疫法，免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，取其脾淋巴细胞与小鼠Ｓｐ２／０细胞融合，经间接ＥＬＩＳＡ法筛选，三次克隆化后获得５株能稳定分泌抗ｃＴｎＴ单克隆抗体（ＭｃＡｂ）的杂交瘤细胞Ｇ３、Ｇ８、Ｇ１０、Ａ５和Ａ７。免疫球蛋白亚类鉴定其中１株为ＩｇＧ２ａ，４株为ＩｇＭ。染色体数目９２～１１０条。将Ｇ３、Ｇ８、Ｇ１０、Ａ５的单克隆抗体腹水做１：１００稀释与ＬＤＨ、ＣＫ、ＣＫＭＢ和ＧＯＴ等心肌酶均无交叉反应。５株ＭｃＡｂ的腹水效价为３．２×１０－６～１．６×１０－７。ＭｃＡｂ相加试验表明，Ａ５和Ｇ３可识别不同的抗原表位。     

人心肌肌钙蛋白Ⅰ酶促化学发光免疫分析方法的建立

目的 建立检测人心肌肌钙蛋白Ⅰ的酶促化学发光免疫分析方法.方法 采用两株抗人心肌肌钙蛋白Ⅰ的单克隆抗体,一株包被聚苯乙烯化学发光板,一株标记辣根过氧化物酶,采用辣根过氧化物酶/鲁米诺/过硼酸钠体系,建立了测定人血清心肌肌钙蛋白Ⅰ的酶促化学发光免疫分析方法,并进行了方法学鉴定.用该法测定80例正常人血清,确定正常参考值范围;测定临床病理样品27例,与Beckman全自动化学发光试剂测定值进行相关性分析.结果 本方法测定范围0.3 ～ 100μg/L,分析灵敏度0.16μg/L;37℃反应时间30min;回收率76.8％ ～ 111.1％;高浓度cTnI血清样品经系列倍比稀释后测定,测定值与稀释度呈线性相关,相关系数0.999;批内、批间变异系数分别为3.90％～6.71％,7.66％～10.34％;与心肌肌钙蛋白T(cTnT)、肌钙蛋白C(TnC)、骨骼肌肌钙蛋白Ⅰ(sKTnI)、骨骼肌肌钙蛋白T(sKTnT)、人心肌脂肪酸结合蛋白(h-FABP)、人心肌肌酸激酶(CK-MB)、人心肌肌红蛋白、C-反应蛋白(CRP)均无交叉;确定临床正常参考值小于0.304μg/L;与Beckman全自动化学发光试剂比较,两者测定值线性相关系数为0.925.结论 该方法反应时间短、特异性强、重复性好,具有应用及推广价值.     

人胚胎型心肌肌钙蛋白T1基因的克隆及表达

目的 构建人胚胎型心肌肌钙蛋白Ｔ１（ｃＴｎＴ１）中表达载体。方法 应用ＰＴ－ＰＣＲ技术，从人胚胎心肌组织中扩增ｃＴｎＴ１基因，连接ｐＥｘＳｅｃＩ高效表达载体进行诱导表达。结果 成功地扩增出ｃＴｎＴ１基因片段（７６４ ｂｐ）并测序证实；构建了表达载体ｐＥｘＳｃｅＩ－ｃＴｎＴ１，并获得表达。结论 获得单一亚型ｃＴｎＴ１的表达，为研究心力衰竭时的胚胎型基因重构与发病机制的关系打下了基础。     

抗人心肌肌钙蛋白I单克隆抗体制备中免疫抗原的选取

目的 获得与人骨骼肌肌钙蛋白Ⅰ没有交叉反应的抗人心肌肌钙蛋白Ⅰ(HcTnⅠ)特殊位点的单克隆抗体。方法 选择了包括牛心肌肌钙蛋白Ⅰ(BcTnⅠ)、根据HcTnⅠ氨基酸序列的亲水性设计的4个钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)偶联肽段和一个八倍体多肽分子(MAP)等6种代用抗原，通过免疫、杂交和筛选，获得了能分泌抗(HcTnⅠ)的IgG型抗体的杂交瘤细胞株，并对得到的抗体进行了特异性鉴定。结果 用其中4种抗原免疫得到了抗HcTnⅠ的IgG型单抗的细胞株，其中的3种合成肽可以得到分泌抗HcTnⅠ特殊位点的IgG型单抗细胞株。结论 为临床上检测cTnⅠ以诊断急性心肌梗塞，提供了可能抗体。     

抗人心肌肌钙蛋白Ⅰ单克隆抗体制备中免疫抗原的选取

目的　获得与人骨骼肌肌钙蛋白Ⅰ没有交叉反应的抗人心肌肌钙蛋白Ⅰ (HcTnⅠ )特殊位点的单克隆抗体。方法　选择了包括牛心肌肌钙蛋白Ⅰ (BcTnⅠ )、根据HcTnⅠ氨基酸序列的亲水性设计的 4个钥孔虫戚血蓝蛋白 (KLH)偶联肽段和一个八倍体多肽分子 (MAP)等 6种代用抗原 ,通过免疫、杂交和筛选 ,获得了能分泌抗 (HcTnⅠ )的IgG型抗体的杂交瘤细胞株 ,并对得到的抗体进行了特异性鉴定。结果　用其中 4种抗原免疫得到了抗HcTnⅠ的IgG型单抗的细胞株 ,其中的 3种合成肽可以得到分泌抗HcTnⅠ特殊位点的IgG型单抗细胞株。结论　为临床上检测cTnⅠ以诊断急性心肌梗塞 ,提供了可能抗体     

人心肌肌钙蛋白Ⅰ胶体金免疫层析试纸条的研制

目的建立一种简便实用胶体金免疫层析检测方法．用于人心肌肌钙蛋白I（cTnI）的快速检测。方法采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金,以鼠源抗cTnI单克隆抗体进行胶体金标记,以兔源抗cTnI多克隆抗体固定于硝酸纤维素膜作为捕获抗体,采用免疫层析技术制备快速检测cThI胶体金免疫层析检测试纸条。并与国外生产的胶体金试剂盒作对比。结果该试纸条检测范围质量浓度为5ng／mL～1μg／mL;灵敏度质量浓度为5ng／mL：特异性：与肌红蛋白、肌酸磷酸激酶同工酶、cTnT、cTnC无交叉反应：与国外胶体金试纸条检测结果比较阳性符合率为96．4％,阴性符合率为100．0％。结论成功建立cTnI胶体金免疫层析检测方法,该方法灵敏度高,特异性强,检测速度快,适于急性心肌梗死的早期诊断及科研工作需要．     

不完全弗氏佐剂诱导的髓样细胞抑制T细胞活性

目的:在肿瘤免疫治疗方法中,肿瘤疫苗前景广阔。在设计肿瘤疫苗时,由于许多肿瘤抗原的免疫原性弱,必须加入一些佐剂才能诱导出机体免疫应答。不完全弗氏佐剂(IFA)是目前肿瘤疫苗研究动物实验中最常用的佐剂之一,已知它能够有效诱导产生高滴度抗体。然而,实验发现,应用含有弗氏佐剂的肿瘤疫苗治疗肿瘤时并未出现期望的结果,原因仍不清楚。方法:BALB/c小鼠接受单次剂量的IFA注射,观察脾脏中CD11b+细胞的比例。使用MTT法检测CD11b+细胞对T细胞增殖的影响和γ干扰素(IFN-γ)分泌能力的影响。结果:IFA可诱导机体产生一群CD11b+细胞,其能抑制T细胞的增殖和IFN-γ分泌。结论:CD11b+细胞可能是导致含有IFA肿瘤疫苗临床效果不佳的原因之一,佐剂的选择会影响肿瘤疫苗的疗效。     

5-氮杂胞苷诱导骨髓源性心肌干细胞向心肌分化过程中心肌肌钙蛋白T的表达变化

目的研究5-氮杂胞苷诱导骨髓源性心肌干细胞(MCSC)向心肌分化过程中,心肌肌钙蛋白T(cTnT)的表达变化和超微结构。方法从SD大鼠骨髓间充质干细胞(MMSC)中筛选MCSC,用5-氮杂胞苷诱导向心肌定向分化。取分化后不同时间的细胞作cTnT免疫细胞化学染色,并对结果进行图像分析。透射电镜下观察分化细胞的超微结构。取不同发育期和成熟期的SD大鼠心肌作对比研究。结果用5-氮杂胞苷诱导后2周,细胞内开始表达cTnT;诱导后3周,cTnT表达增强,可见横纹样结构;诱导后4周,cTnT表达明显增强,横纹增多,但排列不规则。诱导后4周的细胞内出现心房粒,可见丰富的粗面内质网和糖原。胚胎11d大鼠的心肌内,横纹样结构较少且排列不规则。新生大鼠心肌内横纹增多,排列较规则。1月龄和3月龄心肌的横纹样结构发达,排列规则。诱导分化后4周的细胞cTnT表达特征与胚胎11d的心肌相似。结论MCSC经5-氮杂胞苷诱导后可分化为心肌细胞,表现为未成熟心肌的结构和功能特征。     

不同佐剂及免疫途径对重组NTHi外膜蛋白P6免疫效果影响的研究

目的 研究几种佐剂及免疫途径对重组NTHi P6蛋白抗原在小鼠体内产生的免疫效果的影响.方法 以A1(OH),佐剂、CpG ODN佐剂以及两种联合的复合佐剂分别与rP6蛋白混合,经滴鼻、肌肉注射免疫途径免疫6周龄雌性BALB/c小鼠;相同剂量、免疫途径加强免疫2次.采用ELISA法检测rP6蛋白特异的血清IgG和黏膜IgA滴度;酶联免疫斑点试验(ELISPOT)检测特异性T淋巴细胞的活化.结果 3次免疫后,CpG ODN+rP6滴鼻免疫组和A1(OH)3+CpG ODN+rP6肌肉注射免疫组产生高滴度的特异性血清IgG抗体(F=41.259,P=0.000).同时ELISPOT试验显示,CpG ODN+rP6无论通过滴鼻还是肌肉注射免疫均能诱导大量抗原特异性T淋巴细胞的活化,与其他实验组比较差异有统计学意义(F=66.046,P=0.000).而且CpG ODN+rP6滴鼻免疫组能诱发高滴度的特异性黏膜IgA抗体(F=70.966,P=0.000).结论 重组NTHi外膜蛋白P6与CpG ODN佐剂联合后经黏膜途径免疫,小但能保证体液免疫的高滴度血清IgG抗体,而且能从黏膜免疫和细胞免疫两方面对该蛋白的免疫效果进行增强.

Abstract：

Objective To detect the difference of cytokines and antibodies productions by immunologic system from mice vaccinated with recombinant P6 protein with different immunization routes and adiuvants.Methods 6 weeks female BALB/c mice were vaccinated with meombinant protein P6 combined with A1(OH)3,CpG ODN or the mix of them through intramuscular and intranasal.The mice were boosted twice with the same dose by the same route.Serum and respiratory tract specimen were collected to detect rP6 specific antibodies by ELISA.Results In the 6th week after immunization.The higher titer of serum rP6 specific IgG antibody were detected from the two groups vaccinated with A1(OH)3+CpG ODN+rP6 by intramuscular and vaccinated with CpG ODN+rP6 by intranasal(F=41.259.P=0.000).The ELISPOT experiment showed that,Inoculation with the CpG ODN+rP6 either by intranasal or intramuscular immunization could induce a large number of antigen-specific T lymphocyte activation.In addition.The mice vaccinated with the CpG ODN+rP6 through intranasal can be detected high titer rP6 specific mucosal IgA antibody(F=70.966.P=0.000).Conclusion Inoculation with the CoG ODN+rP6 by jntranasal immunization not only can induce high-titer serum IgG antibody,but also can induce high-titer mucosal IsA antibody and CD4+Th1.CD8+T lymphoeyte activation.     

CpG ODN佐剂促进HBsAg疫苗诱导小鼠细胞免疫应答的探讨

目的 探讨cpG ODN对重组乙型肝炎表面抗原（HBsAg）诱导小鼠细胞免疫应答的影响。方法HBsAg和HBsAg＋CpG ODN分别肌肉注射免疫Balb／c小鼠后,从淋巴组织（脾和淋巴结）和非淋巴组织（肺）分离淋巴细胞,体外经HBsAg抗原刺激后,利用ELISA检测细胞培养液中IFN-γ的水平,再利用流式细胞仪在单个细胞水平上检测IFN-γ^＋细胞的频率,分析IFN-7^＋细胞亚群。结果对照组和HBsAg免疫组IFN-γ产生的水平很低,当HBsAg加强免疫1～2次后,IFN-γ表达仍然没有明显升高;而CpG ODN＋HBsAg免疫1次或加强免疫后,CpG显著促进HBsAg诱导的IFN-γ产生。进一研究结果表明CpG促进HBsAg诱导淋巴器官和非淋巴器官内CD4^＋和CD8^＋T细胞IFN-γ的表达。结论CpG免疫佐剂不仅能诱导细胞免疫应答同时也诱导体液免疫应答,提示CpG ODN可以用于HBsAg预防和治疗性佐剂。     

CpG ODN对rHBsAg免疫小鼠脾细胞周期与凋亡的影响

目的：研究合成含CpG基序的寡脱氧核苷酸（CpGODN）对重组乙型肝炎表面抗原（rHBsAg）免疫小鼠脾淋巴细胞细胞周期及细胞凋亡的效应。方法：采用BALB／c小鼠作为免疫实验动物，经后腿胫骨前肌免疫两次，FACS法检测脾细胞的细胞周期与细胞凋亡。结果：FACS检测结果显示，加CpGODN各组与不加CpGODN相应组比较，脾细胞细胞周期明显由G0／G1期向S期转化；细胞凋亡则呈现降低趋势。结论：CpGODN可以有效刺激免疫小鼠脾淋巴细胞细胞周期由G0／G1期向S期转化，并且有抑制细胞凋亡的效应。     

Enhancement of humoral immune responses to a human cytomegalovirus DNA vaccine: adjuvant effects of aluminum phosphate and CpG oligodeoxynucleotides

A human cytomegalovirus (HCMV) glycoprotein B (gpUL55) DNA vaccine has been evaluated in BALB/c mice. Intramuscular immunization of these mice with pRc/CMV2-gB resulted in the generation of high levels of gpUL55-specific antibody (geometric mean titer [GMT] 1:8900) and neutralizing antibody (GMT 1:74) after 2 booster doses given 5 and 10 weeks after primary inoculation. Emulsifying the construct with the aluminum phosphate gel adjuvant Adju-Phos before immunization enhanced gpUL55-specific antibody responses (GMT 1:17800, P = 0.04). Co-immunization with CpG oligodeoxynucleotides was shown to enhance levels of neutralizing antibodies generated by immunization of mice with a pRc/CMV2-gB/Adju-Phos emulsion (P = 0.04). The results provide a rationale for evaluating combinations of other HCMV proteins for incorporation into a multi-target DNA vaccine, and for the optimization of adjuvant usage, to elicit enhanced levels of neutralizing antibodies. 2003.     

一种C型CpGODN对柯萨奇病毒感染小鼠的作用初探

目的:研究自行设计的C型CpG ODN(D-SL01)对柯萨奇病毒感染的潜在治疗作用.方法:用柯萨奇病毒体外感染人HeLa细胞的体外模型观察CpG ODN刺激的人PBMC培养上清的抗病毒作用;利用柯萨奇病毒感染小鼠模型观察腹腔内给予CpG ODN对小鼠体重及心肌病变的影响.结果:D-SL01刺激的人PBMC培养上清不仅能抵抗VSV感染Veto E6细胞,也能明显抵抗柯萨奇病毒对HeLa细胞的感染,其作用强度与A-型CpG ODN 2216相似.然而,当腹腔内连续给药6 d后,D-SL01使柯萨奇病毒感染小鼠的质量下降及心肌病变程度与对照组小鼠相比加重.结论:研究结果提示:体内应用CpG ODN的机制特别是用于病毒感染性疾病时,应该充分注意给药时机、途径及剂量.     

三类细菌基因组和CpG ODN作为禽流感病毒H5N1亚型灭活油乳苗佐剂的研究

目的：通过两种免疫策略比较三类细菌基因组和CpG ODN对禽流感病毒（AIV）H5N1灭活油乳苗的影响。方法：苯酚氯仿法抽提革兰氏阴性致病菌（大肠杆菌O2）、阳性致病菌（金黄色葡萄球菌）和阳性益生菌（粪链球菌FQ68）的基因组,并人工合成CpG ODN作为AIV油乳苗的佐剂,分佐剂与油苗分开和油裹于油苗内两种途径免疫鸡群,检测血凝（HI）抗体效价、HA抗原特异性IgG效价、IL-10和IFN-γ浓度。结果：当佐剂与油苗分开免疫时,各佐剂在所有的时间点上削弱（P〉0.05）或者显著地削弱（P〈0.05）HI和血清IgG效价,稍稍提高IL-10和IFN-γ浓度（P〉0.05）;当佐剂油裹于油苗里时,CpG ODN和FQ68基因组在所有的时间点上提高（P〉0.05）或者显著地提高（P〈0.05）HI和IgG效价以及IFN-γ浓度,其中CpG ODN好于FQ68基因组,但是都降低了IL-10浓度。结论：当CpG ODN或FQ68基因组油裹在AIV油乳苗里时能提高体液、Th1型免疫水平;当佐剂和油苗分开免疫时,则免疫佐剂性不佳。     

体外筛选对猪具有免疫刺激活性的CpG ODN

设计并筛选对猪具有最佳免疫刺激活性的CpGODN。文献报道 ,设计并合成了 38条CpGODN。用猪PBMC体外增殖实验 ,3 H 胸腺嘧啶 (3 H TdR )掺入法测定刺激指数 ,用SPSS软件对数值进行统计学分析 ;用双抗体夹心ELISA检测PBMC培养上清中的IFN γ和IL 2的量 ,来评价CpGODN对猪的免疫学作用。结果表明 ,多数CpGODN能够刺激猪PBMC的增殖 ,并促进其分泌IFN γ ,但IL 2分泌的量均未显著增加。其中 ,含有三个GTCGTT基序ODN 2 0 0 6刺激猪PBMC增殖的作用最强 ,刺激指数达 6 2 ,但仅能诱生低水平的IFN γ ;具有磷酸二酯键 /硫代磷酸二酯键混合骨架及 3’端polyG尾的ODND1 9具有中等程度的促猪PBMC增殖的作用 ,刺激指数为 4 2 ,但诱导PBMC分泌IFN γ比阴性对照增加了 5倍。ODND1 9和ODN 2 0 0 6对猪具有不同的免疫学效应 ,这为进一步研究适用于不同病原体的猪用疫苗佐剂提供了实验参考     

新型CpGODN对乙型肝炎病毒复制的抑制作用

目的:探讨我室自行设计的CpG ODN(CpG BW001)在体外对乙型肝炎病毒(HBV)复制的抑制作用.方法:CpG BW001刺激人外周血单个核细胞(PBMC)48小时,用VSV病毒保护实验及ELISA法检测培养上清的病毒保护能力及其中的IFN-α含量.将上述CpG BW001刺激人PBMC的上清与HepG2.2.15细胞共孵育12天后收集培养上清,用放射免疫法检测该培养上清液中HBsAg及HBeAg的含量,用点杂交法检测HBV DNA的含量.结果:CpG BW001刺激人PBMC产生以IFN-α为主的抗病毒物质;CpG BW001刺激人PBMC的培养上清作用于HepG2.2.15细胞后,HepG2.2.15细胞培养上清中HBsAg和HBeAg的含量明显减少,且细胞内HBV DNA的含量也显著降低.结论:CpG BW001能通过刺激细胞产生抗病毒物质如IFN-α等,从而在体外抑制HBsAg和HBeAg的表达及HBV的复制.     

免疫调节性寡聚脱氧核苷酸筛选方法的建立、优化和应用

目的:建立一套合理而便捷的实验体系,为开发新型免疫调节性寡聚脱氧核苷酸(ODN)提供筛选方法。方法:利用含有CpG基序的免疫刺激性寡聚脱氧核苷酸(CpG ODN)作为刺激物,将人外周血单个核细胞(PBMC)作为研究对象,分别以细胞的增殖程度和刺激上清的抗病毒活性作为检测指标,优化各项实验条件,综合评定寡聚脱氧核苷酸的免疫调节活性。结果:成功建立了由阳性免疫调节性ODNA151抑制CpG ODN诱导的人PBMC增殖及抗病毒活性的筛选方法。结论:免疫调节性ODN筛选方法的成功建立,为下一步研究开发新型免疫调节性ODN奠定了基础。     

一种B型CpG ODN对乙肝疫苗的免疫佐剂作用

目的 研究一种本室设计的B型CpG ODN(BW006)作为乙肝疫苗佐剂的可行性.方法 以琼脂糖凝胶电泳法对BW006的质量进行初步检定;H3-掺人法检测BW006对小鼠脾细胞的刺激作用;乙肝疫苗与BW006联合免疫Balb/c小鼠,并用ELISA法检测小鼠血清中的HBsAb水平.结果 BW006的纯度和完整性符合实验要求,并能显著的刺激小鼠脾细胞的增生,同乙肝疫莳联用后能够明显增强乙肝疫苗的免疫效果.结论 BW006对乙肝疫苗有较强的免疫佐剂作用.