α平滑肌肌动蛋白红色荧光蛋白报告基因载体的构建及其在细胞中的表达

目的构建α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体,为研究细胞内α-SMA的基因表达调控提供重要工具。方法克隆并构建含α-SMA启动子区的红色荧光报告质粒pDsRed-SMAp;用脂质体瞬时转染上皮细胞A549,观察α-SMA启动子对转化生长因子（TGF-β1）刺激的反应。结果酶切和DNA测序证明所构建的红色荧光蛋白报告基因载体是pDsRed-SMAp重组载体;该表达载体在上皮细胞静息状态下表达水平很低,经TGF-β1,刺激后,在荧光显微镜下可看到高亮度的红色荧光。结论成功构建了α-SMA启动子驱动的红色荧光蛋白报告质粒pDsRed-SMAp,对生理相关刺激有很好的反应,可有效地用于α-SMA基因表达调控机制的研究。     

高迁移率族蛋白1对奥沙利铂诱导的SGC-7901胃癌细胞凋亡的影响

目的 构建pDsRED2-HMGB1重组质粒,探讨转染高迁移率族蛋白1(HMGB1)基因对奥沙利铂诱导的SGC-7901细胞凋亡的影响.方法 用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增HMGB1 mRNA全编码序列,将PCR产物插入到pDsRED2-N1载体的Xho I和EcoR I位点,构建pDsRED2-HMGB1重组质粒;通过脂质体法转染SGC-7901胃癌细胞,荧光显微镜检测HMGB1红色荧光融合蛋白表达.Western blot鉴定HMGB1蛋白表达.应用流式细胞仪(Annexin-V/PI标记)分析HMGB1过表达对奥沙利铂诱导胃癌细胞凋亡的影响.结果 成功构建真核表达质粒pDsRED2-HMGB1,转染SGC-7901细胞后,荧光显微镜下可见细胞内有HMGB1红色荧光融合蛋白的表达;流式细胞术检测发现转染pDsRED2-HMGB1后SGC-7901细胞凋亡水平较转染pDsRED2-N1组下降22.4%.结论 HMGB1过表达可抑制奥沙利铂诱导的SGC-7901胃癌细胞凋亡.     

HMGB1启动子红色荧光蛋白报告基因载体的构建及在机械牵张诱导下的活性检测

目的 构建高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1 protein,HMGB1)启动子的红色荧光蛋白报告基因载体.方法 采用基因重组技术构建含HMGB1启动子区的红色荧光蛋白报告基因载体pDsRedl-1-HMGB1P.经PCR、酶切和DNA测序鉴定后,将重组载体转染HEK293细胞,在荧光显微镜下观察其在细胞内的表达以及对机械牵张刺激的反应.以转染空载体pDsRedl-1的细胞作为对照.结果 PCR、酶切和DNA测序表明重组载体pDsRedl-1-HMGB1P的构建正确,该表达载体在HEK293细胞静息状态下表达水平较低,经机械牵张刺激后,在荧光显微镜下可看到高亮度的红色荧光.转染空载体pDsRedl-1的细胞未见红色荧光.结论 成功构建了HMGB1启动子的红色荧光蛋白报告基因载体,对机械牵张刺激有很好的反应.     

HMGB1启动子荧光素酶报告基因的构建及鉴定

目的：构建高迁移率族蛋白B1（HMGB1）启动子驱动的荧光素酶报告基因的真核表达载体pGL3-HMGB1P,转染肺泡上皮细胞（A549）后检测报告基因在机械牵张刺激中的转录活性.方法：以A549细胞基因组DNA为模板,应用PCR技术扩增HMGB1启动子片段,测序正确后克隆入荧光素酶报告基因表达载体pGL3,将重组质粒pGL3-HMGB1P导入A549细胞,检测不同强度机械牵张（分别为5%和20%）刺激下荧光素酶的活性变化.结果：PCR和测序结果表明扩增的HMGB1启动子序列正确,酶切检测证实重组真核表达载体pGL3-HMGB1P构建成功.在5%牵张应变作用下,转染pGL3-HMGB1P的A549细胞荧光素酶活性是转染空载体pGL3-Basic的2.9倍（P〈0.05）;而在20%牵张应变作用下,转染pGL3-HMGB1P的A549细胞荧光素酶活性是转染空载体pGL3-Basic的6.2倍（P〈0.01）.结论：利用荧光素酶报告基因系统证实机械牵张可诱导HMGB1转录表达增加,为深入研究HMGB1转录表达的调控机制提供了基础.     

STAT1特异性siRNA真核表达载体的构建及体外转染优化

目的:构建STAT1特异性siRNA真核表达载体,并转染人气道上皮细胞(16HBE).方法:根据GeneBank数据库提供的STAT1基因两种变异体的共同核苷酸序列,按照Tuschl设计原则,选择设计双链siRNA,再转化为能表达其小发卡结构RNA(small hairpin RNA,shRNA)的DNA序列,并将其连接到带有卡那霉素抗性和增强绿包荧光蛋白的pGenesil-1.1真核表达载体上,将其转染至气道上皮(16HBE)细胞中,观察荧光表达,鉴定其转染效率.结果:通过酶切鉴定和序列测定,成功地构建了二条表达小干扰RNA的质粒及其阴性对照质粒,并成功转染到(16HBE)细胞株中,质粒/脂质体为1μg:2μl条件,能有效地转染细胞,转染效率达到50%以上.结论:成功构建siRNA真核表达载体并能成功体外转染,为下一步气道炎症性疾病的基因沉默研究奠定了良好的基础.     

Smads信号通路在转化生长因子-β1诱导气道上皮细胞转分化中的作用

目的:探讨Smads信号通路在rhTGF-β1体外诱导气道上皮细胞表型向肌成纤维细胞转分化中的作用.方法:用TGF-β1(10 μg/L)处理气道上皮细胞株16HBE,Western blot法检测刺激不同时间点细胞核蛋白内磷酸化Smad 2和Smad 3(30min、24h和48 h)的表达;脂质体法瞬时转染Smad 7表达载体pCDNA 3.0/Smad 7或空载体,转染20h后,加入TGF-β1处理,RT-PCR法检测刺激不同时间E-钙黏蛋白、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的基因表达,免疫荧光法检测α-SMA的蛋白表达. 结果:①正常对照组核内无磷酸化-Smad 2表达,Smad 3有微弱表达,TGF-β1刺激30min时表达量明显增加,随着刺激时间的延长,表达量进一步增加;②TGF-β1刺激24h,瞬时转染Smad 7组α-SMA表达量低于相应转染空载体组,E-钙黏蛋白表达量明显高于相应转染空载体组,TGF-β1刺激36h后Smad 7组α-SMA、E-钙黏蛋白表达量与相应空载体组相似;免疫荧光显示转染Smad 7组α-SMA阳性细胞数显著低于空载体组(P<0.05). 结论:Smads信号通路参与了TGF-β1诱导的支气管上皮细胞株16HBE向肌成纤维细胞转分化过程.     

PGC-1α辅助激活人PEPCK基因转录

 【目的】构建人磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)基因启动子荧光素酶报告质粒PGL3-hPCK-luc,并探讨过氧化物酶体增殖物活化受体γ辅助激活因子1α(PGC-1α)在转录因子肝细胞核因子4α(HNF4α)介导下对人PEPCK基因启动子活性的影响。【方法】从人全血基因组DNA中克隆PEPCK启动子基因片段,并重组进荧光素酶报告载体PGL3-basic,将pcDNA3.1-PGC-1α、pcDNA3.0-HNF4α表达质粒与PGL3-hPCK-luc按不同组合共转染进人肝癌细胞株HepG2细胞或正常人肝细胞株LO2细胞,培养48 h后检测细胞裂解液中荧光素酶活性。【结果】通过酶切鉴定及测序证明扩增的人PEPCK启动子片段成功插入载体质粒中。转染后人PEPCK启动子基因荧光素酶活性较空白对照组增加60倍(P < 0.05);共转染质粒进HepG2细胞或LO2细胞后,HNF4α均可以增强人PEPCK启动子基因荧光素酶活性,在HepG2细胞,荧光素酶活性是对照组的2.69倍(P < 0.05),而在LO2细胞中,荧光素酶活性是对照组的3.64倍(P < 0.05);PGC-1α可以明显增强HNF4α对人PEPCK启动子的激活作用,在HepG2细胞,荧光素酶活性是PGL3-HPCK-luc+HNF4α组的2.01倍(P < 0.05),而在LO2细胞中,荧光素酶活性是PGL3-HPCK-luc+HNF4α组的2.82倍(P < 0.05)。而与单一转染组相比,共转染pcDNA3.1-PGC-1α与pcDNA3.0-HNF4α显著增加了PEPCK的mRNA和蛋白表达水平(P < 0.05)。【结论】人PEPCK启动子基因报告质粒成功构建,且转录因子HNF4α可以激活人PEPCK启动子活性,辅助激活因子PGC-1α可以进一步加强HNF4α的作用。     

谷胱甘肽S转移酶mu5对肿瘤坏死因子α诱导人支气管上皮细胞氧化损伤的调节作用研究

目的建立肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导支气管上皮(16HBE)细胞炎症模型,探讨谷胱甘肽S转移酶mu5(GSTM5)在炎症诱导的氧化应激损伤中的作用。方法以TNF-α(10 ng/m L)刺激16HBE细胞,运用真核细胞表达载体技术,增强GSTM5基因表达,比色法检测细胞内丙二醛(MDA)及总抗氧化能力(T-AOC);MTT法检测细胞存活率;RT-PCR法检测NADPH氧化酶(NOX)家族NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5、双重氧化酶1(DUOX1)、DUOX2相关基因转录水平;蛋白质印迹法检测NOX1和NOX2蛋白表达水平。结果 TNF-α刺激16HBE细胞后,细胞内MDA水平增高,T-AOC能力减低,细胞存活率明显降低。预转染GSTM5质粒可有效降低TNF-α诱导的细胞内MDA的增高(P0.05),显著增强T-AOC能力(P0.05),同时增加16HBE细胞存活率(P0.05)。GSTM5质粒组NOX1、NOX2基因转录强度以及蛋白表达水平与TNF-α组及阴性对照组相比显著降低(P均0.05),而NOX3、NOX4、NOX5、DUOX1、DUOX2基因表达强度比较,差异无统计学意义(P均0.05)。结论增强GSTM5表达对炎症诱发的人支气管上皮细胞氧化应激损伤有保护性调节作用,其机制与下调NOX1、NOX2基因表达密切相关。     

高迁移率族蛋白B1和α平滑肌肌动蛋白在博莱霉素诱导肺纤维化中的表达

目的 检测高迁移率族蛋白B1(HMGB1)和α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)在博莱霉素(BLM)致小鼠肺纤维化模型肺内的表达水平,探讨HMGB1在肺纤维化发病机制中的作用.方法 取20只4～6周龄C57BL/6雄性小鼠,随机分为BLM组和生理盐水(NS)对照组,每组10只.分别向气管内灌注BLM(3 mg/kg)和NS,10 d后处死小鼠.应用RT-PCR法检测两组肺组织HMGB1和α-SMA的mRNA表达水平,应用免疫组织化学检测两组肺组织中HMGB1和α-SMA的蛋白表达水平.结果 RT-PCR半定量和免疫组织化学半定量分析结果显示,BLM组HMGB1的mRNA和蛋白表达均较NS对照组显著增加(0.61±0.08比0.15±0.02,13.12±1.33比7.92±1.10,P均<0.01);BLM组α-SMA的mRNA和蛋白表达均较NS对照组显著增加(0.89±0.12比0.60±0.07,13.66±1.01比8.18±1.33,P均<0.01).结论 在BLM诱导的肺纤维化中肺组织的HMGB1和α-SMA表达增加.肺纤维化病理过程可能与HMGB1表达增加并活化α-SMA的表达有关.     

Restin基因启动子的克隆及其在HeLa细胞中的转录活性

目的：扩增细胞静息因子（restin）基因启动子并构建该启动子的荧光报告系统,探讨其对全反式维甲酸（alltrans retinoic acid,ATRA）刺激的反应．方法：①对restin基因上游约2000bp基因组序列进行计算机生物信息学分析．②利用PCR技术扩增restin基因上游序列,将其克隆入pG5-luc中,插入荧光素酶报告基因上游,取代5个GAL-4结合位点及腺病毒启动子,构建Rp—luc质粒．③将构建的质粒转染入HeLa细胞,ATRA诱导检测该质粒中荧光素酶的表达．结果：酶切及测序结果均证实成功克隆了restin基因上游序列,已将该序列插入到荧光素酶基因的上游;ATRA诱导转入HeLa细胞中的真核表达载体Rp—luc,荧光素酶表达明显增加．结论：成功构建了含有restin基因启动子序列的荧光报告系统,为进一步研究restin基因功能及其转录调控奠定了基础．     

前列腺特异性膜抗原启动子调控的重组质粒的构建及表达

目的 探讨前列腺特异性膜抗原(PSMA)启动子调控目的基因表达的前列腺细胞特异性,为前列腺癌靶向性基因治疗作前期铺垫。方法 采用PCR方法从前列腺癌细胞DNA中扩增PSMA启动子序列,将其克隆到含有报告基因——增强绿色荧光蛋白(EGFP)的质粒载体,脂质体介导基因转染不同癌细胞并观察EGFP在不同细胞的表达情况。结果 成功构建质粒pEGFP-PSMAm,质粒转染结果显示PSMA表达阳性的LNeap细胞中存在GFP的有效表达。结论 PSMA启动子调控EGFP表达的重组质粒的构建证明了PSMA启动子的基因转录启动与细胞PSMA的表达相关,即具有前列腺细胞特异性。     

白血病细胞株KG1中Mxi1突变基因真核表达载体的构建

目的构建Max结合蛋白1(Max interacting protein 1,Mxi1)基因的野生型和突变型真核表达载体,观察表达载体转染真核细胞后蛋白表达的情况。方法将正常人和白血病细胞株KG1细胞的Mxi1野生型/突变型基因cDNA插入到红色荧光蛋白质粒pDs-red2-N1中,构建为pDs-red2-N1/Mxi1(野生型/突变型)真核表达载体;采用脂质体方法将质粒转染Cos-7细胞;荧光显微镜观察Cos-7细胞红色荧光蛋白表达情况。流式细胞仪方法检测红色荧光蛋白中Mix1的基因表达率,以此计算转染效率。转染后48h提取细胞总RNA,进行RT-PCR检测Mxi1基因表达。结果成功构建了一种pDs-red2-N1/Mxi1(野生型/突变型)真核表达载体。荧光显微镜下观察转染后Cos-7细胞可见红色荧光蛋白的表达;流式细胞仪检测野生型和突变型的转染效率以转染后前3d较高,并可持续至第6d。质粒转染Cos-7细胞后均出现阳性Mxi1基因转录产物。RT-PCR方法可以检测到Mxi1基因在Cos-7细胞中的表达。结论 Mxi1的真核表达载体构建成功,通过脂质体的方法转染真核细胞中并在其胞浆中表达。     

重组腺病毒Ad-sTNFRI-IgGFc转染人气道上皮细胞及其表达的实验研究

目的 构建携带人可溶性肿瘤坏死因子受体I胞外区和IgGFc融合基因的重组腺病毒载体(Ad-sTNFRI-IgGFc),体外转染正常人气道上皮细胞株(HBE135-E6E7),探讨重组腺病毒Ad-sTNFRI-IgGFc转染气道上皮治疗支气管哮喘的可行性.方法 将sTNFRI-IgGFc基因插入腺病毒穿梭质粒pDC316,与辅助质粒pBHGlox△E1,3Crc共转染HEK293细胞,重组产生Ad-sTNFRI-IgGFc,PCR鉴定毒种正确后,进行扩增、纯化和滴度测定,转染培养HBE135-E6E7,流式细胞术检测转染效率,RT-PCR、免疫组化检测转染后细胞中sTNFRI-IgGFc的表达和转录.结果 成功构建了Ad-sTNFRI-IgGFc,感染性滴度达3×1010TCID50/ml,转染后HBE135-E6E7在mRNA和蛋白水平均有sTNFRI-IgGFc表达.结论 构建的Ad-sTNFRI-IgGFc可有效转染HBE135-E6E7,并在其中高效表达,并能拈抗TNF活性,为将表达sTNFRI-IgGFc腺病毒基因治疗哮喘的实验研究提供了基础.     

反向前列腺特异性膜抗原增强子启动子调控重组质粒的构建及增强子调控活性的比较

目的 探讨前列腺特异性膜抗原（PSMA）启动子和增强子调控目的基因表达的前列腺细胞特异性,了解增强子增强转录效率的能力。方法 采用PCR方法从前列腺癌细胞DNA中分别扩增PSMA增强子序列．将其按不同方向亚克隆到含有报告基因——绿色荧光蛋白（GFP）的重组质粒载体pEGFP—PSMAPPro脂质体介导基因转染不同癌细胞并观察GFP在所转染的细胞的表达情况。结果 成功构建质粒pEGFP—PSMAE-P和pEGFP-PSMAE（r）-P,质粒转染结果显示PSMA表达阳性的LNCaP细胞中存在GFP的特异有效表达,增强子序列能使基因转录效率提高30倍,不同方向的增强子序列在增强转录效率方面具有同样效应。结论 反向PSMA增强子启动子调控GFP表达的重组质粒的构建证明该调控序列具有前列腺细胞特异性,增强子具有增强启动子转录效率的功能且没有方向性。     

丝裂原活化蛋白激酶通路对脂多糖诱导RAW264.7细胞肿瘤坏死因子α基因表达的协同调节作用

目的 探讨脂多糖（LPS）诱导RAW264.7细胞肿瘤坏死因子α(TNF-α)基因表达过程中丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路的协同调节作用及其分子机制。方法 用蛋白激酶活性测定分析LPS刺激RAW264．7细胞引起的激酶活性变化;用报告基因技术和反转录聚合酶链反应（RT－PCR）方法研究LPS诱导的TNF－α基因转录的分子机制。结果 LPS刺激RAW264．7细胞可引起细胞外信号调节激酶1（ERK1）、c-Jun氨基末端激酶1（JNK1）和p38MAPK的一过性激活,用MAPK上游激酶的活性突变体分别转染RAW264．7均可不同程度地诱导TNF－α启动子转录活性;而且,这些MAPK通路激活诱导的TNF－α启动子转录活性表现出明显的协同效应;三种MPAPK的无活性突变体均显示出对LPS刺激引起的TNF－α启动子转录激活的抑制效应;RT－PCR的结果证实,ERK、JNK和p38MAPK的特异性抑制剂对TNF－αmRNA表达具有不同程度的抑制作用。结论 LPS刺激引起的TNF－α启动子转录活性增加,可能涉及了ERK、p38和JNK三条通路的激活;这些通路通过协同效应共同发挥对TNF－α基因表达的调控。     

利用TALE-TFs在小鼠成纤维细胞中激活β-酪蛋白基因启动子表达载体

目的：利用TALE-TFs,在小鼠成纤维细胞中激活β-酪蛋白基因启动子,为检测β-酪蛋白基因启动子——目的基因表达框的表达结果,提供一种检测途径。方法：将构建的TALE-TFs和β-酪蛋白基因启动子——Red报告基因质粒电转染进入小鼠成纤维细胞,通过荧光显微镜直接观察报告基因表达情况。结果：利用TALE人工转录因子,在小鼠成纤维细胞中能够激活β-酪蛋白基因启动子表达框,为替代乳腺上皮细胞表达验证系统提供了新的途径。     

应用噬菌体展示技术筛选参与肺纤维化调控的血清反应因子结合蛋白

目的筛选上皮-间充质转化细胞中可能介导肌成纤维细胞转分化的血清反应因子(SRF)结合蛋白,探讨其作为转录激活辅助子的分子生物学机制。方法应用噬菌体展示技术,从转化生长因子β1(TGF-β1)诱导转分化的人支气管上皮细胞16HBE及亲本细胞构建cDNA噬菌体展示文库,以调控平滑肌肌动蛋白α(α-SMA)基因表达的核心转录因子SRF作为固相筛选分子对两文库进行4轮"吸附-洗脱-扩增"的生物筛选过程,噬斑PCR扩增后,对所获克隆进行DNA序列测定和生物信息学分析后进行差异比对。瞬时转染半定量分析mRNA表达。结果两文库筛选所获噬菌体经富集,随机各挑选46个克隆,序列测定后进行同源性搜索,并经过剔除对照库来源的克隆,新发现3种SRF结合蛋白:PAI-RBP1、Nucleolin和HF1OO;PAI-RBP1能促进α-SMA的表达上调。结论通过构建病理模型细胞并与噬菌体展示技术结合,以已知核心转录因子为钓饵发现未知结合蛋白,是一种发现新的转录调节子的有效策略。从转分化的细胞中发现3种新的SRF结合蛋白;对PAI-RBP1的研究初步表明PAI-RBP1参与了α-SMA基因表达的的诱导,可能在肌成纤维细胞活化过程中发挥了一定作用。     

人HMGB1真核表达载体的构建及其在单核细胞的表达

目的构建人高迁移率族蛋白1（HMGB1）表达载体,并探讨其免疫调节作用。方法从HMGB1克隆载体酶切分离HMGB1基因片段,插入增强型绿色荧光蛋白载体pCITE EGFP,菌落PCR和酶谱分析鉴定重组载体。重组表达质粒转染人单核细胞系（U937）,梯度G418筛选,荧光和Western blot检测HMGB1的表达。结果菌落PCR和酶谱分析显示目的基因被正确插入真核表达载体,获得重组质粒pCITE EGFP HMGB1,转染U937细胞随培养基中G418浓度的升高而增强,转染细胞中目的蛋白HMGB1表达量明显升高。结论成功构建重组载体pCITE EGFP HMGB1,并获得稳定表达人HMGB1的单核细胞系,为研究HMGB1对单核巨噬细胞的作用及其机制奠定基础。     

HMGB2启动子报告基因载体的构建、活性验证及与其结合的转录因子的预测

目的: 构建高迁移率族蛋白B2(high mobility group box2,HMGB2)启动子荧光素酶报告基因载体,并对其进行活性验证,预测可能与HMGB2启动子结合的转录因子。方法: 在NCBI Genbank数据库中查询HMGB2基因启动子区域序列,运用PCR扩增HMGB2启动子序列片段,将其克隆至pGL3-Basic载体中,构建重组质粒pGL3-HMGB2-promoter,并通过双酶切和测定核酸序列鉴定。采用虫荧光素酶报告实验验证pGL3-HMGB2-promoter重组质粒的活性,进一步通过在线软件PROMO预测可以与HMGB2启动子序列结合的转录因子。结果： 经限制性内切酶酶切鉴定和核酸序列比对,证实pGL3-HMGB2-promoter重组质粒构建成功。虫荧光素酶报告实验结果显示,构建的重组质粒具有启动子活性。PROMO在线软件分析结果表明,有72个转录因子可能与HMGB2启动子序列结合。 结论： 成功构建了含有HMGB2启动子序列的荧光素酶报告基因重组质粒,该质粒具有启动子活性,且有72个转录因子可能与HMGB2启动子序列结合,促进HMGB2的转录。     

电离辐射对不同启动子驱动的GFP报告基因表达的影响

目的研究电离辐射调控脂质体介导的EGR-1基因启动子、CMV启动子驱动的GFP报告基因在人肝癌7402细胞内的表达.方法利用CMV启动子、EGR-1基因启动子构建pcDNA3-CMV-GFP、pcDNA3-EGR-GFP重组质粒,经阳离子脂质体LipofectAMINE介导转染人肝癌7402细胞株,对脂质体转染条件进行优化,在最佳转染条件下,分别给予不同浓度H2O2、不同剂量γ射线处理转染细胞,用荧光显微镜、流式细胞仪(FACS)检测GFP的表达情况.结果FACS 检测显示氧自由基、电离辐射可诱导EGR-1基因启动子驱动的GFP基因表达,而不诱导CMV启动子驱动的GFP表达.结论EGR-1基因启动子具有电离辐射诱导特性.