羊膜上皮细胞的体外培养及干细胞特性研究

目的:体外分离培养人羊膜上皮细胞(hAECS)并探讨其生物学特性。方法:取足月产胎儿胎盘,无菌条件下将胎盘的羊膜层与绒毛膜层分离。将洗净的羊膜组织用眼科剪剪成约1mm×1mm大小,加入0.05%的含有0.53mMEDTA4Na的胰酶制备羊膜上皮细胞并进行培养。用免疫荧光、Westernblot等方法检测干细胞相关表面标记物(0CT-4、Nanog、SSEA-4)等的表达情况。结果:根据免疫荧光组织化学,Westernblot的结果显示,羊膜上皮细胞0CT-4、Nanog、ssea-4、Nestin表达阳性。结论:羊膜上皮细胞表达类似胚胎干细胞的表面标志物,可以作为干细胞的新来源。     

绵羊羊膜上皮细胞分离培养及鉴定

背景：目前有研究发现人羊膜和大鼠羊膜分离消化培养后,可成功获得具有干细胞特性的人羊膜上皮细胞和鼠羊膜上皮细胞,在体外一些外源因子作用下具有向三胚层细胞分化的潜能。目的：获取绵羊羊膜上皮细胞,并对其干细胞特性进行鉴定。方法：采用机械方法剥离绵羊羊膜组织,运用低速旋转TrypLE（胰酶替代物）消化法对绵羊羊膜进行分离培养获得绵羊羊膜上皮细胞。结果与结论：细胞免疫荧光检测结果表明绵羊羊膜上皮细胞表达Oct-4、SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81等胚胎干细胞标记蛋白;RT-PCR技术鉴定结果显示绵羊羊膜上皮细胞的Oct-4、Sox-2、Rex-1全能性相关基因表达,而Nanog基因不表达。检测结果提示实验成功获得具有干细胞特性的绵羊羊膜上皮细胞。     

两种人羊膜细胞的表型鉴定和分化潜能测定(英文)

本研究旨在分离、培养和表型鉴定两种人羊膜细胞并分析其多向分化潜能。羊膜中可分离出来源于外胚层的羊膜上皮细胞和来源于中胚层的羊膜间充质细胞。用流式细胞术和免疫荧光法对其进行表型鉴定,同时用免疫荧光法分析其多向分化潜能。结果表明:两种人羊膜细胞阳性表达HLA-A,B,C和间充质干细胞的标志(CD29,CD73,CD44,CD59,CD90,CD105,CH166),不表达造血干细胞的标志(CD31,CD34,CD45,HLA-DR),弱表达协同刺激分子(CD40,CD40L,CD80,CD86),且这些表型的表达量在第3-7代都维持稳定。免疫荧光法显示羊膜上皮细胞表达角蛋白19,不表达波形蛋白,而羊膜间充质细胞则相反。对其多向分化潜能测定显示,羊膜间充质细胞更好地向心肌细胞分化,而羊膜上皮细胞更好地向神经细胞分化。结论:从羊膜中可分离出羊膜上皮细胞和羊膜间充质细胞,两种细胞的表型相似,多向分化潜能却不同。羊膜上皮细胞具有更好的外胚层分化潜能,而羊膜间充质细胞更好地向中胚层分化。此结论对细胞治疗有很好的指导作用。     

人羊膜上皮细胞有向心肌样细胞分化的特性

目的:通过体外诱导分化实验,评价人羊膜上皮细胞向心肌样细胞分化的能力.方法:实验于2005-09/2006-12在贵州省细胞工程重点实验室完成.①对象:经产妇知情同意,无菌采集健康足月剖宫产胎盘6份,实验经医院医学伦理委员会批准.②实验方法:采用机械法将羊膜从胎盘组织上剥离,D-Hank's液冲洗后剪成碎片,加入含有0.2 g/L乙二胺四乙酸的0.5 g/L胰蛋白酶溶液,离心、消化、过滤,收集滤液,加入胎牛血清终止消化,重复消化2次.合并3次消化所得的细胞悬液,离心后将细胞沉淀悬浮于L-DMEM培养基中,按1.25×108 L-1密度接种,常规培养3 d后更换培养基,待细胞达80%~90%融合后用胰蛋白酶 乙二胺四乙酸联合消化,终止后离心弃上清,细胞沉淀用培养基重新悬浮,按1×107 L-1密度传代.③实验评估:用流式细胞仪鉴定人羊膜上皮细胞表型;使用10 μmol/L 5-氮杂胞苷和1 mmol/L抗坏血酸磷酸盐诱导第2代人羊膜上皮细胞,免疫荧光染色法检测诱导后细胞中特异蛋白结蛋白和α-辅肌动蛋白的表达,RT-PCR检测心肌特异性转录因子Nkx2.5、GATA-4和心肌特异性收缩蛋白α-肌球蛋白重链mRNA的表达.结果:①人羊膜上皮细胞的免疫组化特征:人羊膜上皮细胞几乎不表达CD44,不表达波形蛋白,表达角蛋白19.②人羊膜上皮细胞α-辅肌动蛋白和结蛋白的表达:人羊膜上皮细胞经诱导分化后,表达肌系细胞标志α-辅肌动蛋白和结蛋白.③人羊膜上皮细胞Nkx2.5、GATA-4和α-肌球蛋白重链mRNA的表达:人羊膜上皮细胞经诱导分化后,表达心肌特异性转录因子Nkx2.5 mRNA和GATA-4 mRNA，心肌特异的可收缩蛋白α-肌球蛋白重链mRNA未见表达.结论:通过胰蛋白酶消化法分离获得的人羊膜上皮细胞具有向心肌样细胞分化的特性,可能成为细胞心肌成形术的候选供体细胞.     

人羊膜上皮细胞的干细胞特性

背景:研究发现人羊膜上皮细胞具有类似胚胎干细胞或多能干细胞的多向分化潜能,说明其可能是未来组织工程重建的一种新型种子细胞.目的:研究体外培养的人羊膜上皮细胞的干细胞特性.方法:取足月剖宫产的人羊膜组织,经酶消化法和差异黏附法获得纯度高的人羊膜上皮细胞,接种于含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中进行原代和传代培养,用免疫荧光法和流式细胞仪检测法检测人羊膜上皮细胞表面胚胎干细胞的表面标记蛋白OCT-4和干细胞表面分子标记CD29、CD34、CD44、CD45、CD105的表达.结果与结论:人羊膜上皮细胞在体外培养条件下呈上皮细胞特有的铺路石样外观,其胞浆中有OCT-4免疫荧光表达,其干细胞标记分子CD29、CD34的表达是阳性,但干细胞标记分子CD44、CD45、CD105的表达为阴性.结果表明人羊膜上皮细胞具有干细胞的某些特性,其可能是未来组织工程重建的一种新型种子细胞.     

人羊膜上皮细胞分化为成骨细胞的特性

背景:研究发现人羊膜上皮细胞系WISH和FC植入裸鼠体内均可分化成软骨和成骨,作者检索关于足月分娩人胎膜的羊膜上皮细胞是否具有成骨特性国内外报道少见.目的:以足月分娩胎膜的人羊膜上皮细胞为前体细胞,观察其在体外定向诱导条件下分化为成骨细胞的能力.设计、时间及地点:细胞分子水平检测,于2005-09/2006-12在贵州省细胞工程重点实验室完成.材料:经产妇知情同意,无菌采集健康足月剖宫产胎盘6份,实验经医院医学伦理委员会批准.方法:采用机械法剥离胎盘羊膜组织,用胰蛋白酶消化法分离人羊膜上皮细胞,按3×108 L-1密度接种进行原代培养.取第1代人羊膜上皮细胞,设立两组:诱导组以1×108 L-1密度接种于培养皿内,24 h后更换为含体积分数为0.1的胎牛血清、 100 nmol/L地塞米松、50 mg/L抗坏血酸、5 mmol/Lβ-甘油磷酸的诱导培养液.对照组换液成分为仅含体积分数为0.1的胎牛血清的LG-DMEM培养液.主要观察指标:原代细胞用流式细胞仪分析其表型,免疫细胞化学法检测细胞角蛋白19的表达.诱导后采用钙-钴法检测成骨细胞特异性碱性磷酸酶的表达,茜素红S检测钙盐沉积情况.结果:人羊膜上皮细胞表达间充质干细胞表面标志CD29、CD44和上皮细胞标志细胞角蛋白19.向成骨细胞诱导分化21 d后,人羊膜上皮细胞由圆形变成梭形、三角形,细胞胞浆内碱性磷酸酶呈阳性表达,且可见钙盐沉积.结论:源自足月分娩胎盘的人羊膜上皮细胞具有分化为成骨细胞的特性.     

羊膜上皮细胞体外培养条件的优化及其干细胞标志的表达

本研究优化人足月胎盘羊膜上皮细胞(human amniotic epithelium cells,hAEC)的体外培养方法并现察hAEC的干细胞标志的表达情况.取健康产妇足月剖宫产术后的羊膜,采用胰酶多次消化获取hAEC,分别应用10% FBS的DMEM、类似胚胎干细胞的培养条件及添加表皮细胞生长因子(epidermal growth factor,EGF)的类似胚胎干细胞的培养条件对其进行原代和传代培养,观察培养后细胞形态,并通过流式细胞术检测、细胞免疫荧光染色等方法对培养细胞的干细胞多能性标志进行鉴定.结果表明:在类似胚胎干细胞培养条件的基础上添加10 ng/ml EGF可提高hAEC原代细胞的贴壁率和增殖能力,与广泛应用的10% FBS的DMEM培养条件相比,在此培养条件下细胞传代能力显著增强,传至5代仍保持上皮细胞表型,细胞形态在传代过程中改变不明显,并且表达胚胎干细胞全能性的表面标志SSEA-4同时细胞免疫荧光染色显示培养后的hAEC表达波形蛋白(vimentin).结论:采用类似胚胎干细胞的培养条件有利于hAEC在体外的扩增和传代,EGF对其增殖和传代有促进作用,培养的hAEC表达胚胎干细胞多能性标志.     

人羊膜上皮细胞的干细胞特性

背景：研究发现人羊膜上皮细胞具有类似胚胎干细胞或多能干细胞的多向分化潜能,说明其可能是未来组织工程重建的一种新型种子细胞。目的：研究体外培养的人羊膜上皮细胞的干细胞特性。方法：取足月剖宫产的人羊膜组织,经酶消化法和差异黏附法获得纯度高的人羊膜上皮细胞,接种于含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中进行原代和传代培养,用免疫荧光法和流式细胞仪检测法检测人羊膜上皮细胞表面胚胎干细胞的表面标记蛋白OCT-4和干细胞表面分子标记CD29、CD34、CD44、CD45、CD105的表达。结果与结论：人羊膜上皮细胞在体外培养条件下呈上皮细胞特有的铺路石样外观,其胞浆中有OCT-4免疫荧光表达,其干细胞标记分子CD29、CD34的表达是阳性,但干细胞标记分子CD44、CD45、CD105的表达为阴性。结果表明人羊膜上皮细胞具有干细胞的某些特性,其可能是未来组织工程重建的一种新型种子细胞。     

人羊膜上皮细胞静脉移植治疗大鼠心肌梗死

背景：人羊膜上皮细胞在体外适当诱导条件下可分化为心肌样细胞,可望成为细胞心肌成形术的种子细胞,但在心肌梗死原位是否能分化成心肌细胞值得探讨。目的：探讨人羊膜上皮细胞移植在心肌梗死原位的分化及对心肌梗死后心室重构和心功能的影响。方法：用胰酶消化分离人羊膜上皮细胞,行流式细胞仪检测和免疫组化染色以鉴定其表型特征。结扎SD大鼠左冠状动脉前降支以建立心肌梗死模型,实验分为人羊膜上皮细胞移植组、模型组及假手术组,人羊膜上皮细胞移植组于造模后1周经舌下静脉移植Brdu标记的人羊膜上皮细胞。移植后1,4,6周采用超声心动图检查心功能变化,应用苏木精-伊红和Masson染色观察心肌重构的变化,以免疫荧光双染色法检测人羊膜上皮细胞在心肌梗死区的植活与分化。结果与结论：①所分离的人羊膜上皮细胞表达CD29、CD166、CD73和CK19,不表达CD44、CD34、CD45、CD80、CD86和HLA-DR。②人羊膜上皮细胞移植后6周,心肌梗死区仍可见Brdu标记的阳性细胞,表达心肌特异蛋白连接蛋白43、α-辅肌动蛋白和结蛋白。③移植组大鼠左心室纤维化程度明显低于模型组。④移植组大鼠射血分数、左室短轴缩短率显著高于模型组（P〈0.01）;舒张期左室前壁厚度和收缩期左室前壁厚度也显著大于模型组（P〈0.05）。提示人羊膜上皮细胞在心肌梗死原位可分化为心肌细胞,可减缓心室重构并改善心脏功能。     

人羊膜上皮细胞静脉移植治疗大鼠心肌梗死★◆

背景:人羊膜上皮细胞在体外适当诱导条件下可分化为心肌样细胞,可望成为细胞心肌成形术的种子细胞,但在心肌梗死原位是否能分化成心肌细胞值得探讨. 目的:探讨人羊膜上皮细胞移植在心肌梗死原位的分化及对心肌梗死后心室重构和心功能的影响. 方法:用胰酶消化分离人羊膜上皮细胞,行流式细胞仪检测和免疫组化染色以鉴定其表型特征.结扎 SD 大鼠左冠状动脉前降支以建立心肌梗死模型,实验分为人羊膜上皮细胞移植组、模型组及假手术组,人羊膜上皮细胞移植组于造模后1周经舌下静脉移植Brdu标记的人羊膜上皮细胞.移植后1,4,6周采用超声心动图检查心功能变化,应用苏木精-伊红和Masson染色观察心肌重构的变化,以免疫荧光双染色法检测人羊膜上皮细胞在心肌梗死区的植活与分化. 结果与结论:①所分离的人羊膜上皮细胞表达CD29、CD166、CD73和CK19,不表达CD44、CD34、CD45、CD80、CD86和HLA-DR.②人羊膜上皮细胞移植后6周,心肌梗死区仍可见Brdu标记的阳性细胞,表达心肌特异蛋白连接蛋白43、α-辅肌动蛋白和结蛋白.③移植组大鼠左心室纤维化程度明显低于模型组.④移植组大鼠射血分数、左室短轴缩短率显著高于模型组(P<0.01);舒张期左室前壁厚度和收缩期左室前壁厚度也显著大于模型组(P<0.05).提示人羊膜上皮细胞在心肌梗死原位可分化为心肌细胞,可减缓心室重构并改善心脏功能.     

大鼠羊膜上皮细胞体外诱导可分化为类神经干细胞

背景：以往研究发现修复神经损伤的细胞来源主要有许旺细胞、嗅鞘细胞、神经干细胞、激活的巨噬细胞等,但这些细胞存在着来源困难、有成瘤性、异体排斥等缺点.而羊膜上皮细胞不存在以上缺陷,且具有多向分化潜能,经诱导后可向心肌样细胞、神经干细胞、肝细胞、成骨和软骨细胞等分化.目的：体外培养大鼠羊膜上皮细胞,并诱导其向类神经干细胞方向分化.方法：取妊娠晚期大鼠,采用胰酶消化法获得羊膜上皮细胞,用无血清的神经干细胞条件培养基对细胞进行诱导分化,并用免疫细胞化学法和RT-PCR对诱导前后的细胞相关标志物进行鉴定.结果与结论：形态学观察结果显示,条件培养基诱导后的羊膜上皮细胞胞体回缩,胞核部分折光性增强,出现类似于树突及轴突样结构,这些突起可交织成网状,细胞贴壁牢靠.免疫细胞化学检测结果显示,与诱导前相比,条件培养基诱导后的羊膜上皮细胞中巢蛋白、胶质纤维酸性蛋白荧光强度较强,而特异性胚胎抗原4、波形蛋白荧光强度较弱.RT-PCR检测显示,与诱导前相比,条件培养基诱导后的羊膜上皮细胞的巢蛋白、胶质纤维酸性蛋白、微管相关蛋白 mRNA 的表达增强,而平滑肌22α、Sox-2及Nanog mRNA的表达减弱.说明体外诱导的大鼠羊膜上皮细胞可成功分化为类神经干细胞.     

羊膜上皮细胞和羊膜间充质干细胞构建组织工程皮肤

背景：由于人胎盘来源的间充质干细胞具有多方面的优点,近年来已成为干细胞研究的热点。目的：分析鉴定羊膜间充质干细胞和羊膜上皮细胞的生物学特性,探讨其作为皮肤种子细胞在三维气液培养构建组织工程皮肤中的应用情况。方法：用胰酶胶原酶多步消化法获取羊膜间充质干细胞和羊膜上皮细胞,通过流式细胞术、反转录-聚合酶链反应和免疫荧光染色技术,鉴定两种细胞的表面分子标记、干细胞特性、与皮肤角质形成细胞的相似性,并利用两种细胞为种子细胞以鼠Ⅰ型胶原为基质进行三维气液培养。结果与结论：①流式细胞术检测体外培养羊膜间充质干细胞和羊膜上皮细胞均高表达CD90、CD73、CDl05,不表达造血干细胞标志CD34以及MHC-Ⅱ类分子HLA-DR。②反转录聚合酶链反应检测到羊膜间充质干细胞表达干细胞特性基因CMCY和NANOG,羊膜上皮细胞表达干细胞特性基因CMCY和KLF4,两种细胞均有干细胞特性。③反转录-聚合酶链反应检测羊膜间充质干细胞表达皮肤角质形成细胞特性基因K19、β1-integrin、K8,羊膜上皮细胞表达K19、β1-integrin、K5、K8,免疫荧光染色见羊膜上皮细胞表达与角质形成细胞增殖相关的的特性蛋白K14,说明羊膜上皮细胞与皮肤角质形成细胞更具相似性,在特定条件下更易于分化为皮肤角质形成细胞。④利用两种细胞成功构建组织工程皮肤,苏木精-伊红染色切片显示其具有一定的皮肤结构,且羊膜上皮细胞发生了初步分化。以上结果说明羊膜间充质干细胞与羊膜上皮细胞通过三维培养构建人皮肤组织是可行的。     

兔角膜缘上皮干细胞体外扩增及生物学鉴定

背景：角膜缘干细胞体外培养的关键在于建立稳定的体外培养体系,包括角膜缘干细胞的定位、培养条件、载体选择和鉴别方法等。目的：探索兔角膜缘上皮干细胞体外扩增方法,并对其生物学特性进行鉴定。方法：采用兔角膜缘组织块培养法,以人羊膜为载体,在体外进行兔角膜缘上皮干细胞原代和传代培养。倒置显微镜观察其体外生长特征;苏木精-伊红染色以及扫描电镜观察其形态;AE5和P63单克隆抗体免疫组织化学染色鉴定其蛋白表达。结果与结论：采用组织块培养法可在体外获得角膜缘上皮干细胞,能成功传代培养且保持较高增殖潜能。培养于去上皮羊膜上的干细胞可融合成片,呈＂拉网＂现象。原代角膜缘上皮干细胞AE5单克隆抗体染色阳性率低于5%,P63染色阳性达90%;随传代次数增加AE5染色阳性率增高,P63染色阳性率降低。结果显示兔角膜缘组织块培养法可以在体外成功获得角膜缘上皮干细胞,原代和传代细胞均具有干细胞特性,以羊膜为载体培养可形成角膜移植片。     

脂肪基质细胞诱导分化为胆碱能神经元细胞

背景：脂肪基质细胞具有多向分化潜能,在特定条件下,可分化为中胚层起源组织的细胞及内、外胚层起源组织的细胞,在一定条件下可分化为胆碱能神经元。目的：探讨脂肪基质细胞的体外培养及其向胆碱能神经元细胞分化的能力。方法：取2-4周龄的SD大鼠腹股沟皮下脂肪垫,体外分离培养并传代,神经诱导培养基诱导培养后,免疫细胞学检测CD29、CD31和CD44的表达,进行表型鉴定。结果与结论：脂肪基质细胞在体外培养过程中贴壁生长,增殖能力强,其表面标记物CD29、CD44表达阳性,CD31表达阴性。经神经诱导培养基诱导培养后,分化的细胞大部分呈典型的神经元样细胞形态,巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶、微管联合蛋白2表达阳性。诱导分化后胆碱乙酰转移酶表达阳性。说明脂肪基质细胞可分化为神经元样细胞,分化后的细胞具有合成胆碱乙酰转移酶的功能。     

人脱落乳牙干细胞骨向分化相关分子Runx2的动态表达

背景：Runx2被认为是成骨基因表达的主要调节因子,是一种向成骨细胞分化的不可或缺的转移因子,在成骨细胞发育、分化、调控、骨钙化形成及骨修复过程中起着极其重要的作用。 目的：观察人脱落乳牙干细胞生物学特征,探讨乳牙干细胞骨向分化潜能,以及不同时间点成骨相关转录因子Runx2的动态表达规律。 方法：体外分离、培养人脱落乳牙干细胞。流式细胞仪检测乳牙干细胞表面标志。体外脂向诱导分化4周后进行油红O染色,检测脂滴形成情况;矿化诱导21 d进行茜素红染色,检测矿化结节形成情况。于成骨诱导的不同时间点,用RT-PCR技术检测Runx2的动态表达。 结果与结论：通过酶消化法和有限稀释法获得了乳牙干细胞,流式细胞仪检测显示CD146和STRO-1均有不同程度的表达。成脂诱导油红O染色可见橙红色阳性颗粒。矿化诱导茜素红染色呈阳性。RT-PCR技术检测Runx2在成骨诱导第0天已有表达,0-6 d成明显增强趋势,6-12 d显著下降,12-18 d表达再次上升,以后相对平稳。结果表明乳牙干细胞可体外分离、培养,表达间充质干细胞表面标志,具有成脂和成骨向分化能力。Runx2在乳牙干细胞成骨分化各阶段均有表达,早期和晚期表达上升,中期表达有下降趋势。     

H9C2细胞培养液诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化

背景：文献报道间充质干细胞经体外化学药物诱导或自体移植体内诱导或模拟心肌样微环境体外诱导等方法可不同程度的诱导心肌细胞分化,但这些方法诱导率低、操作复杂、毒副作用大。 目的：验证心肌细胞株H9C2细胞培养液对骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的诱导作用。 方法：运用全骨髓贴壁筛选法分离培养大鼠间充质干细胞,制备 H9C2细胞培养液作为诱导培养液,将间充质干细胞诱导培养1,3,5,7 d;以单独10%F12-DMEM培养液培养的H9C2细胞为阳性对照组;单独10%F12-DMEM培养液培养的间充质干细胞为阴性对照组。用免疫荧光法和western-blot检测其肌钙蛋白T、心肌细胞结蛋白的表达,用实时荧光定量检测其心肌细胞特征性基因α-肌球蛋白重链和β-肌球蛋白重链mRNA的表达。 结果与结论：H9C2细胞培养液诱导间充质干细胞培养7 d,间充质干细胞增殖分化细胞中肌钙蛋白T阳性细胞达（16±7）%,显著高于对照组（P 〈0.05）;与阴性对照组比较,western-blot检测诱导培养间充质干细胞后分化细胞肌钙蛋白T表达明显上调（P〈0.05）,结蛋白表达明显上调（P 〈0.05）;RT-PCR检测分化细胞α-肌球蛋白重链与β-肌球蛋白重链mRNA表达均上调（P 〈0.05）。结果提示H9C2细胞培养液能诱导间充质干细胞向心肌样细胞分化。     

新生小鼠海马神经干细胞体外培养条件下的增殖与分化

背景：神经干细胞移植可用于中枢神经损伤的临床治疗。目的：观察新生小鼠海马神经干细胞在体外培养条件下的增殖和分化。方法：从新生昆明小鼠海马取材,采用机械分离法对原代细胞进行无血清培养,采用机械法复合酶消化法对原代细胞进行传代,以体积分数为10%胎牛血清诱导分化。免疫荧光行巢蛋白、β-微管蛋白Ⅲ和胶质纤维酸性蛋白染色,对培养的细胞进行鉴定。CCK-8法检测神经干细胞增殖能力。结果与结论：从新生小鼠海马分离得到的细胞具有连续传代形成克隆球的能力,克隆球呈巢蛋白免疫反应阳性;加入胎牛血清可诱导分化为β-微管蛋白Ⅲ和胶质纤维酸性蛋白阳性细胞。提示实验成功建立了体外培养新生小鼠海马组织分离和培养神经干细胞的方法,培养的神经干细胞在体外培养条件下保持着自我增殖和分化的潜能。