新生SD大鼠少突胶质细胞前体细胞的培养与分化

目的 体外培养高纯度的少突胶质前体细胞（oligodendrocyte progenitor cells,OPCs）以及分化成熟的少突胶质细胞（Oligodendrocytes,OLs）.方法新生1 -2 d Sprague-Dawley（SD）大鼠的大脑皮层胶质细胞混合培养9d后采用恒温摇床振荡分离与差异贴壁方法并结合条件培养基纯化培养细胞.光学显微镜观察细胞形态;纯化培养3 d后免疫荧光染色鉴定细胞类型.结果 获得高纯度的少突胶质前体细胞以及成熟的少突胶质细胞,少突胶质前体细胞免疫荧光NG2＋A2B5双标阳性,成熟少突胶质细胞免疫荧光MBP染色阳性.结论 采用恒温摇床振荡分离与差异贴壁法并结合条件培养基可以得到高纯度的少突胶质前体细胞以及成熟少突胶质细胞.     

细菌脂多糖诱导活性小胶质细胞对少突胶质细胞前体的毒性作用

已有实验证实,脑白质病变如多发性硬化症和脑室周围白质软化等一些神经病变的发病机制,均涉及到局部小胶质细胞的激活。 目的：探讨细菌脂多糖诱导活性小胶质细胞对少突胶质细胞前体的毒性作用。 方法：取2 d龄SD大鼠脑内小胶质细胞和少突胶质细胞前体共培养,分为共培养对照组和共培养脂多糖组。对共培养细胞经脂多糖100 μg/L 诱导48 h,分别应用硝酸还原比色法检测一氧化氮含量,还原-比色法检测超氧阴离子含量,免疫细胞染色法检测过氧亚硝酸盐含量,Hochest33342/PI荧光染色法观察细胞死亡的形态学改变,以及流式细胞仪检测细胞成活率。 结果与结论：与共培养对照组比较,脂多糖诱导导致共培养细胞内一氧化氮、超氧阴离子、过氧亚硝酸盐含量均明显增加,少突胶质细胞前体的凋亡率亦显著增加。通过体外观察,确认脂多糖诱导少突胶质细胞前体的死亡通路,是由于脂多糖诱导小胶质细胞激活,导致小胶质细胞表达一氧化氮合酶和活化NADPH氧化酶,致使其产物一氧化氮和超氧阴离子大量生成,两者进一步反应生成大量的毒性因子过氧亚硝酸盐,作用于少突胶质细胞前体,从而导致少突胶质细胞前体的死亡。     

芬戈莫德调控小胶质细胞表型转化对少突胶质前体细胞的影响

目的 研究芬戈莫德(FTY720)对原代培养的小胶质细胞表型的影响及干预后的小胶质细胞对少突胶质前体细胞分化成熟的影响。方法 体外培养原代小胶质细胞及少突胶质前体细胞(OPCs),采用RT-PCR法检测FTY720干预后小胶质细胞M1及M2型指标的变化; ELISA法检测小胶质细胞上清TNF-α、TGF-β、IL-1β、IL-13分泌量的变化; 将干预后的小胶质细胞上清液加入纯化后的少突胶质前体细胞中采用Olig2与MBP共染免疫荧光染色方法观察FTY720对少突胶质前体细胞分化成熟的影响。结果 向M2型转化; FTY720干预后的小胶质细胞促进少突胶质前体细胞的分化成熟。结论 FTY720通过促进小胶质细胞向M2型转化,从而促进少突胶质前体细胞的分化。     

大鼠脊髓少突胶质前体细胞的培养与鉴定方法

目的 探讨大鼠脊髓少突胶质前体细胞（OPCs）的分离纯化及诱导分化方法.方法 取出生后3d内SD大鼠脊髓,采用0.125％胰蛋白酶消化获取原代混合胶质细胞,培养10 d左右在37℃恒温摇床采取180 r/min摇速振摇并差速贴壁40 min获得纯化的OPCs;取纯化后培养3d的OPCs免疫荧光鉴定细胞纯度或诱导分化.结果 采用胰蛋白酶消化法获取原代混合胶质细胞、振摇并差速贴壁法分离纯化能够得到纯度较高的OPCs,折光性强,呈双极或三极形态,免疫荧光染色显示95％细胞表达A2B5和NG2（OPCs标志物）,经诱导分化后表达O4及MBP（少突胶质细胞标志物）.结论 采用振摇差速贴壁法可从大鼠脊髓中分离纯化获得高纯度的OPCs,获得的OPCs体外生长稳定,经诱导可分化为成熟的少突胶质细胞.     

少突胶质细胞表观遗传学调控机制的研究进展

机体发育中少突胶质细胞谱系定型、特化、增殖、迁移、分化、成熟、髓鞘形成以及脱髓鞘疾病髓鞘重塑过程受到内外多因素的调控。近年来,表观遗传调控机制研究越来越多,包括DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA、染色质重塑等。研究表观遗传调控为髓鞘形成障碍或者髓鞘破坏性疾病,如多发性硬化、早产儿脑室周围白质损伤及脑脊髓炎等提供了潜在的治疗新靶点。本文现围绕少突胶质细胞表观遗传学调控机制的研究进展综述如下。     

少突胶质细胞的钙信号

钙是细胞内重要的第二信使,参与机体内多种生理过程,其胞内的钙信号传递依赖于胞内外的钙离子(Ca2+)浓度差,表现为胞质内钙的变化.Ca2+进入细胞内与钙的受体如钙调素(calmodulin,CaM)结合后发挥系列效应.以往认为Ca2+仅在兴奋性细胞中起传递信号作用,但近年来随着研究的深入,发现无论是兴奋性还是非兴奋性细胞,钙都作为第二信使参与信号转导及基因的表达调控.少突胶质细胞是中枢神经系统髓鞘形成细胞,被认为是中枢神经系统中一种非兴奋性细胞,其对于细胞外的刺激可表现为胞内钙浓度的变化从而调控细胞活动.     

精神分裂症与少突胶质细胞相关研究进展

本文综述了少突胶质细胞相关基因SOX10,NRG1,Nogo等对精神分裂症的影响,影像学动物学发现了少突胶质细胞与精神分裂症的关系,提出了少突胶质细胞是精神分裂症发病的关键之一,并可作为治疗靶点。     

少突胶质细胞包涵体对多系统萎缩的诊断意义

目的 观察多系统萎缩脑和脊髓内少突胶质细胞包涵体并评估其诊断意义。方法 应用Gallyas-Braak银染色法研究4例经临床和传统病理方法诊断的多系统萎缩的脑和脊髓标本，以8例运动神经元病的脑和脊髓，6例无神经系统症状和病理改变的同龄人脑标本作对照。结果 4例病例中3例的脑和脊髓白质发现少突胶质细胞包涵体，该包涵体位于少突胶质细胞胞质内，呈半月形、镰刀形、火焰形。主要分布于脑桥、小脑、苍白球－壳核、延髓白质纤维束，脊髓外侧束，且与髓鞘变性脱失的分布一致。另有1例临床缺乏植物神经症状，黑质和脊髓中间外侧柱细胞无明显病变者，其脑和脊髓白质未观察到这种包涵体。所有对照病例的脑和脊髓白质内也未发现少突胶质细胞包涵体。结论 少突胶质细胞包涵体是散发性多系统萎缩特异性较高的病理标志，提示少突胶质细胞变性可能与多系统萎缩的髓鞘脱失有关。     

少突胶质细胞在癫痫中的研究进展

癫痫是大脑神经元反复超同步异常放电引起的大脑功能障碍.国内外的研究发现,癫痫发作后存在胶质细胞增生、神经元变性、坏死及中枢神经髓鞘脱失等病理变化,而少突胶质细胞(oligodendrocytes,OLs)在以上病理过程中发挥着重要作用[1].Gary等[2]对混合大脑皮质培养的细胞进行双相脉冲电刺激后发现,轴突接触、信号传递及神经元的活性能促使OLs存活,这说明神经元的活性能成为OLs生存的条件之一.研究证明OLs的主要功能包括:(1)包绕神经纤维的轴突而形成髓鞘[3];(2)分泌神经营养因子,促进神经元和胶质细胞的存活及功能发挥[4];(3)表达抑制性蛋白,阻止神经纤维的过度生长[5].近年来,关于OLs在癫痫发病中的作用逐渐受到关注,研究发现OLs可能与癫痫发病存在一定相关性.本文复习了国内外关于OLs与癫痫发病研究的相关文献,以OLs的生物学功能在癫痫发病中发挥的作用为重点进行综述,以期为相关领域的研究者提供参考.     

少突胶质细胞与再髓鞘化

脱髓鞘疾病是目前世界范围内的一种常见的神经系统疾病,而多发性硬化中的脱髓鞘变化是其中研究比较深入的一种。与多发性硬化患者临床缓解——复发病程相对应的脱髓鞘与再髓鞘化给治疗提供了一些策略,促进脱髓鞘疾病患者的再髓鞘化。鉴于在体内存在少突胶质细胞的前体细胞池,这就对我们提出了如何诱导体内的前体细胞向少突胶质细胞的分化的问题。首先要求我们了解参与再髓鞘化过程的细胞及分子。本文对再髓鞘化过程中的重要的细胞——少突胶质细胞的生物学特性及在髓鞘化过程中的作用作一概述。     

新生大鼠螺旋神经元的培养及免疫细胞化学鉴定

目的 建立酶解分离培养新生大鼠耳蜗螺旋神经元（SGN）的方法。方法 对出生后2～5d的SD大鼠的螺旋神经元进行酶解分离与培养,用荧光倒置相差显微镜观察SGN的生长与分化过程,用免疫荧光染色法对SGN进行鉴定。结果 新生SD大鼠SGN在酶解分离、体外培养条件下,可获得良好的细胞形态及表形分化,表现出稳定的神经元可塑性。结论 酶解分离方法可获得良好状态的SGN细胞,可以满足体外多种实验需要。     

大鼠胚胎神经干细胞的培养与鉴定

目的体外培养大鼠胚胎神经干细胞(NSCs),观察其生长、增殖特点。方法取孕15d的大鼠,采用机械分离法获取海马区细胞,以106个细胞/m l的密度接种到无血清NSCs培养基中培养,分离纯化至第5代。以10%胎牛血清(FBS)和2%多聚赖氨酸诱导分化,免疫细胞化学鉴定。结果取NSCs的细胞球及诱导分化后的细胞作免疫细胞化学染色鉴定,细胞分别呈小鼠抗巢蛋白(nestin)、小鼠抗微管蛋白(-βtubu lin)、豚鼠抗胶质纤维酸性蛋白(GFAP)及小鼠抗O4免疫化学反应阳性。结论大鼠胚胎脑海马区有NSCs存在,离体培养时能分裂增殖,并能被诱导分化。     

白藜芦醇对脑创伤后小胶质细胞激活的影响

目的检测白藜芦醇治疗后大鼠脑损伤区激活小胶质细胞的形态及数量改变,以探讨白藜芦醇的脑保护机制。方法健康雄性SD大鼠75只,随机分为创伤组、对照组和治疗组,每组分伤后3、12、24、48和72h共5个时间点,各时间点每组5只动物,用改良Feeney自由落体法致伤动物。治疗组予以白藜芦醇(50mg/kg体重)腹腔注射,对照组给予等量生理盐水,创伤组未给予药物处理。分别于伤后各时间点麻醉动物,取伤区脑组织,用抗OX-42免疫组化法检测小胶质细胞变化。结果伤后早期小胶质细胞即被激活,在不同时间点小胶质细胞形态不同:正常大鼠脑内小胶质细胞处于静息状态,细胞形态不清晰;伤后3h,OX-42浅染,小胶质细胞形态可见;伤后12h,小胶质细胞反应明显,OX-42深染,细胞形态清楚;伤后24h,小胶质细胞反应达高峰,细胞形态清晰,突起上可见到小棘;48h以后,反应减弱,OX-42浅染,细胞数量减少。治疗组小胶质细胞数量明显减少(P<0.05),创伤组与对照组无明显差异(P>0.05)。结论伤后不同时间点激活小胶质细胞的形态和数目不同,白藜芦醇能抑制小胶质细胞的激活,具有脑保护作用。     

一种高产量的小胶质细胞培养及其鉴定方法

目的建立一种简易高产量的原代小胶质细胞体外纯化培养方法.方法在小胶质细胞原代培养过程中以McCarthy等的经典培养方法为基础,通过提高初次接种密度,减少细胞离心过滤过程,进行不换液的营养缺失培养等重要改进,并使用低浓度胰酶-EDTA消化法分离纯化小胶质细胞,使用MAC-1抗体免疫化学染色标记.结果取得了高纯度和高产量的小胶质细胞.结论小胶质细胞培养过程中联合使用营养缺失法和低浓度胰酶-EDTA消化法分离纯化可有效提高培养产量.     

活体取材山羊皮层组织神经干细胞的培养与鉴定

目的通过手术从活体山羊中获取小块皮层脑组织,进行体外神经干细胞（NSC）的培养与鉴定。方法选用健康成年山羊,全麻后通过手术开颅取大小约2cm×2cm×1cm皮层脑组织块,在体外用无血清培养基自然筛选法进行分离、培养得到NSC,并采用免疫荧光细胞染色法进行NSC特异性抗原巢蛋白（nestin）及多向分化潜能的鉴定。结果皮层脑组织块在体外通过无血清培养基自然筛选法培养2w后可以成功地培养得到大量细胞球,经nestin鉴定为NSC球;所得到的NSC球在体外分化后经微管相关蛋白-2（MAP2）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）及少突胶质细胞蛋白标志物1（O1）免疫荧光组化染色后确定可分化为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞。结论对活体山羊通过手术获取其少量皮层脑组织,在体外培养后可得到相当数量的NSC,有望用于自体NSC的移植治疗。     

人恶性胶质瘤细胞株U251三种克隆的分化特性和胶质瘤干细胞的初步鉴定

目的 观测U251细胞的克隆在形态和分化上的差异,鉴定含胶质瘤于细胞的克隆.方法 克隆形成实验观察U251细胞克隆的形态并分类,免疫细胞化学染色观测不同克隆GFAP和nestin的表达差异.分离低分化克隆,检测其自我更新能力、多向分化潜能及CD133表达情况.结果 U251细胞可形成紧密型、中间型和松散型三种克隆类型.紧密型克隆分化程度最低,此克隆在无血清培养基内形成神经干细胞样细胞球,具有自我更新能力、多向分化潜能,并表达CD133.结论 U251细胞的克隆在形态和分化程度上存在差异,紧密型克隆可能富含胶质瘤干细胞.     

一种连续获取大量高纯度小胶质细胞的培养方法

目的 建立一种简易、高产量高纯度的连续获得小胶质细胞的培养方法.方法 原代培养新生1～3 d Wistar大鼠大脑皮层中混合胶质细胞,第8～9天采用振摇法和玻璃吸管吹打法分离获得Yield 1小胶质细胞,按1∶2传代培养剩余贴壁的混合胶质细胞,分别继续培养10～12 d、12～14 d后应用同样方法获得Yield 2、Yield 3小胶质细胞;采用流式细胞仪分析所获小胶质细胞CD11b/c、CD45、CD80、CD86、GFAP的表达,免疫荧光染色和CCK-8法分别检测小胶质细胞CD11b/c的表达和增殖情况,应用扫描电镜观察其超微结构,应用吞噬红色乳胶微球实验评价其吞噬功能.结果 本实验所用培养方法连续稳定地获得了大量高纯度的小胶质细胞;流式细胞仪检测结果显示Yield 1与Yield 3小胶质细胞CD11b/c、CD45、CD80、CD86表达阳性;免疫荧光染色显示Yield 1、Yield 2、Yield 3小胶质细胞CD11b/c表达均阳性;CCK-8法结果显示3代小胶质细胞增殖活力相比较差异无统计学意义(P＞0.05);扫描电镜显示3代小胶质细胞形态均呈胞体饱满、胞突细长等细胞形貌特点.相同条件下Yield 1、Yield 3小胶质细胞之间吞噬功能比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 以本实验方法可以连续获得大量高纯度的小胶质细胞,且这些不同代次小胶质细胞的抗原表型、增殖活力及吞噬功能无明显差异,可为相关的实验研究提供细胞来源.

Abstract：

Objective To establish an easy culture method of successively getting high purity and yield of microglia. Methods Cortices of neonatal Wistar rats (1-3 days old) were employed in this experiment. The first-generation microglial cells were isolated from the mixed glial culture by mechanical means (gently shaking and blowing with pipette). After the mixed glial cells being passaged at a density third generations ofmicroglial cells were harvested. CD1 lb/c, CD45, CD80, CD86 and GFAP were employed as the identification markers in detecting the phenotypes and purity of different generation of microglial cells by scanning electron microscope and flow cytometry. Immunofluorescence staining and CCk8 vitality measurement were used to judge the expression of CD11b/c and detect the proliferation of microglia cells. Microglial phagocytotic function was evaluated by phagocytosis of fluorescent microspheres. Results High yield and purity of microglial cells were stably obtained in this experiment. CD11b/c, CD45, CD80 and CD86 positive expressions were noted in the first and third generations of microglial cells by flow cytometry; CD1 1b/c positive expression was noted in the first,second and third generations of microglial cells by immunofluorescence staining. No obvious differences in the 3 different generations of microglia cells were found on proliferation ability by CCk8 vitality measurement, and on morphology and phenotypes by scanning electron microscope; no obvious differences in the first and third generations of microglia cells were found on phagocytic ability (P＞0.05).Conclusion High yield and purity of microglial cells can successively obtain through the above method;no significant differences are noted among different generations of microglia cells on purity, morphology,phenotypes, proliferation activity and phagocytic ability.     

8-9个月SD大鼠小胶质细胞的纯化分离培养

目的建立培养8-9个月SD大鼠大脑皮层小胶质细胞的方法。方法以McCarthy的方法为基础,并加以改进,采用振摇结合贴壁分离法纯化小胶质细胞;CD11b免疫细胞化学染色对纯化的小胶质细胞纯度进行鉴定;相差显微镜下进行细胞形态观察和细胞计数;CCK-8比色法检测纯化的小胶质细胞在不同时间点的活力和增殖。结果培养的8-9个月SD大鼠大脑皮层小胶质细胞,纯度达到95%,培养过程中未出现明显的增殖。结论8-9个月SD大鼠大脑皮层的小胶质细胞在体外亦可成功培养,为小胶质细胞在老年疾病中的研究奠定了基础的。